1、第三章 環境毒理學的根本研討方法毒理學實驗調查研討毒理學實驗根底 研討方法 流行病學研討 受控的臨床研討 毒理學體內實驗 毒理學體外實驗優點 真實的暴露條件 規定的限定暴露條 易于控制暴露條件 影響要素少，易于控 在各化學物之間發生相 在人群中測定反響 能測定多種效應 制 互作用 對某組人群(如哮喘) 能評價宿主特征的作用 可進展某些深化的研 測定在人群的作用 的研討是有力的 (如：性別、年齡、遺 究(如：機制，代謝) 表示全部的人敏感性 能測定效應的強度 傳特征等和其他調控因 人力物力破費較少 素飲食等) 能評價機制缺陷 耗資、耗時多 耗資多 動物暴露與人暴露相關 不能全面反映毒作用 多為回

2、想性，無安康 較低濃度和較短時 的不確定性 不能作為毒性評價和 維護 間的暴露 受控的豢養條件與人的 危險性評價的最后依 難以確定暴露，有混雜 限于較少量的人群 實踐情況不一致 據 暴露問題 (普通50) 暴露的濃度和時間的模 難以察看慢性毒作用 可檢測的危險性添加必 限于暫時、微小、 式顯著地不同于人群的 需到達2倍以上 可逆的效應 暴露 測定目的較粗(發病率， 普通不適于研討最 死亡率) 敏感的人群 毒理學研討方法的優缺陷1 實驗動物和人對外源化學物的反響敏感 性不同，有時甚至存在著質的差別2 高劑量向低劑量外推的不確定性3 小數量實驗動物到大量人群外推的不確 定性4 成年安康動物向年老體

3、弱及患病個體外 推的不確定性實驗動物的毒理學實驗資料外推到人群接觸的平安性時的不確定性1 化學物在實驗動物產生的作用，可以外推 于人。根本假設 人是最敏感的動物物 種；人和實驗動物的生物學過程與體重 (或體外表積)相關。2 實驗動物必需暴露于高劑量，這是發現對 人潛在危害的必需的和可靠的方法。 3 成年的安康(雄性和雌性未孕)實驗動物和 人能夠的暴露途徑是根本的選擇。描畫毒理學實驗的根本原那么1 受試物毒作用的表現和性質 2 劑量反響(效應)研討 3 確定毒作用的靶器官 4 確定損害的可逆性 毒理學毒性評價實驗的根本目的實驗動物laboratory animal指經人工培育，對其攜帶微生物實行

4、控制，遺傳背景明確，來源清楚，可用于科學研討的動物。實驗動物的選擇實驗動物的選擇物種選擇 選擇對外液化學物的毒性反響及代謝特點與人類接近的物種；選擇自然壽命不太長的物種；選擇易于豢養和實驗操作的物種；選擇經濟并易于獲得的物種。 近交系動物 延續20代以上兄妹交配或親子交配培育突變系動物 突變的基因可世代相傳并堅持遺傳基因特性雜交群動物 兩個不同近交系之間有目的進展交配，所產生的第一代動物， 亦稱雜交一代動物。封鎖群動物 5年以上不從外部引進新血緣，僅由同一品系的動物在固定場所保管繁衍的動物群 實驗動物的選擇品系選擇無菌動物 體內外均無任何微生物和寄生蟲無特定病原體動物SPF體內無特定微生物和寄

5、生蟲存在的動物(無傳染病)。豢養于封鎖的系統。清潔動物 與SPF的不同：抗體檢查常有腦脊髓炎病毒、鼠肝炎病毒等抗體滴度，但不應有臨床病癥、病理改動及自然死亡。豢養在半屏蔽系統。微生物控制的選擇實驗動物的選擇個體選擇 1 年齡2 性別 3 生理形狀 4 安康情況 實驗動物的選擇 品 系周齡 Wistar SD雌性雄性雌性雄性 354565052 4919786101 5134134130150 6166187172206 7209233210262 8214297240318 923232525836510246370272399大鼠體重與周齡的關系 小鼠體重與周齡的關系 品 系 周齡 昆明 B

6、ALB/c C57BL/6 615 雌性 雄性 雌性 雄性 雌性 雄性 雌性 雄性 01.95 2.10 1.40 1.46 1.40 1.44 1.58 1.58 15.54 5.82 3.35 3.50 3.42 3.50 4.64 4.64 27.90 8.35 5.50 5.60 5.55 5.60 7.96 7.96 313.55 14.80 7.32 7.40 6.40 6.90 9.83 9.83 421.35 22.6011.6012.4512.2012.5715.7519.00 527.90 33.2514.7516.1016.9018.1020.7522.58 632.80

7、 39.2515.6017.4018.4020.5021.8825.96 734.70 39.9016.1018.6519.0021.6023.1227.96 834.80 40.0518.1620.2520.2522.4024.1628.831 未處置對照組(空白對照組)：本底值， 質量控制2 陰性(溶劑賦形劑)對照：與染毒組比 較的根底 3 陽性對照：檢測實驗體系的有效性4 歷史性對照：檢查實驗體系的穩定性， 即進展實驗室質量控制和保證 毒理學實驗常用對照 對各個毒理學實驗應該用同一種、同一批號受 試物 受試物成分和配方必需固定 如是異構體混合物，異構體比例必需固定 活性成分的百分含量和可

8、檢測的雜質的濃度也 應固定 受試物在儲存期內穩定性和在飼料中的穩定性 必需進展研討并報告 受試物應一次備齊全部實驗的用量受試樣品毒理學實驗設計的統計學要求 隨機、反復、對照原那么 對常規毒理學實驗資料的統計學方法 計量資料：普通用t檢驗或ANOVA 記數資料：卡方檢驗毒理學實驗的統計學1 處置組與對照組比較差別有無顯著性 2 有無劑量-反響關系3 能否伴有其他相關參數的改動4 能否在 “正常值范圍 實驗結果的判別第一節 急性毒性實驗一、急性毒性實驗的目的： 1、確定供試化學物急性毒性的劑量反響關系和中毒特征； 2、求LD50或LC50,為急性毒性評價提供根據。 3、研討毒物的毒動學和毒效學過程

9、。表示急性毒性大小： LD50(對受試物的個體感受性影響較小，有更高的重現性)二、實驗程序與評價 1動物選擇：首選受試物在體內代謝情況與人體內相近的或對受試物最敏感的品系。 普通：以哺乳動物為主，常用大鼠、小鼠； 經皮：兔、豚鼠、豬 應對兩種性別、成年和幼年動物進展測定。 選擇兩種以上的實驗動物，最好一為嚙齒類，一為非嚙齒類。(目的：核對種間差別) 2染毒途徑與方式： 普通與人的接觸途徑一樣。 (1)經口染毒：常用灌胃法，也可將受試物放在飲水中由動物自在攝取。 (2)經呼吸道染毒： 將實驗動物放在有毒氣或粉塵的染毒柜內進展染毒。急性吸入染毒采用靜式染毒瓶(柜)，染毒24h。 (3)經皮膚染毒：

10、主要用于化學物經皮(或粘膜)吸收所引起的急性毒性。正式給藥前24h，背部脫毛，勿傷皮膚。將受試物均勻涂布于皮膚外表，用紗布覆蓋，共敷24h。3實驗程序： 1劑量與分組 預實驗：找出受試物大致致死量范圍(死亡率為10%90%)；例：欲做化合物A的經口預實驗。 化合物B的化學構造與A類似，知B的=LD50 =40(預期毒性中值)。 那么預實驗取2.5、10、40、160、640 (上下各推12組，組距應較大，初始4倍差) 求LD50正式實驗：在LD100與LD0之間設57個劑量組。 組距(對數) 或 式中：n-設計的劑量組數2病癥察看 時間：24h或兩周內的反響三、 LD50的計算與結果評價 計算

11、方法：概率單位法和寇氏法。 LD50值愈小，毒性愈大。 概率單位法存在正態曲線關系。規范正態差d=(x-)/ 式中：x劑量對數； 劑量對數均數 規范差d=0，左邊面積(死亡率)為50，右邊面積(存活率)50 d=1，死亡率為84.13，d=2，死亡率為97.73,d2，死亡率接近100。d=一1，死亡率為15.87。d=一2，死亡率為2.27。d一3，死亡率接近0。從上表，可以任一死亡率換算為相應的概率單位。A：劑量對數死亡百分率B：劑量對數概率單位LC50計算步驟如下： a.根據死亡率查概率單位(死亡率為100或0不計)b.繪圖求回歸方程。c.求y=5的濃度對數m，其反對數即為LC50y=2

12、.78x-2.76同理可得LC5、 LC10、d.求LC50的可信限 先求LC50的規范誤差(Sm)： S(校準差)=1/k 本例中：S=1/2.78 平均致死量法又名寇氏法 實驗要求：每個實驗組動物數一樣；各組劑量按等比級數分組；最大劑量的死亡率最好為100或與之接近，最小劑量的死亡率最好為0或與之接近。式中：Xm最大劑量的對數值；i相鄰劑量比值的對數； 各組死亡率的總和以小數表示。例小鼠腹腔注射致百蟲急性毒性實驗結果如下表所示，求 LD50式中：p一個組死亡率；q一個組存活率；i相鄰劑量比值的對數；h各組動物數。第二節 亞慢性和慢性毒性實驗一、蓄積實驗及其方法：一蓄積作用：某些物質以較小劑

13、量反復作用于機體，可使機體對該物質的反響性加強，即一次染毒不引起明顯中毒反響或死亡的劑量，經分次反復染毒后，可引起明顯中毒或死亡，此種景象稱為蓄積作用(accumulation)。可分兩種： 物質蓄積：毒物在體內的排出量小于進入量，以致毒物在體內的貯留量增多為物質蓄積； 功能蓄積：毒物進入機體后，并未發如今體內明顯貯留，但可引起機體功能改動的逐漸累積，導致對該毒物的反響性加強。 耐受性(tolerance)：機體多次接觸化學物質后對該物質產生反響性減弱的景象，顯示不易發生慢性中毒。 二蓄積作用的測定方法 有多種，常用蓄積系數法。 蓄積系數(accumulation coefficient)K：

14、 ED50(n) 多次染毒使半數動物出現某種效應的總劑量; ED50(1) 一次染毒引起同一效應半數效量。假設以死亡為毒效應目的，上式為K越小，受試化合物的蓄積毒性越大。K蓄積作用強度1高度蓄積13明顯蓄積35中度蓄積5輕度蓄積 1固定劑量法 ：固定每天染毒劑量為1/201/5 LD50，延續染毒，直至實驗動物半數死亡。假設染毒劑量累計已達5個LD50 動物死亡仍末達半數，實驗均可告終了，計算蓄積系數，作出評價。 2遞增劑量法 ：先測定LD501，然后對另一組動物每天染毒，以4天為一期，開場給予0.1LD50。以后每期按1.5倍遞增劑量，直至動物半數死亡，或實驗已達28天，可終了實驗，計算系數

15、。 3. 二十天實驗法 ：選用大鼠或小鼠每個劑量組雌雄各10只，以1/2、l/5、1/10、1/20 LD50分別對每組進展染毒，每日1次，共20天。如l/20LD50組動物有死亡，且有劑量反響關系，那么有較強蓄積作用；如1/20 LD50組無死亡，那么為弱蓄積。蓄積系數的測定二、亞慢性毒性作用及其實驗方法：1、目的：確定化學物亞慢性毒性的閾劑量和NOEL。2、實驗期限：3-6月； 呼吸道吸收：30-90天； 皮膚毒性：30天。3、實驗動物的選擇、豢養環境及染毒途徑： 實驗動物選擇：對受試化學物敏感的物種或品系； 環境：營養合理，飲水清潔、充足、溫、光、濕適宜； 染毒途徑：盡量模擬人類在環境中

16、接觸受試化學物的途徑，與急性毒性實驗類似。4、劑量選擇與分組 劑量：180I50LD50，對于在體內不產生蓄積作用而排泄又快的物質可適當加大劑量，反之那么可減少劑量。 設34個實驗組和1個對照組。 實驗組要求：在實驗終了時 最低劑量組不產生可察看到的毒性反響； 最高劑量組能引起明顯毒性反響，但不引起死亡； 中間劑量組產生細微毒性反響。5、病癥察看普通性目的(非特異) 普通綜合性目的： 動物體重增長率、食物耗費率、活動才干等。 普通化驗性目的：主要指血和肝、腎功能的檢測。(2)特異目的： 測定特異性反響。 更確切闡明該物質的閾劑量(濃度)及無作用劑量(濃度)。(3) 病理組織學檢查： 實驗中死亡

17、動物的病理檢查及實驗終了時的尸檢。三、慢性毒性作用及其實驗方法1、目的：評價化學物在長期小劑量作用的條件下對機體產生的損害及其特點確定閾劑量和最大無作用劑量。2、實驗方法：1 動物選擇、染毒方法、察看目的等與亞慢性毒性實驗類似；2染毒期限：1-2年或終身染毒，也有人提出6月。3劑量分組： 3個染毒組和一個對照組。 高劑量組：1/51/2亞慢性實驗閾值； 中間劑量：1/501/10； 低劑量組：1/100。第四節 致突變實驗一、目的 確定外源化學物對生物體能否具有致突變作用。 基因點突變實驗、染色體畸變實驗、DNA損傷實驗。二、供試生物： 微生物、動物細胞、昆蟲、動物或植物三、實驗方法 體外基因

18、突變實驗、細胞遺傳學實驗、體內基因突變實驗、DNA損傷實驗一體外基因突變實驗1、Ames實驗鼠傷寒沙門氏菌/動物肝細胞微粒體實驗 1原理： 利用一種突變微生物菌株與被檢測化學物接觸，使突變型微生物回復突變，重新成為野生型微生物。 突變型微生物不具備合成組氨酸的才干，不能在不含或低濃度組氨酸培育基上生長。2方法： 將突變型沙氏菌在不含或低濃度組氨酸培育基上培育,以其生長情況作為目的。 在培育基中參與哺乳動物的肝細胞微粒體：提高靈敏度。3特點： 優點： 簡便、靈敏、快速48h、費用低； 檢測結果與對動物的致癌性的相符率達約90%。 缺陷： 利用微生物作為供試物，不能全面反映哺乳動物的遺傳信息，僅1

19、/6； 微生物的DNA修復系統與動物有差別； 微生物無免疫功能。 2、哺乳動物體細胞突變實驗 1方法原理與微生物突變類似。 常用的細胞株： 中國地鼠肺細胞V79 中國地鼠肺卵巢細胞(CHO 小鼠淋巴瘤L5178Y細胞株。V79、CHO細胞株正常細胞：缺乏利用嘌呤堿的酶HGPRT，不能在參與類嘌呤堿類物質的培育基上生長；突變細胞：可在參與類嘌呤堿類物質的培育基上生長。L5178Y突變細胞株正常細胞：缺乏胸苷激酶TK，不可在含有細胞毒物5-溴脫氧尿苷的培育基上生長。突變細胞：可在此種培育基上生長。二細胞遺傳學實驗染色體畸變實驗： 直接在顯微鏡下察看染色體構造和數目的改動情況。生殖細胞或體細胞、體外

20、或體內實驗。 體外：CHO細胞: 分裂快、數目適中、形狀明晰；人類外周血淋巴細胞 體內：受試動物骨髓細胞或其他胸腺、脾、精原細胞染色體畸變率的變化。1實驗方法： a. 體外培育： CHO細胞或人類外周血淋巴細胞與化學物，在細胞培育液DMEM, RPM, 1640或1999中，370C下培育24h(CHO)或72h(人類細胞。察看前2h參與秋水仙堿中期分裂阻斷劑，制片，鏡檢察看。 b. 體內染色體畸變分析：大鼠、小鼠，染毒豢養，察看骨髓細胞染色體畸變情況。第四節 環境流行病學方法一、概念和特點：流行病學：研討特定人群中有關安康的形狀和事件的分布以及影響這些分布的決議要素；環境流行病學：運用流行病

21、學的原理和方法，重點研討人們在生活和任務環境中各種要素與人群安康的關系。 普通流行病學研討的內容是疾病在人群中的分布，它要回答三個問題： (1)疾病在時間、地點、不同人群中是怎樣分布的? (2)什么要素是該病的主要決議要素? (3)怎樣控制該病的流行?環境流行病學除了上述普通內容，還有它本身的特點。 (1)它不僅研討疾病的分布規律，而且更經常地研討疾病前的形狀，即包括無異常安康)、微弱的功能改動、疾病的前期(亞臨床形狀)等各種安康情況，提示環境污染或某些微量元素的安康效應。 (2)環境流行病學研討的暴露要素主要是理化要素。知暴露要素，研討其對安康的影響；環境毒理學任務者所進展的大量任務就屬于這

22、種。例如金屬冶煉廠鉛污染大氣對居民安康影響，磷肥廠氟污染大氣對居民安康影響的調查等。出現安康異常，清查引起異常的暴露要素，這屬于討論病因的研討。例如，近年來我國學者對于鼻咽癌、食道癌病因的研討，對克山病、大骨節病病因的研討，均屬于此種類型。日本的水誤病和痛痛病的病因是重金屬污染呵斥的公害病領域里的研討成果，影響深遠。 (3) 環境流行病學研討的最整天的是為消除污染、改造環境、維護居民安康效力。 (4)直接以人群為研討對象，研討結果最具有壓服力。二、環境流行病學研討的內容 環境流行病學主要研討兩方面的內容一是暴露，二是安康；同時還要研討二者的聯絡。 (一) 暴露丈量： 環境暴露程度是人群接觸的環境要素的平均程度，是經過對環境因子在環境中的時空分布的實測結果求出的平均值。 暴露程度是估算人體接觸劑量的根據，因此要求丈量結果準確、可靠、有代表性。