1、.1考馬斯亮藍法測定蘋果組織微量可溶性蛋白含量吳凡 郭夢雨摘要:本實驗以蘋果果肉為研究對象，采取考馬斯亮藍比色法測定蛋白質的吸光度值，通過對果實可溶性蛋白提取緩沖液、緩沖液濃度、pH值、外源添加物對果肉可溶性蛋白提取效率的影響的研究，優化蘋果果實可溶性蛋白含量測定方法，以期優化果實可溶性蛋白測定條件，為客觀反映果實可溶性蛋白水平提供一種可行的方法。結果說明：外源添加PVP和EDTA以是蘋果可溶性蛋白提取率的主要影響因素。實驗最終確定的提取條件為0.1mol/L pH9.0 Tris-HCl提取緩沖液(含1mmol/L EDTA和1% PVP),此條件下蘋果果實可溶性蛋白的有效測定含量為34.9

2、3%。關鍵詞：蘋果、考馬斯亮藍法、Tris-HCl緩沖液、外援添加物1 實驗局部1.1 實驗原理果蔬可溶性蛋白質含量(soluble protein content)是一個重要的生理生化指標，也是果蔬品質和營養的重要評價指標之一。許多可溶性蛋白是構成果蔬中酶的重要組成局部，參與果蔬多種生理生化代過程的調控，與果蔬的生長發育、成熟衰老，抗病性、抗逆性密切相關。考馬斯亮藍G-250在酸性游離狀態下呈棕紅色，最大光吸收在465nm，當它與蛋白質結合后變為藍色，最大光吸收在595nm。 在一定的蛋白質濃度圍，蛋白質-染料復合物在波長為595nm處的光吸收與蛋白質含量成正比，通過測定595nm處光吸收的

3、增加量可知與其結合蛋白質的量。蛋白質與考馬斯亮藍G-250結合在2min左右的時間到達平衡，完成反響十分迅速；其結合物在室溫下1h保持穩定。該法是1976年Bradford建立，試劑配制簡單，操作簡便快捷，反響非常靈敏，靈敏度高，可測定微克級蛋白質含量，測定蛋白質濃度圍為01 000g/mL，最小可測2.5g/mL蛋白質，是一種常用的微量蛋白質快速測定方法。但該方法線性圍窄，需要選擇適宜的提取緩沖液及緩沖液濃度、pH值和外源添加物等，以使測定方法有較高的靈敏度，測定值與真值相近。1.2 實驗準備1.2.1 實驗材料新鮮蘋果、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍G-250、乙醇、85%磷酸、三羥甲基氨基甲烷

4、(Tris)、HCl、乙二胺四乙酸EDTA、聚乙烯比咯烷酮(PVP)、NaCl、MgCl2 、抗壞血酸、半胱氨酸、-巰基乙醇。1.2.2 儀器與設備容量瓶25mL 10個、100mL 1個、500mL 1個、棕色瓶 1個、分析天平、膠頭滴管、燒杯50mL 2個、移液管20mL、量筒10mL 1個 、25mL 1個、研缽、移液槍1000LUV-1800型紫外-可見光分光光度計 日本島津公司；旋渦混合器；PH計。1.2.3 試劑配制1.2.3.1 標準蛋白質溶液(100g/mL牛血清白蛋白)：稱取牛血清蛋白 25mg，加水溶解并定容至100mL，吸取上述溶液40mL，用蒸餾水稀釋至100mL； 考

5、馬斯亮藍試劑：稱取50mg考馬斯亮藍G-250，溶于25mL 90%乙醇中，參加50mL 85g/100mL的磷酸，再用蒸餾水定容到500mL，搖勻，貯于棕色瓶中； 提取液：pH 7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8和9.0梯度Tris-HCl緩沖液(100mmol/L)； 梯度濃度Tris-HCl緩沖液(pH 9.0)：10、30、50、80、100mmol/L； 1.2.3.5 外源添加添加量：乙二胺四乙酸(EDTA)(1mmol/L)、聚乙烯比咯烷酮(PVP)(1g/100mL)、NaCl(0.15mol/L)、MgCl2(0.5mmol/L)、抗壞血酸

6、(2mmol/L)、半胱氨酸(2mmol/L)、-巰基乙醇(2%，V/V)。1.3 實驗步驟考馬斯亮藍G-250溶液及其蛋白反響液全波長掃描取3mL配制好的考馬斯亮藍G-250溶液或其與蛋白反響液，置于1cm光程玻璃比色皿中，以紫外分光光度計在400800nm圍進展掃描，確定考馬斯亮藍G-250溶液和其蛋白反響液的最大吸收峰和空白吸收值。 標準曲線的繪制取6支試管，按表1參加標準蛋白質溶液和蒸餾水，混勻后，向各管中參加5mL考馬斯亮藍G-250溶液。每加完一支試管，立即在旋渦混合器上混合(注意不要太劇烈，以免產生大量氣泡而難于消除)。混合后靜置5min左右，以0號試管為空白對照，在595nm波

7、長處測定吸光度。以蛋白質含量為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪制標準曲線，求得線性回歸方程 表 1 繪制標準曲線的各試劑添加量 工程 管號012345100g/mL 牛血清白蛋白溶液/mL00.20.40.60.81.0蒸餾水/mL1.00.80.60.40.201.3.3 果蔬組織可溶性蛋白質的提取 最正確緩沖溶液和pH值確實定稱取蘋果果肉樣品1g，參加5mL水或梯度pH值Tris-HCl緩沖液，冰浴上充分研磨勻漿，移入10mL離心管中，于4000rpm離心15min，收集上清液即為可溶性蛋白質提取液，低溫保存備用。 最正確提取緩沖液濃度確實定 以上節確定的提取緩沖鹽和pH值為基準，分別配制該pH

8、值下濃度依次為0、10、30、50、80、100mmol/L的提取緩沖液9。提取體系及方法同節。.3 適宜外源添加物確實定 以上節確定的最正確緩沖溶液為基準，分別添加以下濃度的添加物：EDTA(1mmol/L)、PVP(1g/100mL)、NaCl(0.15mol/L)、MgCl2(0.5mmol/L)、抗壞血酸(2mmol/L)、半胱氨酸(2mmol/L)和-巰基乙醇(2%，V/V)。提取體系及方法節。添加組合為：抗壞血酸、半胱氨酸、EDTA、PVP、-巰基乙醇、NaCl、MgCl2、PVP-巰基乙醇、PVPEDTA、EDTAPVP-巰基乙醇1.3.3.4 蘋果組織可溶性蛋白質含量的測定 吸

9、取1.0mL樣品上清液，放入試管中，參加5.0mL考馬斯亮藍G-250溶液，充分混合，放置5min后在波長595nm處比色，按照制作標準曲線同樣的方法測定吸光度。重復3次。 數據處理E*cel 統計分析所有數據，計算標準誤差并制圖。2 結果及討論2.1 標準曲線的繪制表二 不同吸光度值對應BSA含量BSA含量g020406080100吸光度A00.1440.2680.3660.4470.541查閱文獻得，可溶性蛋白質質量濃度高時，考馬斯亮藍G-250染色法線性降低，R=0.9929。可溶性蛋白質量濃度在80g/mL以時，該方法線性關系較好，相關系數R=0.9929。因此，考慮到該方法高濃度時非

10、嚴格的線性關系，實際應用時，相關系數R在0.99-1圍屬根本可以承受圍。本實驗R=0.9990，線性很好。2.2 不同緩沖體系對可溶性蛋白提取效果的影響不同緩沖溶液對可溶性蛋白提取效果的影響表三 水及不同pHTris-HCl對可溶性蛋白提取效果的影響溶液及PH值水PH=7.2PH=7.4PH=7.6PH=7.8PH=8.0PH=8.2PH=8.4PH=8.6PH=8.8PH=9.0吸光度A0.1290.1510.180.1630.1660.1600.1720.1860.2010.2180.258蛋白含量g19.1923.2923.1125.5326.0924.9727.2029.8132.61

11、35.7843.23蛋白含量%15.3518.6318.4920.4220.8719.9821.7623.8526.0928.6234.58其中，1-11分別代表水、pH為7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0的Tris-HCl緩沖溶液100mmol/L不同緩沖體系對可溶性蛋白提取效果的影響通常利用考馬斯亮藍G-250染色法測定植物組織微量的可溶性蛋白時，常選用的提取液包括水、Tris-HCl緩沖液和磷酸PBS緩沖液。本實驗研究了水以及不同pH值的Tris-HCl緩沖液定蘋果組織低量可溶性蛋白質的提取影響。在Tris-HCl緩沖溶液100mmol/L有效

12、緩沖圍()選取如下pH值梯度：7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0。采取1:5料液比制備可溶性蛋白質提取液，按制作標準曲線方法測定提取液可溶性蛋白含量，測定結果如以下圖。由圖可以看出：隨Tris-HCl緩沖溶液pH值的升高，可溶性蛋白質的提取效率增加；且Tris-HCl緩沖溶液提取效果明顯優于水提組，其中pH7.2的Tris-HCl緩沖溶提取效率最低，但提取的可溶性蛋白含量仍然比水提組高17.55%；提取緩沖液pH值為9.0時提取效率最高，比水提組和提取組pH值為7.2分別高125.27%、85.61%。查閱文獻得，整體上Tris-HCl緩沖溶液提取效

13、率高于磷酸鹽PBS緩沖溶液蘋果果肉組織可溶性蛋白質提取的適宜緩沖溶液為pH值為9.0的Tris-HCl緩沖溶液。 不同緩沖液濃度對可溶性蛋白質提取效果的影響表四 不同濃度Tris-HCl對可溶性蛋白質提取效果的影響溶液mmol/L010305080100吸光度A0.1290.1490.1660.1960.2380.264蛋白含量g19.1922.9226.0931.6839.50 47.33蛋白含量%15.3518.3420.8725.3431.60 37.86其中，1-6分別表示濃度為0、10、30、50、80、100mmol/L的pH為9.0的Tris-HCl緩沖溶液常用可溶性蛋白質提取緩

14、沖液濃度為0.020.05mol/L緩沖體系，實驗過程中，選擇0.01、0.03、0.05、0.08、0.1mol/L的pH為9.0的Tris-HCl緩沖溶液進展實驗，結果如以下圖。由圖可知，低濃度 pH為9.0的Tris-HCl緩沖條件即可明顯提高可溶性蛋白的提取效率(如10mmol/L緩沖溶液可溶性蛋白提取量比對照水提組高19.48%)。且隨著Tris-HCl緩沖液濃度增加，可溶性蛋白的提取效率增加。30、50、80、100mmol/L緩沖溶液可溶性蛋白提取量分別比對照高35.96%、65.08%、105.86%、146.64%。其中，100mmol/L緩沖液提取效果最正確，其可溶性蛋白有

15、效提取量比80mmol/L緩沖液仍高出19.81%。2.2.3 外源添加物對可溶性蛋白提取效果的影響以上述實驗確定的100mmol/L，pH為9.0的Tris-HCl緩沖溶液為根底提取液，添加蛋白酶保護劑和抑制劑，進一步探討外源添加這些物質對真實測定果蔬組織中可溶性蛋白質的含量的影響。分別選取抗壞血酸、半胱氨酸、EDTA、PVP、-巰基乙醇、NaCl、MgCl2以及這些試劑的不同組合進展實驗，以不添加任何添加物的100mmol/L，pH為9.0的Tris-HCl緩沖溶液為對照，結果如以下圖所示。 表五 不同外源添加物對可溶性蛋白質提取效果的影響外源添加物抗壞血酸半胱氨 酸EDTAPVP-巰基乙

16、醇NaClMgCl2PVP-巰基乙醇PVPEDTAEDTAPVP-巰基乙醇無吸光度A0.2150.2430.3260.3540.1730.1630.1800.1910.3830.2010.261蛋白含量g35.2240.4355.9061.1227.3925.5228.6930.7466.5232.6143.44蛋白含量%28.1832.3444.7248.9021.9120.4222.9524.5953.2126.0934.75其中，A-J分別代表抗壞血酸、半胱氨酸、EDTA、PVP、-巰基乙醇、NaCl、MgCl2、PVP-巰基乙醇、PVPEDTA、EDTAPVP-巰基乙醇單獨添加2mmo

17、l/L半胱氨酸對可溶性蛋白提取效果無明顯影響；單獨添加2mmol/L抗壞血酸、0.15mmol/LNaCl、2%-巰基乙醇和0.15mmol/LMgCl2對該濃度和pH值的緩沖液可溶性蛋白的提取效率均有抑制作用，這4種物質處理后，可溶性蛋白提取量分別比對照組低23.31%、70.17%、58.60%、51.41%。從-巰基乙醇和PVP及EDTA的復合處理結果也可看出其對果實可溶性蛋白提取的抑制作用，PVP-巰基乙醇處理組可溶性蛋白測定量比PVP處理組低，PVPEDTA-巰基乙醇處理組可溶性蛋白含量比PVPEDTA組低；單獨添加PVP和EDTA均有助于提高果實可溶性蛋白的提取率，PVP效果(比對

18、照高40.71%)好于EDTA(比對照組高28.69%)。而PVP和EDTA復合處理效果比單獨處理效果更佳，其有效可溶性蛋白提取量比對照高53.12%。2.3 蘋果組織可溶性蛋白質含量的測定 表六 蘋果組織可溶性蛋白質含量的測定次數工程吸光度蛋白含量g蛋白含量%平均值10.26043.6034.8834.9320.26344.1635.3330.25843.2334.58上述研究結果說明，以考馬斯亮藍G-250染色法測定組織微量蛋白含量時，果實可溶性蛋白提取受提取液pH值、緩沖鹽種類、緩沖鹽濃度、外源添加物PVP和EDTA等因素影響。實驗最終確定的適用于蘋果果實可溶性蛋白含量測定的提取條件為，

19、0.1mol/L,pH為9.0的Tris-HCl提取緩沖液(含1mol/LEDTA和1%PVP)，1:5料液比，此條件下，果實可溶性蛋白的有效測定含量為34.93%mg/g3 其他3.1 實驗流程圖3.2 考馬斯亮藍法的優點3.2.1 靈敏度高，據估計比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質檢測量可達1mg。這是因為蛋白質與染料結合后產生的顏色變化很大，蛋白質染料復合物有更高的消光系數，因而光吸收值隨蛋白質濃度的變化比Lowry法要大的多。3.2.2 測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質結合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時保持穩定

20、，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩定性最好。因而完全不用像Lowry法那樣費時和嚴格地控制時間。3.2.3 干擾物質少。如干擾Lowry法的K 、Na 、Mg2 離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。3.3 考馬斯亮藍法的缺點3.3.1 由于各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質測定時有較大的偏差，在制作 標準曲線時通常選用 g球蛋白為標準蛋白質，以減少這方面的偏差。3.3.3 仍有一些物質干擾此法的測定，主要的干擾物質有：去污劑、 Triton *-100、十二烷基硫酸鈉SDS和0.1N的NaOH。如同0.1

21、N的酸干擾Lowary法一樣。3.3.3 標準曲線也有輕微的非線性，因而不能用Beer定律進展計算，而只能用標準曲線來測定未知蛋白質的濃度。3.4 染料考馬斯亮藍有G250 和R250 兩種形式在顏色索引Colour Inde*中給出了不同的編號42655和42660。亮藍G和亮藍R在冷水中分別為微溶和不溶，在熱水和乙醇中分別為可溶和微溶。兩種染料均能對固定的蛋白有效地進展染色，使用濃度為溶于甲醇:冰醋酸:水50:10:40的0.05%溶液。但考馬斯亮藍R250尤其適用于SDS電泳微量蛋白質的染色,所以本次實驗選擇了考馬斯亮藍G250。3.5 測定時間蛋白質與考馬斯亮藍G-250結合的反響十分迅速，在2min左右反響到達平衡；其結合