1、食品中幾種內分泌干擾物的測定方法進展中山大學 公共衛生學院 營養學系李華斌 教授/博導 一、定義及分類環境內分泌干擾物（Environmental Endocrine Disruptors, EDCs） 又稱環境激素，美國環保局對其定義為：可通過干擾生物或人類的那些為保持自身平衡和調節發育過程而在體內產生的天然激素的合成、分泌、運輸、結合、反應和代謝等，從而對生物或人類的生殖、神經和免疫系統等功能產生影響的外源性化學物質。環境內分泌干擾物具有親脂性、不易降解、易揮發、殘留期長等特點，可通過生物富集和食物鏈的放大作用引起體內富集；且產量巨大，應用范圍廣。目前在我們日常生活中已被發現并確認的EDC

2、s已有6070種，它們可以通過不同途徑進入環境和人體，因此無論是人類或野生動物都可能受到EDCs的威脅。主要包括：農藥類物質（六六六、滴滴涕等）添加劑： 增塑劑：雙酚A、鄰苯二甲酸酯等 洗滌劑：壬基酚、辛基酚等 有機錫化合物：三丁基錫、三苯基錫等二噁英、多氯聯苯類雌激素類（乙烯雌酚、炔雌醇等）主要體現在以下3方面：（1）拮抗和模仿內源性激素；（2）破壞機體內正常內源性激素的生成和代謝；（3）可以破壞雌激素受體的生成、代謝等功能。環境激素對人類的影響主要是通過影響蛋白質合成、編碼DNA及激素的合成來使人體生殖系統、神經系統及免疫系統變得異常。例如：導致人類性早熟、神經系統障礙、記憶力下降、免疫系

3、統缺陷、甲狀腺功能缺損的增加和各種癌癥。 二、其效應與危害 三、內分泌干擾物測定方法 1、常見樣品前處理方法對待測樣品進行有效的前處理可以起到富集痕量組分、消除基體干擾、提高方法靈敏度的作用，同時還可以除去對儀器或分析系統有害的物質，使分析測定能長時間保持在穩定、可靠的狀態下運行。大體上可以將食品與生物樣品分為液體和固體或類固體樣品兩大類。1.1 液體樣品的前處理從液體樣品中提取EDCs 的傳統方法主要有：液液萃取( LLE) 法；單液滴微萃取( single drop micro-extraction，SDME) 技術；固相萃取( SPE) ；固相微萃取( SPME) 法；攪拌棒吸附萃取(

4、SBSE) 等。（司秀榮等，環境內分泌干擾物前處理方法研究新進展，環境科學與管理，2011, 30(8): 60-64.）1.1.1 液液萃取( LLE) 原理：利用分配定理，在不發生反應的情況下從溶液中提取需要測定的物質。優點：該技術方法操作簡單，易于實行。缺點：需要消耗大量的有機溶劑，費時費力，同時大量應用 有機溶劑又會導致新的環境污染或增加處理廢水的操作和成本，靈敏度低。1.1.2 單液滴微萃取(single drop micro-extraction，SDME) 該技術是近年來發展起來的基于LLE 原理的一種集萃取、濃縮、進樣分析于一體的樣品前處理新方法，所用有機溶劑量少，操作簡便，成

5、本低，且能解決萃取過程中產生的過飽和問題。 1.1.3 固相萃取( SPE) 由液固萃取和液相色譜技術相結合發展而來，具有有機溶劑使用量少、簡單快速、分離效率高、重復性好等優點，已廣泛用于EDCs 分析中。為目前從水樣中萃取有機化合物時使用最多的分離富集技術，尤其是在天然水樣品、食品模擬液體樣品和人體體液樣品等液體樣品的處理過程中顯示出強大的優勢。 常用的固體吸附劑有：XAD 樹脂系列、活性炭 (GAC) 、石墨化碳黑(GCB)和十八烷基硅烷(C18) 小柱等。 1.1.4 固相微萃取法( SPME) 原理：使用一根具交聯二甲基硅醚聚合物材料涂層的開口毛細管柱捕集被分析物。 SPME 法分析成

6、本較高，且相比于大多數常規萃取方法，SPME 無法將待分析物從樣品中完全或基本完全地萃取出來，有可能造成檢測結果的誤差大，需要校準。 1.1.5 攪拌棒吸附萃取( SBSE) SBSE 法的萃取機制和優點與SPME 法相同，其富集效率高。它通過一根涂有涂層材料的磁性攪拌棒在液體樣品中攪拌一定時間，待分析物吸附于棒上之后，經在線熱解吸，用GC /MS 法測定，或用有機溶劑溶解后經LC 法測定。與常用的SPE 法和LLE法相比，該法可顯著減少萃取與分析時間，靈敏度高，應用范圍廣。1.2 固體樣品的前處理從固體或類固體樣品中提取EDCs 的方法有：加速溶劑萃取( ASE) ；微波輔助溶劑萃取( MA

7、SE) ； 基體固相分散萃取( MSPD) ；索式提取法等。 1.2.1 加速溶劑萃取(ASE) ASE 也稱加壓溶劑萃取(PLE) ，是在較高的溫度和壓力下用有機溶劑萃取固體或半固體的自動化方法。該技術能夠減少提取時間。由于ASE 是在高溫下進行，易引起EDCs 降解，導致分析結果出現誤差。 目前，ASE 技術已成功用于萃取生物樣本和沉積物中的多氯聯苯( PCBs) 和有機氯殺蟲劑(OCPs) 。 1.2.2 微波輔助溶劑萃取 MAE 是一項非常簡便的提取技術，其所需設備僅是一個具有容器的微波設備，它允許同時提取幾種樣品，但需要使用能夠吸收微波輻射的溶劑，如二氯苯、甲醇、乙醇等。另外，該技術

8、還可使用微波轉換器，將輻射能量轉化成熱量，再傳至吸收微波輻射能力較差的溶劑(如正己烷、氯仿) 而完成萃取。1.2.3 基體固相分散萃取原理：是將涂漬有C18 等多種聚合物的擔體固相萃取材料與樣品一起研磨，得到半干狀態的混合物并將其作為填料裝柱，然后用不同的溶劑淋洗柱子，將各種待測物洗脫下來。優勢：操作簡單、節省溶劑、投資較少、無需使用昂貴的儀器設備。缺點：不能用于具有很強的吸附作用的樣品的測定。 可用于水樣中雙酚A、雌激素，魚體中壬基酚和辛基酚，蔬菜中某些農藥殘留等的前處理。 1.2.4 索式提取法 利用溶劑回流和虹吸原理，使固體物質每一次都能為純的溶劑所萃取的方法。 該方法是從各種基質中提取

9、分析物的一種經典方法，具有成熟、通用、簡便易操作及分析成本低等優點，但是它也存在著需要消耗大量的萃取溶劑和時間等缺點。 可用于軟體動物中雌激素，雙酚A和壬基酚等的前處理。2. 內分泌干擾物常用測定方法簡介 內分泌干擾物在食品中的含量低，干擾多，對分析技術也提出了要求。目前的內分泌干擾物多采用色譜分析法。色譜檢測的靈敏度高，檢出限低，能滿足低含量水平的分析。 在色譜技術中，氣相色譜法和高效液相色譜應用最為廣泛。對于氣相色譜，高靈敏度、高選擇性的檢測器眾多，可依據待測物的性質加以選擇。對于高效液相色譜，其檢測對象的范圍更寬，對待測物的限制和要求少。目前常用色譜結合質譜方法。 對于激素類物質的測定，

10、還可使用免疫檢測法、熒光法等。3. 食品中幾種常見內分泌干擾物的測定方法3.1 蔬菜中農藥殘留（六六六、滴滴涕）的測定方法 3.2 食品及包裝材料中雙酚A、鄰苯二甲酸酯的測定方法3.3 食品中壬基酚的測定方法3.4 食品中三丁基錫的測定方法3.5 食品中雌激素類藥物（乙烯雌酚、炔雌醇）的測定方法 3.1 農藥簡介農藥種類繁多，結構復雜，有殺蟲劑、殺螨劑、除草劑、熏蒸劑等多種類型。可干擾內分泌的農藥有幾十種，主要有：艾氏劑、六六六、 DDT 、甲萘威、乙撐硫脲、氯苯嘧啶醇、乙草胺、殺草強、氟樂靈等等。蔬菜、地下水和土壤受到大范圍農藥污染的事件日漸暴露，農藥會滲入土壤至地下蓄水層，即便停止使用后，

11、還會長期殘存在原地。人們通過食用有農藥殘留的蔬菜、水果及飲用農藥污染的水而與農藥接觸，使多種疾病的發生增加。 食品中六六六、滴滴涕殘留量的測定 方法：薄層色譜法、氣相色譜法（1）薄層色譜法原理：試樣中六六六、滴滴涕用有機溶劑提取，旋轉蒸發器減壓濃縮，濃硫酸磺化法凈化。薄層點樣展開后，噴硝酸銀顯色劑，經紫外線照射生成棕黑色斑點，與標準比較，概略定量。樣品處理：將試樣研磨成粉末或勻漿狀態。加水和丙酮振搖，再加入氯化鈉，溶解搖勻后，加石油醚提取。取上清，經無水硫酸鈉脫水后，旋轉蒸發器中濃縮近干，以小體積的石油醚溶解轉移定容。在加入濃硫酸，振搖，離心后取上清液點樣。 測定：制備薄層板 展開 顯色 定性

12、和定量（2）氣相色譜法原理：試樣中六六六、滴滴涕經提取凈化后用氣相色譜-電子捕獲檢測器測定，與標準對照品比較，以保留時間定性，色譜峰高或峰面積定量。樣品處理：同薄層色譜法。取上清液進行氣相色譜分析。測定：色譜柱：內徑3mm，長2m的玻璃柱，內裝涂以1.5%OV-17和2%QF-1混合固定液的80目100目硅藻土。載氣：高純氮，流速110mL/min。柱溫：185；檢測器溫度：225；進樣口溫度：195。進樣量：1l-10l。 3.2 雙酚A（BPA)是2，2-雙（4-羥基苯基）丙烷的俗稱，又稱二酚基丙烷。在食品包裝方面， 添加 BPA 的塑料具有無色透明、耐用、輕便以及抗摔等特性，在金屬罐內壁

13、做涂層可以防止食品從內部對金屬壁的侵蝕，因此，在食品包裝材料、容器內壁涂料等方面有著重要的用途，尤以嬰兒奶瓶，金屬罐容器的內涂層最為普遍。在食品塑料包裝中雙酚 A 溶出是個不容忽視的問題。 BPA具有雌激素活性，在人體內干擾正常激素分泌，從而影響生殖功能，導致惡性腫瘤的產生。還與代謝性疾病、腦部發育障礙、心血管疾病、糖尿病和肥胖有關。最新研究發現，成年人長時間接觸過量雙酚A，患心臟病風險增大。 食品及包裝材料中雙酚A的測定方法 食品包裝材料前處理方法（1）溶劑浸泡萃取 對于 PC 材質一般將其剪碎后用有機溶劑萃取。 對于金屬罐，多采用密封浸泡的方式。 衛碧文等將酸奶紙盒人工剪碎后采用液氮粉碎機

14、研磨后以甲醇為提取溶劑，經 6h 索氏提取， GC-MS 檢測回收率為 84.8%103.2%。（衛碧文等， 氣相色譜-質譜法分析食品包裝材料中雙酚A. 分析實驗室， 2009， 28（1）： 107-109.）（2）加速溶劑萃取法 王利兵等將樣品粉碎后，放入萃取池加速溶劑萃取，系統壓力為 9.6 Mpa， 溫度：80 ， 加熱時間：5min，以二氯甲烷作提取劑 ，靜態循環 3 次 ，在 40下減壓旋轉蒸發濃縮， 以丙酮定容到 5 mL， 經乙酸酐衍生化，經 GC-MS 檢測分析，回收率為 78.9%101.1%，方法靈敏度高，重復性好。 （王利兵等. 加速溶劑萃取-GC-MS 法測定食品接觸

15、材料中雙酚A、雙酚 F 及其衍生物的殘留量. 包裝工程， 2011， 32（15）： 53-57.） 食品內容物前處理方法：（1）直接提取法 周強等將牛奶樣品加入乙腈，超聲 30 min，過濾取濾液加入 10 mL 異丙醇，40 水浴，加入乙酸乙酯離心，重復操作 1 次，合并乙酸乙酯液，旋轉蒸發濃縮， 用 1 mL 甲醇定容待檢。（周強. 液相色譜-電噴霧電離串聯質譜法測定牛奶中雙酚A. 糧油加工， 2010， 12（7）： 145-147.）（2）固相萃取法 王浩等取植物油用正己烷定容超聲提取 10 min，通過 10 mL 甲醇-丙酮活化的 SPE柱進行富集純化，再用二氯甲烷-甲醇（455

16、5）溶液洗脫， 經氮吹后以 3 mL 甲醇定容檢測。（王浩等. 液相色譜-質譜聯用技術檢測植物油中的雙酚 A 殘留. 糧油加工， 2010， 12（3）： 13-15.）（3）其他方法: 超聲萃取，固相微萃取等。 雙酚A的檢測方法 雙酚 A 的分析方法主要有高效液相色譜、極譜法、熒光法、酶聯免疫吸附分析法、電化學分析法、拉曼光譜法及液相色譜-串聯質譜法等。（1）熒光法 熒光法是利用雙酚 A 本身的光譜特性進行測量， 但需要加入適量的 -環糊精使其熒光強度增強但是不改變其本身的特性。 余宇燕等建立了用 -環糊精包被雙酚 A 定量檢測食品包裝材料中雙酚 A 的方法， 在 pH 4， 波長 ex/e

17、m = 282/318 nm 時， 檢出限為 0.12 ng/mL， 線性范圍為 110 ng/mL， 回收率為 98%102%。 本法檢測靈敏、準確、快速簡便。（2）色譜法及色譜-質譜連用技術 目前對 BPA 分析檢測的色譜法主要有：氣相色譜-質譜聯用法，高效液相色譜法，液相色譜-質譜聯用法。唐熙等將樣品用模擬浸泡液經SPE 富集，五氟丙酸酐衍生后用 GC-ECD 檢測，最低檢出限為 0.2 ng/mL，在 0.250 ng/mL的線性范圍內，相關系數 r = 0.9994。（田泉，食品及包裝材料中雙酚A的檢測方法. 中國食品學報, 3: 156-162.）3.2.2 鄰苯二甲酸酯類主要用作

18、塑料增塑劑，添加到高分子聚合物中以增強材料的柔韌性和拉伸性；還可用作殺蟲劑、化妝品及合成橡膠等產品的添加劑。通過呼吸、皮膚接觸、飲用水、食物等進入人體，食品加工過程和食品儲存過程中也容易受PAEs的污染。 塑料包裝中的PAEs可向食品中遷移，其遷移與接觸面積、遷移溫度及時間呈正相關，在人體內蓄積會對人體的生長發育造成危害，引起畸形、內分泌失調、生殖系統病變等不良后果。在蔬菜、土壤、水產品、人體精液等物質中已檢出鄰苯二甲酸二-2-乙基已酯。 鄰苯二甲酸酯類檢測方法PAEs的檢測方法主要有分光光度法、薄層色譜法、氣相色譜法和高效液相色譜法等。目前常用方法為氣質聯用的選擇離子檢測技術；氣相色譜法；反

19、相高效液相色譜法等。反相高效液相色譜法測定PAEs 采用反相高效液相色譜-二極管陣列檢測法同時測定食品中5種PAEs的殘留。流動相為甲醇-水，梯度洗脫，在10min內甲醇由80%線性變化為100%，檢測波長：224nm。5種PAEs的線性相關系數r0.997，RSD在1.2-9.3%之間，回收率在80.9-119.8%。該法用于測定38種食品中PAEs的殘留，檢出率為18.4%，5種PAEs均有檢出，含量在1.03-18.96g/kg之間，定性檢出限為0.79-4.19g/L, 定量檢出限為2.63-13.96 g/L. （徐向華等，鄰苯二甲酸酯的安全性評價及其在食品中的檢測。現代科學儀器，2

20、008, 3: 32-35. ） 3.3 壬基酚簡介 壬基酚是一種重要的化工原料和中間體，主要用于表面活性劑、抗氧化劑、農藥乳化劑、分散劑和潤滑劑等化學產品的生產。近年來壬基酚用于農藥乳化劑生產用量有增長。由于農藥大量施用，導致壬基酚及其降解產物對環境和人體健康造成潛在的危害。壬基酚化學性質穩定，具有生物累積性，表現為與雌激素受體結合，擾亂生物體的內分泌系統，具有致突變和致畸作用，對野生生物和人類產生嚴重的危害，被世界各國列為優先控制的污染物之一。 食品中的壬基酚檢測方法 壬基酚殘留常用的檢測方法有氣相色譜法、氣相色譜-質譜聯用、高效液相色譜法、液相色譜-質譜聯用等。 高效液相色譜-熒光檢測法

21、測定香蕉中的壬基酚 葛洪等以乙腈為溶劑提取香蕉中殘留的壬基酚，提取液用C18固相萃取柱凈化，濃縮的洗脫液用高效液相色譜-熒光法檢測，建立了香蕉中壬基酚殘留的檢測方法。 步驟： 樣品勻漿，加乙腈提取，過濾取上清液，有機相旋轉蒸干，加少量乙腈，過C18固相萃取柱凈化，濃縮的洗脫液用高效液相色-譜熒光法檢測。（葛洪等，高效液相色譜熒光檢測法檢測香蕉中壬基酚殘留. 揚州大學學報，2013, 34(2):86-89.）香蕉中壬基酚測定結果 3.4 有機錫化合物主要是指三丁基錫(TBT)和三苯基錫(TPT)。有機錫化合物在工農業生產中被廣泛用于PVC塑料穩定劑、各種殺蟲劑、除草劑以及海洋船只防污涂料等。研

22、究表明，用于船只防污涂料和殺蟲劑的三丁基錫(TBT)和三苯基錫(TPT)是目前已知內分泌干擾物質中唯一的金屬化合物。 三丁基錫污染食品的途徑三丁基錫主要污染海洋環境，在船舶運行頻繁的海域水體和底泥中其濃度較高，而且可通過食物鏈轉移至魚類等海洋生物體；聚氯乙烯塑料中有機錫也可滲出從而污染食品和飲用水等。在多地出售的海產品如貝類樣品、香螺樣品、魚類樣品中均有三丁基錫檢出。此外由聚乙烯、塑料聚合物和硅樹脂制成的家用商品如尿布、衛生紙和手套等產品中有機錫含量可達g/g級。 三丁基錫的危害是迄今為止通過人為活動引人水環境中最毒的化學物質之一，在濃度很低的情況下，就能引起海洋魚類、甲殼類動物等海洋生物發生

23、累積性中毒或引起可怕的生殖逆向性變化。具有免疫毒性、神經毒性和生殖毒性等，可通過生物富集和食物鏈轉至人體內，或因職業接觸而進入人體從而影響健康。 三丁基錫的檢測方法 將分離技術如氣相色譜、高效液相色譜、毛細管電泳與某些特征檢測技術，如原子吸收光譜、質譜等相結合的聯用技術是目前的發展趨勢。 在色譜-質譜聯用技術中，MS具有靈敏度高、分析速度快、分離和鑒定同時進行等優點，但采用GC進行有機錫的分離測定時，需要經過衍生化步驟，樣品前處理相對復雜，操作繁瑣耗時。與其相比，HPLC聯用技術所需樣品前處理相對簡單，不需要衍生化步驟。 串聯質譜技術可以提供更高的靈敏度，可進行元素化學組成的準確測定，具有極高

24、的分辨能力，能實現寬范圍的檢測，高動態響應范圍。 液相色譜-串聯質譜法測定白酒中三丁基錫和三苯基錫 10mL酒樣經氮吹濃縮至3mL，用甲醇定容到10mL，再經0.22m 有機濾膜過濾。采用ZORBAX Eclipse plus C18色譜柱分離，流動相為體積比60:40的甲醇-0.1%甲酸溶液，流速為0.3mL/min，在正離子模式下采用多重反應監測進行分析。兩組分在3min內完全分離，該方法在1100ng/mL濃度范圍內線性關系良好，相關系數均優于0.9992，TBT和 TPhT的檢測限分別為0.0002ng/mL和0.003ng/mL。在5、20、50ng/mL三個添加水平下回收率在 77

25、.5%92.3%之間，其相對標準偏差均小于10.08%。 (程麗華等，液相色譜-串聯質譜法測定白酒中三丁基錫和三苯基錫. 分析科學學報，2013, 29(4): 511-514)分別準確吸取5種不同類型的白酒樣品10mL，按選定的方法進行分析，根據峰面積外標法定量，計算樣品中有機錫含量，結果見表4。從測定結果可以看出，TPhT和TBT在白酒中均被檢測到，說明TPhT和TBT的廣泛應用已污染到飲用酒。 3.5 食品中雌激素（乙烯雌酚、炔雌醇）的檢測方法 雌激素類藥物在畜禽養殖中具有通過蛋白質同化作用提高食欲的功效,可以用來提高飼料轉化率，促進動物生長。人體一旦食用有雌激素殘留的動物性食品后，就可

26、通過食物鏈擾亂人體內激素平衡，使女性兒童提前發育，男性兒童呈女性化，使男性生殖系統病變及女性乳腺癌發生率上升。 雌激素類檢測方法簡介 乙烯雌酚及其鹽在中華人民共和國農業部公告第235號中被列為禁止使用的藥物，在動物性食品中不得檢出。歐盟于2007年7月在WTO/TBT通報中，規定將全面禁止在食源性動物中使用雌甾二醇17及其衍生物(關于禁止在畜牧業中使用具有激素或甲亢療效物質以及-激動藥的理事會指令96/22/EC的修正)，在動物性食品中不得檢出。 目前檢測雌激素類藥物殘留的方法主要為HPLC法、GC-MS法、LC-MS法、酶聯免疫分析法(ELISA)等。 乙烯雌酚簡介 乙烯雌酚( diethy

27、lstilbestrol，簡寫 DES) 誕生于上世紀40年代，為第一個口服有活性的人工合成雌激素，屬 1, 2- 二苯乙烯類化合物，化學名為 1, 2 -雙( 4 - 羥苯基) -1, 2- 二乙基乙烯，俗名乙底酚，為無色結晶或白色結晶性粉末。 醫學上主要用于治療雌激素缺乏癥，但是由于其具有促進動物生長，增加蛋白質沉積和提高飼料轉化率的作用，曾被部分養殖戶當作促生長劑使用。 自從人們發現通過食物長期攝入低劑量的 DES 能擾亂體內激素平衡，導致女童性早熟，男性女性化，誘發女性乳腺癌等疾病，我國農業部早已明令禁止在畜牧養殖業中使用DES 及其鹽、酯等。目前違規使用 DES 的現象仍時有發生，飼

28、料中含有 DES 和動物及水產食品中 DES 殘留的情況已引起了國內外的高度重視，我國已將其作為魚藥殘留監控的重點對象。 乙烯雌酚的檢測方法 目前水產品中乙烯雌酚殘留量的檢測方法較多，有酶聯免疫測定方法、高效液相色譜法以及液相色譜-質譜聯用法等。 酶聯免疫測定方法需要有乙烯雌酚酶標記物以及己烯雌酚抗體。 采用叔丁基甲基醚、二氯甲烷等有機溶劑提取，C18 固相提取柱進一步純化。液質法設備相對較貴，很多地區不具備條件。目前常用高效液相色譜法對水產品中的乙烯雌酚進行檢測。 魚、蝦中乙烯雌酚殘留的高效液相色譜法測定方法 : ODS - C18 色譜柱，流動相為 0.043 mol/L 磷酸二氫鈉( 調

29、 pH5.0) 甲醇(70:30) ，檢測波長為 230 nm，外標法定量。結果 : 魚類樣品中乙烯雌酚在0.03291g/mL0.1481g/mL范圍內線性良好，r = 0.982164。蝦類樣品中乙烯雌酚在 0.03291g/mL 0.1975 g/mL范圍內線性良好，r = 0.986136。方法評價：回收率為 99.7% 104.4% ; 重復進樣 RSD = 0.81% ( n = 5) ; 方法檢出限為2.5g/kg。 （楊敏等，魚、蝦中乙烯雌酚殘留的高效液相色譜法測定, 中國衛生檢驗雜志，2011, 21(8): 1878-1879.） 取 5.0 g 絞碎魚肉、蝦肉試樣各三份，按制備方法提取，進樣 20L，色譜圖見圖 1，按外標法計算，結果見表 2。 炔雌醇簡介 炔雌醇為3-羥基-19-去甲-17-