1、原理 理論基礎就是基因突變，所謂突變是指由于染色體和基因本身的變化而產生的遺傳性狀的變異。主要包括染色體畸變和基因突變兩大類。誘發突變：用各種物理、化學因素人工誘發的基因突變。誘變劑：化學誘變劑、物理誘變劑、生物誘變劑基本方法：誘變 + 篩選誘變育種概述誘變劑物理誘變劑化學誘變劑生物誘變劑各種射線，如紫外線、X射線、射線、射線、射線和超聲波等乙基磺酸乙酯（EMS）、亞硝基胍、亞硝酸、氮芥等。噬菌體、轉座因子誘變育種大多死亡少數存活存活率多數未變少數突變突變率多數負變少數正變正變率多數幅度小少數幅度大高產率投產率多數不宜投產少數適宜投產出發菌株計算出誘變誘變育種基本過程出發菌株選擇制備菌懸液誘變

2、處理篩選1、誘變育種出發菌株（parent strain)的選擇用來進行誘變處理的菌株一是考慮出發菌株是否具有特定生產性狀的能力或潛力，即菌株是否具有產生特定代謝產物的催化酶系的基因。 其次 是出發菌株最好已具備一些有利的性狀，如生長速度快、營養要求低和產孢子早而多的菌株。從自然界中分離得到的野生型菌株；通過生產選育，即由自發突變經篩選得到的高產菌株；已經誘變過的菌株。菌株來源制備菌懸液待處理的菌懸液應考慮微生物的生理狀態、懸液的均一性和環境條件。 一般要求菌體處于對數生長期，并采取一定的措施促使細胞處于同步生長。 懸液的均一性可保證誘變劑與每個細胞機會均等并充分地接觸，避免出現不純的菌落，給

3、后續的篩選工作造成困難。 用玻璃珠振蕩打散細胞團，再用脫脂棉花或濾紙過濾，得到分散的菌體。 產孢子或芽孢的微生物最好采用其孢子或芽孢。 菌懸液的細胞濃度一般控制為：真菌孢子或酵母細胞106107個/ml，放線菌或細菌108個/ml。菌懸液一般用生理鹽水（0.85%NaCl）稀釋。誘變劑使用 單一誘變劑處理；復合誘變劑處理 誘變劑及誘變劑量選擇 在誘變處理前，一般應預先做誘變劑用量對菌體死亡數量的致死曲線，選擇合適的處理劑量。 不同微生物，使用的劑量不同；誘變率隨誘變劑劑量的增加而提高。但達到一定劑量后，再加大劑量反而會使突變率下降。誘變處理誘變處理誘變劑復合處理，可產生協同效應一般經誘變后，再

4、經中間培養、淘汰野生型、檢出營養缺陷型、確定生長譜等。淘汰野生型菌株的方法有：抗生素法、菌絲過濾法、差別殺菌法和饑餓法等。營養缺陷型菌株的檢出方法有：逐個測定法、夾層平板法、限量營養法和影印接種法等。突變株的篩選根據形態變異淘汰低產菌株，根據平皿反應挑取高產菌株。搖瓶篩選法瓊脂塊篩選法篩選自動化和篩選工具微型化隨機篩選理性化篩選運用遺傳學、生物化學的原理，根據產物已知的或可能的生物合成途徑、代謝調控機制和產物分子結構來進行設計和采用一些篩選方法，以打破微生物原有的代謝調控機制，獲得能大量形成產物的高產突變株。新型誘變技術低能離子素誘變激光、微波輻射誘變原生質體誘變低能離子素誘變誘變育種詳細過程

5、：誘變育種的一個中心工作是確定誘變篩選流程。出發菌種（砂土管或冷凍管）斜面或肉湯培養24 h單孢子懸液 誘變處理稀釋涂布平板挑取單菌落傳種斜面菌懸液誘變處理處理前后的孢子液或細菌懸液作活菌計數并統計其存活率觀察單菌落形態并統計其形態變異率搖瓶初篩挑出高產斜面菌種保藏（砂土管、凍干管或制備固體孢子）搖瓶復篩（復篩次數及搖瓶數以及培養基種類根據情況決定）挑出高產菌株作穩定性試驗和菌種特性考察放大試驗罐、中試考察大型投產試驗傳種斜面（或直接用固體孢子）對照組對照組營養缺陷型突變菌株的篩選：具有明顯的遺傳標記逐個檢出法 影印培養法 逐個檢出法 一般從菌落大小也可以判斷，新長出的菌落較小，即是營養缺陷型

6、 夾層培養法 影印平板（Replica plating）法是Lederberg夫婦在1952年建立抗反饋阻遏和抗反饋抑制突變菌株的篩選未突變的菌株：代謝受阻，不能合成某種產物而死亡；抗反饋調節突變株：在結構類似物存在的情況下，仍能合成末端產物形成菌落。 抗阻遏和抗反饋突變型都是由于代謝失調所造成的，在細胞中已經有大量最終代謝產物時仍然繼續不斷地合成這一產物。 選育結構類似物抗性突變株 結構類似物是指一些和細菌體內氨基酸、嘌呤、維生素等代謝產物結構相類似的物質 主要用于末端產物的積累用梯度平板法定向培育若干代謝產物的高產菌株代謝產物產生菌抗代謝物肌苷Bacillus pumilus（短小芽胞桿菌

7、）8-氮鳥嘌呤肌苷Corynebacterium sp（一種棒狀桿菌）6-硫鳥嘌呤腺嘌呤Salmonella typhimarium（鼠傷寒沙門氏菌）2，6-二氨基嘌呤煙堿酸Chlamydomonas eugametos（一種衣藻）3-乙酰吡啶色氨酸Salmonella typhi（傷寒沙門氏菌）6-甲基色氨酸甲硫氨酸Escherichia coli（大腸桿菌）乙硫氨酸酪氨酸E.coli對氟苯丙氨酸吡咯疊氮（pyrrolnitrin）Pseudomonas aureofaciens（金色假單胞菌）6-氟色氨酸亮氨酸S.typhi三氟-DL-亮氨酸雜交育種細菌的雜交育種放線菌雜交育種霉菌雜交育種

8、F+菌株 F-菌株Hfr菌株F-菌株細菌的雜交育種霉菌的雜交育種準性生殖：霉菌雜交：指通過體細胞的核融合和遺傳因子的重組，即通過準性過程而不是通過性細胞的融合。工業上遇到的霉菌大多數不產生有性孢子，沒有典型的有性過程。細胞雜交得到的分生孢子還是無性孢子，形態上無特殊變化。準性循環（體細胞雜交）的三個連續過程準性生殖：霉菌雜交：指通過體細胞的核融合和遺傳因子的重組，即通過準性過程而不是通過性細胞的融合。工業上遇到的霉菌大多數不產生有性孢子，沒有典型的有性過程。細胞雜交得到的分生孢子還是無性孢子，形態上無特殊變化。準性循環（體細胞雜交）的三個連續過程，見下 圖。青霉菌的雜交過程實際上也是青霉菌準性

9、生殖的過程菌絲聯結異核體雜合二倍體親本型分離子重組型分離子質配核配染色體交換單倍化霉菌的準性生殖遺傳標記異核體形成雜合二倍體的形成染色體交換和單倍體霉菌的體細胞雜交 準性生殖和有性生殖的相同點： 相類似遺傳現象：核融合、形成雜合二倍體、染色體再分離、同源染色體交換、出現重組體；均能導致基因重組。不同點： 有性生殖通過減數分裂，準性生殖通過體細胞交換和單倍化。 青霉素產生菌產黃青霉與灰黃霉素產生菌蕁麻青霉 雙重營養缺陷型間準性雜交青霉菌雜交育種實驗操作步驟四、原生質體融合技術原生質體：有時指去了壁的細胞，是生活細胞內全部具有生命的物質的總稱，由原生質所構成。原生質體一般由細胞膜、細胞質和細胞核三

10、部分組成，是細胞內各類代謝活動的主要場所。四、原生質體融合技術定義：將遺傳性狀不同的兩種菌(包括種間、種內及屬間)融合為一個新細胞的技術。即實現遺傳重組。 應用：選育高產菌株；產生新的產物選擇親株、原生質體的制備、原生質體的融合、原生質體再生和融合子選擇等步驟 步驟：1、可以進行種間甚至屬間雜交并形成穩定的重組體，但重組 的頻率比較低；受接合型或親株限制。1、重組頻率高于雜交育種；3、遺傳物質交換充分；4、可以與其他育種方法結合。原生質體融合育種的優點：四、原生質體融合技術一般原理和過程四、原生質體融合技術1、選擇親株 選擇遺傳性狀穩定且具有優勢互補的兩個親株 為了能明確檢測到融合子，參與融合

11、的親株一般都需要帶有可以識別的遺傳標記，如營養缺陷型或抗藥性等 2、原生質體制備 去除細胞壁是制備原生質體的關鍵 四、原生質體融合技術四、原生質體融合技術培養基中添加甘氨酸，可以使菌體較容易被酶解在菌體生長階段添加蔗糖也能提高細胞壁對溶菌酶的敏感性在菌體生長對數期加入適量青霉素，就能使細胞對溶菌酶更敏感菌齡：對數生長中期細胞的細胞壁中肽聚糖含量很低，對溶菌酶敏感。一般是將原生質體放在高滲的環境中以維持它的穩定性2、原生質體制備 四、原生質體融合技術3、原生質體融合 聚乙二醇（PEG）能有效地促進原生質體融合一般PEG的使用濃度范圍在25-40% 采用電融合儀：在高頻電場下，用直流電穿孔來進行融合4、原生質體再生 使原生質體重新長出細胞壁，恢復完整的細胞形態結構不同微生物的原生質體的最適再生條件不同，最重要的一個共同點是都需要高滲透壓。四、原生質體融合技術5、融合重組子的篩選通過兩親株遺傳標記的互補而得以識別 如兩親株的遺傳標記分別為營養缺陷型A+B-和A-B+，融合重組子應是A+B+或A-B-。經純化的親株1具有遺傳標記的親株1菌體培養酶解細胞壁原生質體1再生再生頻率測定再生菌落性狀測定經純化的親株1具有遺傳標記的親株1菌體培養酶解細胞壁原生質體2再生再生頻率測定再生菌落性狀測定融合106 106直接選擇法間接選擇法融合子雜