1、微生物根本操作技術中國工業微生物菌種保藏管理中心 CICC姚 粟.內 容微生物分類微生物接種和培育微生物的分別微生物的鑒定微生物保藏質控微生物.一、微生物分類.一、微生物分類-微生物的進化和多樣性普遍性系統發育樹,親緣關系根據rRNA序列比較來決議。G. J. Olsen and C. R. Woese, Ribosomal RNA: A key to Phylogeny in the FASEB Journal, 7:113-123,1993.一、微生物分類原核生物大小: 0.5-3 mm外形:- 球型 (Sthaphylococcus)- 棒狀(Escherichia coli)- 螺旋

2、(Rhodospirillum)生長迅速，20min至幾小時可繁衍一代可利用多種碳源 真核生物細胞器：線粒體內質網高爾基體液泡.一、微生物分類/cells/animals/images/animalcell.jpg/cells/procaryotes/images/procaryote.jpg.原核生物一、微生物分類.真核生物一、微生物分類.一、微生物分類-多相分類表征表型特征形狀特征生理和代謝特征生態特征遺傳基因型特征蛋白質比較核酸堿基組成核酸序列多相分類Polyphasic Texonomy Technology.一、微生物分類-微生物的分類等級“種是微生物分類中最根本的分類單元。“種 的

3、定義：一個種基因型種是有類似G+C組成并經過DNA雜交實驗判別由70%或更大類似性的菌株的集合。分類等級界Domain門Phylum綱Class目Order科Family屬Genus種Species.二、微生物接種和培育.二、微生物接種和培育微生物接種定義 將微生物的純種或含菌資料如水、食品、空氣、土壤、排泄物等轉移到培育基上，這個操作過程叫微生物的接種。接種工具 微生物接種技術分類斜面接種液體接種穿刺接種平板接種 .二、微生物接種和培育斜面接種左手持菌種管和斜面管，使斜面向上，并盡量放平；右手先將棉塞硅膠塞擰轉松動，再拿接種環；用右手的小指、無名指和手掌拔下棉塞并夾緊，同時將管口在火焰上灼燒

4、；接種環灼燒滅菌后插入試管內，冷卻、挑菌，轉入另一斜面底部，沿斜面劃曲線或直線。.二、微生物接種和培育.二、微生物接種和培育液體接種操作方法與斜面接種根本一致，只是將接種環送入液體培育基中時使接種環與管壁接觸的地方悄然磨擦，使菌體分散；塞上棉塞，悄然搖動均勻；假設菌種培育在液體培育基中，運用移液管或滴管接種。.二、微生物接種和培育.三、微生物接種和培育穿刺接種用接種針調取菌種后，插入深層固體培育基內不要刺究竟部，再沿原路拔出；此法用于厭氣性細菌接種，檢查細菌的運動才干。.二、微生物接種和培育.二、微生物接種和培育平板接種平板接種的目的是察看菌落形狀、分別純化菌種，以及活菌計數等；平板接斜面：平

5、板分散的單菌落接于斜面；斜面接平板：點種法、劃線法。.二、微生物接種和培育.三、微生物分別.微生物純培營養別技術純培育物是指來源于同一單細胞的細胞群體。獲得純培育物對微生物學研討至關重要。.微生物純培營養別技術涂布平板法平板劃線法平板傾注法稀釋搖管法液體培育基分別法單細胞孢子分別法選擇培育基分別法.涂布平板法1、少量樣品加到平板中央0.1mL；2、玻璃三角涂棒浸入酒精；3、沾有酒精的涂棒在火焰上灼燒后使其冷卻；4、無菌涂棒將樣品均勻涂布瓊脂培育基外表，適當條件下培育。.涂布平板法樣品需適當稀釋30-300CFU/mL.平板劃線法斜線法曲線法方格法放射法四格法.平板劃線法斜線法：用接種環以無菌操

6、作挑取菌懸液一環，先在平板培育基的一邊作第一次平行劃線3-4條，再轉動培育皿70角，并將接種環上剩余物燒掉，待冷卻后經過第一次劃線部分作第二次平行劃線，再用同法經過第二次平行劃線部分作第三次平行劃線和第四次平行劃線。曲線法：將挑取有樣品的接種環在平板培育基上作延續劃線。.平板劃線法血瓊脂平板上的金黃色葡萄球菌大的金黃色菌落.平板傾注法對起始樣品進展延續10倍稀釋，將高稀釋倍數的樣品與冷卻至適當溫度的溶化瓊脂培育基倒入無菌平皿后混合均勻，培育后獲得單菌落。培育基外表菌落為圓形，而培育基內部菌落呈豆狀或透鏡狀。.稀釋搖管法適宜厭氧菌的純培營養別無菌瓊脂培育基試管加熱使瓊脂熔化后冷卻并堅持在50左右

7、 梯度稀釋后的待分別菌株參與試管中 搖勻、冷凝在瓊脂柱外表傾倒一層滅菌液體石蠟和固體石蠟的混合物 培育后，菌落構成在瓊脂柱的中間 .液體培育基分別不能在固體培育基上生長的微生物仍需求用液體培育基分別來獲得純培育。稀釋法是液體培育基分別純化常用的方法。在同一個稀釋度的許多平行試管中，大多數普通應超越95%表現為不生長。 .單細胞孢子分別單細胞或單孢子分別法是采取顯微分別法從混雜群體中直接分別單個細胞或單個個體進展培育以獲得純培育。較大的微生物，可采用毛細管提取單個個體。個體相對較小的微生物，需采用顯微操作儀，在顯微鏡下用毛細管或顯微針、鉤、環等挑取單個微生物細胞或孢子以獲得純培育 。 單細胞分別

8、法對操作技術有比較高的要求。.選擇培育基分別選擇培育基特性促生長才干抑制才干指示鑒別才干.選擇培育基分別傳統選擇性培育基血平板：適于各類細菌的生長，普通細菌檢驗標本的分別，都應接種此平板。營養肉湯：用于標本及各類細菌的增菌巧克力血平板：其中含有V和X因子，適于接種疑有嗜血桿菌、奈瑟菌等的標本。中國藍平板或伊紅美藍平板：可抑制G+細菌，有選擇地促進G-菌生長，是較好的弱選擇性培育基。麥康凱平板：具中等強度選擇性，抑菌力略強，有較少革蘭陰性菌不生長。SS瓊脂：有較強的抑菌力，用于志賀菌和沙門菌的分別。堿性瓊脂：用于從糞便中分別霍亂弧菌及其它弧菌。.選擇培育基分別新型顯色培育基利用微生物本身代謝產生

9、的酶與相應顯色底物反響顯色的原理來檢測微生物的培育基。OrganismEnzyme Substrate Color Coliforms-galactosidaseX-GALBlue Escherichia coli-galactosidase -Glucuronidase MUGfluorescenceEscherichia coli O157-galactosidaseX-GALBlue.選擇培育基分別.基于酶與底物反響的顯色培育基技術CHROMagar.Petrifilm 3MAerobic Count Plate Coliform Count Plate Rapid Coliform C

10、ount Plate E. coli /Coliform Count Plate Enterbacteriaceae Count Plate Yeast and Mold Count Plate Staph. aureus Express Count Plate Environmental Listeria Plate 基于酶與底物反響的顯色培育基技術.四、微生物鑒定.四、微生物鑒定多相鑒定分類)polyphasic taxonomy是利用微生物從分子特性到生態特征的多種不同信息，綜合表型和基因型特征進展微生物分類鑒定的方法。.四、微生物鑒定-形狀學察看細菌酵母絲狀真菌宏觀形態（培養特征）將培

11、養物劃線或稀釋涂布，30培養1624小時，選取劃線或稀釋涂布分離得到單菌落，觀察和記錄菌落的形狀、大小、質地、邊緣、顏色、光澤、透明度、隆起等。將培養物劃線接種于葡萄糖-酵母提取物-蛋白胨固體培養基上，25培養23 d后，進行菌落形態觀察，菌落質地、菌落顏色、菌落表面是否為反光或暗淡、菌落是平伏還是隆起、菌落邊緣等。標準培養基（CA、CYA、WA）平板倒轉，向上接種三點，每個菌株接種兩個平板，倒置于25溫箱中進行培養7天。觀察菌落直徑、顏色、質地、滲出液、菌落反面顏色等特征。微觀形態（細胞特征）將培養物在30條件下培養1624小時，挑取對數期的單菌落，涂布于事先滴加少量無菌水的載玻片上，自然干

12、燥，加熱固定，進行革蘭氏染色，將制好的染色涂片在100X40倍的顯微鏡下觀察革蘭氏染色情況、菌體形狀、排列行狀、菌體大小等細胞特征。培養物劃線接種于葡萄糖-酵母提取物-蛋白胨固體培養基上，25培養23 d后，取酵母菌制作成水浸片，在顯微鏡下觀察細胞形態和無性繁殖方式等。用無菌接種針挑取少量培養物，浸入滴有一滴乳酸石炭酸棉藍染色液的載玻片上，用接種針將菌絲團分散開，蓋上蓋玻片（勿使產生氣泡），制成水浸片，顯微鏡下觀察菌體形態特征，包括分生孢子梗、分生孢梗莖、頂囊、梗基、瓶梗、產孢結構、分生孢子頭、分生孢子等。.四、微生物鑒定-形狀學察看.四、微生物鑒定-生理生化碳源和氮源運動性細胞壁組成滲透耐性

13、能源氧關系發酵產物最適pH和生長范圍一般營養類型光合作用色素最適生長溫度和范圍鹽需求及耐性發光次級代謝產物形成能量轉換機制對代謝抑制劑和抗生素的敏感性貯藏內含物.四、微生物鑒定-生理生化Division based on membrane composition:a) gram-negative have outer and inner membranes and a thin cell wall (Escherichia coli) b) gram-positive have no outer membrane, but have a thicker cell wall (Bacillus

14、subtilis)c) neither gram- nor gram+ - no cell walls (mycoplasm):85/fox/gram-st.jpg:85/fox/bact-mem.jpg.四、微生物鑒定-生理生化API (bioMerieux)(biochemical).四、微生物鑒定-生理生化BBL Crystal (Becton Dickinson)將傳統的生化反響、酶底物呈色反響與熒光加強顯色技術結合，設計鑒定反響最正確組合。六類鑒定實驗板，可鑒定500種細菌.四、微生物鑒定-化學成分分析.四、微生物鑒定-基因型分析G+Cmol% 16S rDNA, 26S rDNA

15、D1/D2, 5.8S rDNA ITS region, -tubulin gene, calmodulin gene, gyrA gene, pheS gene, recN gene, rpoB gene and other housekeeping genes.DNA Barcoding gene sequence analysis, MultiLocus Sequence Analysis (MLSA) DNA-DNA hybridizationRAPD, RFLP, AFLP, SSCP, Eric-PCR, BOX-PCR, Rep-PCR , LAMP.四、微生物鑒定-基因型分析D

16、NA 指紋圖譜分析1234Eric-PCRBOX-PCRRep-PCRSSCP ERICPCR 以細菌DNA中串聯反復序列為引物， 經過擴增細菌基因組中廣泛分布的短反復序列，在不同種屬個體間表現為在染色體上存在的位置和拷貝數不同，以電泳條帶比較分析，提示基因組間的差別，運用于菌株分型。 BOX-PCR根據BOX插入因子(大小為 154 bp, 由保守性不同的 box A(57 bp)、box B(43 bp)和 boxC(50 bp)等亞單位組成)設計引物, 擴增微生物基因組DNA 的反復性片段, 最后經瓊脂糖凝膠電泳檢測其多態性。 REP -PCR 擴增細菌基因的反復DNA 片段來獲得菌株特

17、異性遺傳圖譜, 其中反復 DN A 片段包含了一個高度保守的回文序列(REP)為 38 bp 的片段, 由1個保守回文段以及兩端分別有6 個降解位點和1 個5 bp 的可變框構成。 PCR-SSCP是聚合酶鏈式反響與單鏈 DNA 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術結合，利用不同構象單鏈 DNA 在非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中泳動速率的差別, 檢測出DNA短片段中存在的單核苷酸突變,現已廣泛運用于各種基因多態性的研討。假絲酵母PCR-SSCP 副溶血弧菌ERICPCR 沙門氏菌REP -PCR .四、微生物鑒定-鑒定實例116S rDNA序列系統發育樹infB基因序列系統發育樹.2007年 Asperg

18、illus brasiliensis sp.nov.新種發表2021年 ATCC 16404 鑒定為 Aspergillus brasiliensis sp.nov. 2021年 USP將ATCC 16404 更名 2021年 WDCM 將ATCC 16404 更名 圖：ATCC 16888和ATCC 16404的培育特征和顯微形狀anos Varga, Sandor Kocsube , Bea ta To th, et al. Aspergillus brasiliensis sp. nov., a biseriate black Aspergillus species with world

19、-wide distribution. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2007, 57: 19251932圖: Rep-PCR條碼系統發育樹(DiversiLab平臺)Figure 2: Dendrogram of Rep-PCR Barcoding (DiversiLab Platform) .注：圖片來源于Reclassification of ATCC 16404TM and ATCC 9642TM as Aspergillus brasiliensis. Pharmaceutical

20、 Microbiology Forum Newsletter, 2021, Vol. 14 (10): 2-14表 ITS序列特殊位點堿基差別Table Difference of base position in ITS sequence四、微生物鑒定-鑒定實例2.2007年 Aspergillus brasiliensis sp.nov.新種發表2021年 ATCC 16404 鑒定為 Aspergillus brasiliensis sp.nov. 2021年 USP將ATCC 16404 更名 2021年 WDCM 將ATCC 16404 更名 圖: 基于曲霉黑色組-微管蛋白基因序列的

21、N-J樹Figure : Neighbour joining tree based on -tubulin sequence data of Aspergillus section Nigri.注：圖片來源于Aspergillus brasiliensis sp. nov., a biseriate black Aspergillus species with world-wide distribution International. Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2007, 57: 19251932圖1: 基于IT

22、S DNA序列的黑色曲霉N-J樹Figure 1: A Neighbor Joining Tree of Black Aspergilli based on Their ITS DNA Sequences.注：圖片來源于Reclassification of ATCC 16404TM and ATCC 9642TM as Aspergillus brasiliensis. Pharmaceutical Microbiology Forum Newsletter, 2021, Vol. 14 (10): 2-14四、微生物鑒定-鑒定實例2.各種規范中仍將繼續采用ATCC 16404作為質控菌株。

23、各類規范中，其它被指定為參考菌株的黑曲霉菌株(CMCC(F) 98003) ,需求重新復核鑒定。黑曲霉？四、微生物鑒定-鑒定實例2.形狀學鑒定CYA培育基, 25C培育7 dBiolog鑒定生長濁度實驗ITS rDNA區序列分析ITS4: 5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3ITS5: 5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3-微管蛋白基因序列分析Bt2a: 5-GGTAACCAAATCG GTGCTGCTTTC-3Bt2b: 5-ACCCTCAGTGTAGT GACCCTTGGC-3反響體系：100 L, 10 擴增緩沖液10 L; DNA模板1 L ; dNTP (

24、每種2.5 mmol/L) 8 L; 引物(10 L/L)各2.5 L; Taq DNA聚合酶(2.5 U/L)1.3 L; 無菌超純水補足總體積100 L。反響程序：94C 5 min; 94C 1 min, 55C 1 min, 72C 1 min, 30個循環; 72C 10 min, 4C保管。四、微生物鑒定-鑒定實例2.形狀學鑒定圖 25C培育7 d菌種的宏觀形狀和顯微形狀Fig Macromorphology and micromorphology on 25C, 7 d注: A菌落形狀; B: 分生孢子梗形狀( 100); C: 分生孢子形狀( 400).Note: A: Col

25、ony morphology, B: Conidiophore morphology ( 100); C: Conidial morphology ( 400).該菌株的形狀學特征符合黑曲霉A. niger的形狀特征四、微生物鑒定-鑒定實例2.Biolog鑒定注: : 沒有生長; +: 生長旺盛; w: 微弱(邊境)生長; v: 可變.Note: : No growth; +: Strong growth; w: Weak growth; v: Varied growth.表 碳源利用情況Table Carbon Source Utilization碳源Carbon sourceATCC168

26、88Aspergillus nigerATCC16404Aspergillus brasiliensis CMCC(F)98003麥芽糖Maltose+-甲基-D-葡萄糖苷-Methyl-D-Glucoside+D-海藻糖D-Trehalose+L-蘋果酸L-Malic Acidv+-酮戊二酸-Ketoglutaric acidw苦杏仁苷Amygdalin+D-果糖D-Fructose+v+四、微生物鑒定-鑒定實例2.ITS rDNA區序列分析圖 CMCC(F)98003的ITS rDNA區序列和-微管蛋白基因序列PCR擴增結果Fig ITS rDNA and -tubulin gene PC

27、R amplification results of CMCC(F)98003注: M: DL2000 marker; 1: ITS rDNA區PCR擴增結果; 2:-微管蛋白基因PCR擴增結果.Note: M: DL2000 marker;1: ITS rDNA PCR amplification result ; 2:-tubulin gene PCR amplification result.表 ITS序列特殊位點堿基差異Table Difference of base position in ITS sequence堿基位點Base position140166172173Asperg

28、illus brasiliensis IMI 381727CCTCAspergillus niger ATCC 16888ATAACMCC(F)98003ATAA注: 以18S和ITS1區之間的TTACCG序列中的第一個“C為1位點.Note: The first C in the border sequence (TTACCG) of 18S and ITS1 is here defined as position 1.四、微生物鑒定-鑒定實例2.ITS rDNA區序列分析以18S和ITS1區之間的TTACCG序列中的第一個“C為1位點。140166172、173四、微生物鑒定-鑒定實例2.

29、ITS rDNA區序列分析圖 基于ITS區rDNA序列的黑色組曲霉的NJ系統發育樹Fig A Neighbor Joining Tree of Aspergillus section Nigri. based on Their ITS DNA Sequences注: 圖中發育樹節點只顯示Bootstrap值大于50%數值, 圖例為遺傳間隔.Note: Numbers above branches are bootstrap values. Only values above 50% are indicated. Bar, genetic distance.CMCC(F)98003與與A. ni

30、ger ATCC 16888聚類在分類間隔最近的一個分支上, 序列類似性達100% 。CMCC(F)98003與黑色組的其他種序列同源性也具有很高的類似性, 序列同源性均在98.6%100%之間。四、微生物鑒定-鑒定實例2.-微管蛋白基因序列分析圖 基于-微管蛋白基因序列的黑色組曲霉的NJ系統發育樹Fig Neighbour-joining tree based on -tubulin sequence data of Aspergillus section Nigri注: 圖中發育樹節點只顯示Bootstrap 值大于50%數值, 圖例為遺傳間隔.Note: Numbers above br

31、anches are bootstrap values. Only values above 50% are indicated. Bar, genetic distance.CMCC(F)98003與黑曲霉A. niger CBS554.65T序列同源性為100%。CMCC(F)98003與黑色組的其他種序列同源性均在94.7%以下。結合形狀學、碳源利用情況和ITS rDNA序列系統發育分析等多相鑒定的結果, 將CMCC(F)98003鑒定為黑曲霉Aspergillus niger 。四、微生物鑒定-鑒定實例2.五、微生物保藏.菌種是進展微生物學研討和運用的根本資料，是開展生物工程的重要根底

32、條件之一，是國家的重要生物資源。菌種保藏管理要求各保藏中心必需具有保藏菌種的詳細歷史及有關實驗資料。并對其所擔任保藏的菌種均應采取妥善、可靠的方法保藏，防止菌種的污染或死亡。 五、微生物保藏.制定專門菌種保藏管理制度；同一株菌種采用兩種以上保藏方法保管；對只能采用一種保藏方法的菌株備份存放于兩個以上的保藏設備中； 對菌種的入庫和出庫記錄入檔，實行雙人擔任制管理； 設專人擔任管理菌種保藏設備正常運轉，定期檢修維護。 五、微生物保藏.微生物菌種保藏方法根本原理是在挑選優良純培育物并使其處于休眠形狀根底上，人為地發明一個有利于休眠的環境，使其長期保管后仍能堅持菌種原有的優良特性。根本措施是低溫、真空

33、、枯燥。五、微生物保藏.常用菌種保藏方法定期移植法液體石蠟法真空冷凍枯燥法-80低溫凍結法液氮超低溫凍結法.定期移植法亦稱傳代培育保藏法，指將菌種接種于適宜的斜面培育基上，最適條件下培育，完成培育于46進展保管并間隔一定時間3-6個月進展移植培育的一種短期菌種保藏方法。操作步驟： 斜面制備 接種 培育 保藏. 斜面制備培育基配制分 裝滅 菌擺放斜面. 接 種.培育細菌37 ，1-2d酵母 2830，23d絲狀真菌26 ，57d保藏46保藏36個月 培育和保藏.定期移植法操作簡單，運用方便；對設備和人員要求不高；可隨時運用，便于察看菌種；任務勞動強度大，屬短期保藏，保藏本錢高；菌種傳代頻繁，易退

34、化、污染。.液體石蠟法指將菌種接種在適宜的斜面培育基上，最適條件下培育好后注入滅菌的液體石蠟，使其覆蓋整個斜面，再直立放置于低溫46枯燥處進展保管的一種菌種保藏方法。. 操作步驟：液體石蠟預處置斜面培育物制備灌 注 石 蠟保 藏優質化學純液體石蠟滅菌： 121濕熱滅菌30min，蒸發水分； 160 干熱滅菌2h；冷卻至室溫。液面高出斜面頂部1cm46 ，枯燥處；直立放置；保藏時間1 2年。.液體石蠟法操作簡單，運用比較方便；對設備要求不高，對人員操作程度有一定要求；菌種易退化、污染。.真空冷凍枯燥法指將保藏的菌種細胞或孢子懸浮于維護劑中，經預凍后在真空條件下使水分升華，再經真空封存后保管的一種

35、長期菌種保管方法。.安瓿管的預備清洗選用中性玻璃材質的安瓿管；2%鹽酸浸泡810h，自來水沖洗至中性，蒸餾水沖洗23次；置于烘箱中烘干。棉塞打棉塞，160定型2h；標簽激光打印標簽，標明菌株編號和保藏日期，大小約1020mm。噴碼于安瓿管外，160固定20min。滅菌 121 ，30min.維護劑的預備維護劑：12%脫脂牛奶蒸餾水溶液，25ml/管；滅菌鍋加熱至沸騰，將牛奶管放入鍋中，113滅菌20min；翻開放氣閥緩慢排出蒸汽，取出滅菌后脫脂牛奶試管，迅速放入涼水中冷卻；30培育2天，無菌檢查合格后備用。 .凍干樣品制備制備斜面培育物；將維護劑用無菌吸管注入到斜面培育物上，用吸管刮取斜面上的

36、菌體，使菌體均勻地懸浮在維護劑內。用長毛細滴管將菌懸液分裝到安瓿管內，0.10.2ml/管，操作時要把帶有菌懸液的長毛細滴管直接插入安瓿管的底部，勿使菌液沾在管壁上。.真空枯燥 在開動真空泵后應使真空度在15min內到達66.5Pa，隨后逐漸到達26.613.3Pa，在此條件下，樣品將堅持凍結形狀，其中水分那么不斷升華，枯燥才干順利地進展。終止枯燥時間應根據以下情況判別：安瓿管內凍干物呈酥塊狀或松散片狀真空度接近空載時的最高值樣品溫度與管外溫度接近選用12支對看管，其水份與菌懸液同量，當其水分完全蒸發時視為枯燥結束.預凍制備菌懸液、經分裝到進展預凍之間的時間不宜超越1h；分裝完成后將安瓿管立刻

37、放入3540冰箱預凍1h，使菌液完全凍結；可采用分段式預凍，先將分裝好的安瓿管置20凍30分鐘，再放入80冰箱凍30min；采用離心式凍干安裝時勿需預凍。.熔封 將安瓿管的中上部用火焰燒軟，拉成細頸；將安瓿管裝到多歧管上，用火焰在細頸處熔封；拉管時留意火焰不要離菌體太近。.真空度檢測 用高頻電火花檢查各安瓿管的真空情況，如管內呈現灰藍光，闡明真空度符合要求。.保藏 46下避光保藏，普通可保藏810年。 .真空冷凍枯燥法保藏、運輸方便；保藏時間長(5 10年)；對設備要求高(真空冷凍枯燥機、多歧管)，對人員操作程度要求高；冷凍枯燥過程對菌體有損傷，需恢復培育。.-80冰箱凍結法將菌種懸浮于維護劑

38、中，在80冰箱中凍結保管的一種長期菌種保藏方法。預備冷凍管預備維護劑 10%-15%甘油預備菌懸液細胞、孢子或芽孢懸液制備冷凍管取菌懸液和維護劑至冷凍管保藏 -80，25年.Microbank.-80冰箱凍結法運用方便；保藏時間較長；對設備要求高(-80冰箱)；運輸不方便。.液氮超低溫凍結法指懸浮于維護劑中的菌種經程控降溫后，移置于196的液氮或150左右的液氮氣相中保管的一種長期菌種保藏方法。.操作步驟冷凍管預備維護劑制備保藏培育物預備預凍 將程序降溫系統預冷到4，將制備好的冷凍管放入其中，以1/min降溫速率降至-35； 運用程序降溫盒。保藏 將預凍后的冷凍管轉移至液氮氣相(-150)或液

39、相(-196)。同“80冰箱凍結法 .液氮超低溫凍結法保藏時間長；保藏效果好，菌種不易退化；對設備要求高(程控降溫儀、液氮罐)，對人員操作程度要求高；保藏本錢高。.不同保藏方法的比較.六、質控微生物.保藏菌株要求藥品微生物檢驗用的實驗菌應來自認可的國內或國外菌種收藏機構的規范菌株，或運用與規范菌株一切相關特性等效的商業派生菌株。922021版中國藥典.國內認可的菌種收藏機構1979年7月，全國第一屆菌種保藏管理睬議正式成立中國菌種保藏管理委員會CCCCM，委員會下設7個全國性菌種保藏管理中心及機構所在地：普通微生物菌種保藏管理中心CCGMC, 中國科學院微生物研討所農業微生物菌種保藏管理中心ACCC,中國農科院區劃所工業