1、Enzyme Engineering酶工程第三章 酶的生產制備 酶的生產方式1.提取法: 植物、動物、微生物2.化學合成法生物合成法： 利用植物、動物、微生物細胞合成。 上個世紀50年代起利用微生物生產酶。 1949年細菌發酵生產淀粉酶 上個世紀70年代以來利用植物細胞和動物細胞培養技術生產酶。 木瓜細胞培養生產木瓜蛋白酶和木瓜凝乳蛋白酶 人黑色素瘤細胞培養生產血纖維蛋白溶酶原激活劑動植物細胞培養的特殊性： 1、細胞比微生物細胞大得多，體積大幾千倍，2、對剪切力敏感，動物細胞沒有細胞壁更甚3、生長速率比微生物低，生長倍增時間和發酵周期均更長，4、對營養的要求較微生物復雜，動物細胞往往需要添加血

2、清和其他營養成分3、酶的發酵生產經過預先設計，通過人工操作控制，利用細胞的生命活動，產生人們所需要的酶的過程，稱為酶的發酵生產。 第一節 酶的生產菌種一、生產菌種1.細菌 芽孢桿菌（蠟狀、枯草、地衣）、大腸桿菌2.霉菌 黑曲霉、米曲霉、木酶3.酵母菌 啤酒酵母、假絲酵母4.放線菌 鏈霉菌二、產酶菌種的要求（1）不是致病菌及產生有毒物質或其他生理活生物質的微生物，確保酶生產和應用的安全。 （2）能在便宜的底物上生長良好，繁殖快，產酶量高，有利于縮短生周期（3）產酶性能穩定，菌株不易退化，不易受噬菌體侵襲。（4）目標酶的產量要高，性能符合應用需要，產生的酶容易分離純化，最好為胞外酶。（5）除蛋白酶

3、生產菌種外，其他產酶菌種的產蛋白酶活力應該很低，防止目標酶的水解。 三. 產酶微生物的分離和篩選 1)樣品的采集:從富含該酶作用底物的場所采集樣品 2)富集培養: 投其所好，取其所抗 3)分離獲得微生物的純培養（pure culture）。 4)初篩：選出產酶菌種，以多為主。 5)復篩：選出產酶水平相對較高的菌株，以質為主。 -淀粉酶的篩選蛋白酶產生菌的獲得方法應用含酪蛋白的培養基第二節 酶的發酵技術一、培養基 C/N: 產酶促進劑: 誘導物 表面活性劑二、發酵條件對產酶的影響 溫度、pH值、通風量三、發酵方法1、固體培養發酵：培養基以麩皮、米糠等為主要原料加入其它營養成分，經滅菌、接產酶菌株

4、，在一定條件下發酵，目的獲得淀粉酶和蛋白酶，如酒曲生產。 2、液體深層發酵液體培養基，在發酵容器中，經滅菌、冷卻接入產酶細胞，在一定條件下發酵，是目前酶生產的主要方法。 3、固定化細胞發酵第三節 提高酶產量的方法一、酶合成的調節機制1.操縱子調節基因： 阻遏蛋白 輔阻遏物2、誘導和阻遏誘導： 誘導物的加入后，酶才大量合成， 參與分解代謝的酶：淀粉酶、纖維素酶阻遏： 末端代謝物阻遏： 反饋阻遏，合成代謝中的關鍵酶 分解代謝物阻遏： 1. 酶合成的誘導加進某種物質，使酶生物合成開始或加速進行。 酶合成誘導的現象： 已知分解利用乳糖的酶有： -半乳糖苷酶； -半乳糖苷透過酶；硫代半乳糖苷轉乙酰酶。實

5、驗：（1）大腸桿菌生長在葡萄糖培養基上時，細胞內無上述三種酶合成； （2）大腸桿菌生長在乳糖培養基上時，細胞內有上述三種酶合成； （3）表明菌體生物合成的經濟原則：需要時才合成。調節基因操縱基因乳糖結構基因PLacZLacYLacamRNA 阻遏蛋白（有活性）基 因 關 閉啟動子ORPLacZLacYLaca調節基因操縱基因乳糖結構基因啟動子ORmRNAZmRNAYmRNAa 阻遏蛋白（無活性） 基 因 表達mRNAA、乳糖操縱子的結構B、乳糖酶的誘導 乳糖 阻遏蛋白（有活性）誘導 2.末端產物阻遏 由某代謝途徑末端產物的過量累積引起的阻遏。 酶合成阻遏的現象： 實驗： （1）大腸桿菌生長在無

6、機鹽和葡萄糖的培養基上時， 檢測到細胞內有色氨酸合成酶的存在； （2）在上述培養基中加入色氨酸，檢測發現細胞內色氨酸合成酶的活性降低，直至消失。 （3）表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成，體現了菌體生長的經濟原則:不需要就不合成。 色氨酸操縱子酶的阻遏調節基因操縱基因結構基因mRNA酶蛋白阻遏蛋白不能與操縱基因結合，結構基因表達調節基因操縱基因結構基因輔阻遏物代謝產物與阻遏蛋白結合，使之構象發生變化,與操縱基因結合，結構基因不能表達酶的誘導和阻遏操縱子模型B.有活性阻遏蛋白加誘導劑A.有活性阻遏蛋白C.無活性阻遏蛋白D.無活性阻遏蛋白加輔阻遏劑操縱基因啟動基因調節基因結構基因 阻遏蛋白(

7、有活性)阻遏蛋白阻擋操縱基因結構基因不表達誘導物誘導物與阻遏蛋白結合,使阻遏蛋白不能起到阻擋操縱基因的作用,結構基因可以表達酶蛋白mRNA阻遏蛋白不能跟操縱基因結合, 結構基因可以表達阻遏蛋白(無活性)酶蛋白mRNA代謝產物與阻遏蛋白結合,從而使阻遏蛋白能夠阻擋操縱基因,結構基因不表達代謝產物3.分解代謝物阻遏指細胞內同時有兩種分解底物（碳源或氮源）存在時，利用快的那種分解底物會阻遏利用慢的底物的有關酶合成的現象。分解代謝物的阻遏作用，并非由于快速利用的甲碳源本身直接作用的結果，而是通過甲碳源（或氮源等）在其分解過程中所產生的中間代謝物所引起的阻遏作用。分解代謝物阻遏現象： 實驗：細菌在含有葡

8、萄糖和乳糖的培養基上生長，優先利用葡萄糖。待葡萄糖耗盡后才開始利用乳糖，產生了兩個對數生長期中間隔開一個生長延滯期的“二次生長現象”(diauxie或biphasic growth）。 這一現象又稱葡萄糖效應，產生的原因是由于葡萄糖降解物阻遏了分解乳糖酶系的合成。此調節基因的產物是環腺苷酸受體蛋白（CRP）,亦稱降解物基因活化蛋白（CAP）。分解代謝物阻遏RLacZLacYLacamRNAmRNAZmRNAYmRNAa基 因 表達CAP基因結構基因TCAPOCAP結合部位 RNA聚合酶TcAMP -CAPP葡萄糖分解代謝產物腺苷酸環化酶磷酸二酯酶ATPcAMP5-AMP抑制激活葡萄糖降解物與c

9、AMP的關系cAMPCAP：降解物基因活化蛋白（catabolic gene activation protein）降低cAMP濃度使CAP呈失活狀態三、提高酶產量的策略（一）菌種選育（一勞永逸） 1.誘變育種 (1) 使誘導型變為組成型選育組成型突變株(2)使阻遏型變為去阻遏型 選育營養缺陷型突變株解除反饋阻遏 選育結構類似物抗性突變株解除分解代謝物阻遏選育抗分解代謝阻遏突變株 2. 基因工程育種 二、提高酶產量的策略（一）菌種選育（一勞永逸） 1.誘變育種 (1) 使誘導型變為組成型選育組成型突變株(2)使阻遏型變為去阻遏型 選育營養缺陷型突變株解除反饋阻遏 選育結構類似物抗性突變株解除分

10、解代謝物阻遏選育抗分解代謝阻遏突變株 2. 基因工程育種 （二）.通過條件控制提高酶產量（1）添加誘導物 選擇適宜的誘導物及濃度:誘導物： 酶的作用底物 酶作用底物的前體 酶的反應產物 酶的底物類似物或底物修飾物等 IPTG/乳糖 纖維素/纖維二糖誘導纖維素酶 （2）降低阻遏物濃度 避免使用過于豐富的培養基和易被利用的碳源，并設法阻止效應物的形成和濃度的增加。 流加和連續培養（3）.其他 促進分泌：添加表面活性劑 離子型 對細胞有毒害作用 表面活性劑 Tween80 非離子型 TritonX100 非離子型增加細胞通性， 添加產酶促進劑 植酸鈣鎂，聚乙烯醇等第四節 酶發酵動力學 細胞生長速度

11、產物生成速度 基質消耗速度 環境因素的影響細胞生長動力學發酵產酶動力學發酵動力學研究內容：一、酶生物合成的模式微生物細胞的生長歷程按細胞生長和酶產生的關系，酶生物合成具有下列四種模式：1、同步合成型2、延續合成型3、中期合成型4、滯后合成型1. 生長偶聯型（又稱同步合成型） 酶的生物合成與細胞生長同步。特點：酶的合成可以誘導，但不受分解代謝物阻遏和反應產物阻遏。 當去除誘導物、細胞進入平衡期后，酶的合成立即停止，表明這類酶所對應的mRNA很不穩定。2.生長偶聯型中的特殊形式中期合成型 酶的合成在細胞生長一段時間后才開始，而在細胞生長進入平衡期以后，酶的合成也隨著停止。特點：酶的合成受產物的反饋

12、阻遏或分解代謝物阻遏。 所對應的mRNA是不穩定的。 枯草桿菌堿性磷酸酶合成曲線 3.部分生長偶聯型（又稱延續合成型） 酶的合成在細胞的生長階段開始，在細胞生長進入平衡期后，酶還可以延續合成較長一段時間。特點：可受誘導，一般不受分解代謝物和產物阻遏。 所對應的mRNA相當穩定。黑曲霉聚半乳糖醛酸酶合成曲線4. 非生長偶聯型（又稱滯后合成型） 只有當細胞生長進入平衡期以后，酶才開始合成并大量積累。許多水解酶的生物合成都屬于這一類型。特點：受分解代謝物的阻遏作用。 所對應的mRNA穩定性高。黑曲霉酸性蛋白酶合成曲線 總結：影響酶生物合成模式的主要因素1）mRNA的穩定性2）培養基中阻遏物的存在mR

13、NA的穩定性，培養基中誘導物，反饋阻遏物，分解代謝物的存在是影響酶生物合成模型的主要因素。 mRNA穩定性 代謝調節 產物生成模型同步合成型 (-) 誘導 dP/dt=dX/dt 延續合成型 (+) 誘導 dP/dt=dX/dtX中期合成型 (-) 反饋阻遏 dP/dt=dX/dt （解除阻遏后）滯后合成型 (+) 分解代謝物阻遏 dP/dt=X 酶生產中最理想的合成模式：延續合成型（部分偶聯）：發酵過程中沒有生長期和產酶期的明顯差別。細胞開始生長就有酶的產生，直至細胞生長進入平衡期后，酶還可以繼續生成一段時間。 對于：同步合成型：提高對應的mRNA的穩定性，如降低發酵 溫度 。滯后合成型：盡

14、量減少甚至解除分解代謝物阻遏，使 酶的合成提早開始。中期合成型：要在提高mRNA穩定性以及解除阻遏兩方 面努力。目的：提高產酶率和縮短發酵周期最理想的合成模式：延續合成型策略措施：菌種選育：提高mRNA的穩定性，解除分解代謝物阻遏和反饋阻遏。發酵代謝調節：理想誘導物的添加，解除反饋阻遏和分解代謝物阻遏（難利用的碳氮源的使用，補料發酵）。降低產酶溫度。二、細胞生長動力學微生物細胞生長的動力學方程：Monod方程：S限制性基質濃度；m最大比生長速率；Ks Monod常數倒數形式：三、產酶動力學產酶動力學方程：X細胞濃度，以每升發酵液所含的干細胞重量表示（gDC/L）固定化微生物細胞發酵產酶一、固定

15、化細胞發酵產酶的特點1、提高產酶率2、可以反復使用或連續使用較長時間3、基因工程菌的質粒穩定，不易丟失4、發酵穩定性好5、縮短發酵周期，提高設備利用率6、產品容易分離純化7、適用于胞外酶等胞外產物的生產第三章 酶的生產和制備 第五節 酶的分離純化（酶的制備） 酶的提取和分離純化： 將酶從細胞或培養基中抽提出來，獲得與使用目的相適應的有一定純度和濃度的酶產品的過程。兩個基本環節：分離和純化 分離：將酶從原料中抽提出來，并盡可能少引入雜質，得到粗酶液 純化：將酶和雜質中分離開來，或者有選擇地將酶從包含雜質中分離出來，得到一定純度的酶。酶的純化過程與一般蛋白質純化過程相比的特點： 1、特定的一種酶在

16、細胞中的含量較少， 2、酶可以通過測定活力的方法加以跟蹤。 前者給純化帶來了困難，而后者卻迅速找出純化過程的關鍵所在。 理想的提取和分離純化方法：在提高酶的比活的同時，要求酶回收率高，提取步驟少、工藝簡單，成本低一、原則1.防止酶失活 這一原則要貫穿純化工作的始終，在后期尤為重要。 建立一個可靠和快速、易行的測定酶活方法 物理因素、化學因素和生物因素導致酶失活2.分離純化的環節的選擇（經濟、宜行）： 純化倍數、酶活回收率和重現性 （衡量優劣） 經濟、可靠，建立靈敏、快速、特異、精確的檢測（酶活和蛋白質的含量）手段。3、分離步驟、方法和成本間的關系 提取、分離、純化、制劑策略：酶產品的質量要求設

17、定目標：（用途：醫用、食品級、工業級或研究級） 目標酶蛋白與主要雜質的性質提取過程的設計應盡可能防止酶的損失，減少處理步驟。提取方法的經濟性和可分析性 盡量減少添加劑的使用 盡早使用高效分離方法，將昂貴、費時的分離方法放在最后階段。 酶活力、蛋白濃度、純度測定方法可行性劑型（液體濃縮酶、粉狀酶、精制酶、結晶酶等）二、 酶活力（一） 酶活力 酶活力activity： 酶催化一定化學反應的能力。用酶催化的反應速度來表示酶活力，即用單位時間內，單位體積中底物的減少量或產物增加量來表示。 轉換頻率：單位時間轉化的底物分子數。 Kcat,單位1/s（二）酶活力單位及比活力 酶活力單位U（active u

18、nit）：是根據某種酶在最適條件下，單位時間內被酶作用的底物的減少量或產物的生成量來規定的，表示酶活力高低。 IU：umol/min Kat：mol/s 1 Kat=6107 IU 酶的比活力 指每mg酶蛋白（或每mg蛋白氨）所含的酶活力單位數即：比活力=活力單位數/酶蛋白（氮）mg 表示酶制劑的純度，比活力愈高，酶愈純。一、基本過程（一）、材料（選擇）預處理及破碎細胞 1.胞內酶和胞外酶 2.破碎細胞（二）、固液分離（離心或過濾） 酶的溶解性、穩定性第六節 酶分離純化的基本過程（三）、凈化與脫色 絮凝劑 脫色處理（四）、濃縮 （熱量法、沉淀分離、膜分離） （五）純化、結晶 （干燥）二、酶分離純化方法三、酶分離純化中的一些數據（p93） 1.總蛋白 2.總活力 3.比活力 4.酶濃度 5.純化倍