1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。REACH法規第四卷譯稿-2-B部分:確定毒性及其他健康效應的化學方法引言：B部分B部份測定方法術語的一般定義急性中毒是被測物在給予一定的劑量在一定的時間內(通常14天)發生有害作用。明顯毒性是用來描述給予測定物一定劑量后發生明顯的作用的通用術語。這對危險評估應該是充分的，而且劑量的增加可使被測物的征兆更加明顯，還可能導致死亡率的上升。劑量是測定物質的數量。劑量被表示成重量(克或毫克)或如測定動物樣品的每單位重量測定物質的重量(例如，每公斤身體重量毫克),或直接用濃度的大小來表示(每公斤食物的百萬分之一

2、或毫克)。識別劑量是不會引起與化合物相關的動物死亡(包括人類的死亡)的水平最高的固定的劑量的四分之一。藥量是一個一般的術語包含劑量，其頻率和持續時間。LD50(半數致死量)是指統計上獲得的，預計引起動物半數死亡的單一劑量。LD50值表達為每單位重量測定動物所含的測定物質的重量術語(毫克/千克).LC50(半數致死濃度)是指能引起一群受試對象50%個體死亡所需的濃度。LC50表示成每一標準的體積空氣中測定物質的重量(毫克/千克).NOAEL是用最大試用劑量或最高暴露標準而沒有觀察到不利作用的縮寫。重復的劑量/亞慢性的毒性是指每天對動物使用一定劑量的藥品或在一段時間內對動物使用一定劑量的藥品所產生

3、的有害作用。最大耐藥力劑量(MTD)是指某實驗總體的一組受試動物中不引起動物死亡的最大藥物劑量。皮膚刺激是在使用測定物質以后皮膚產生激烈的變化。眼睛刺激是在使用測定物質以后眼睛表面產生的變化。皮膚過敏(過敏性皮炎)是皮膚對被測化學物質的反應。皮膚腐蝕是皮膚在使用測定物質之后3分鐘到4個小時后不能再生性還原損害的皮膚組織毒物動力學是對測定物質吸收，分布，新陳代謝和排泄的研究。吸收是被測定的物質進入身體的過程。排泄是被測定的物質和/或它的新陳代謝產物從身體被排出的過程。分布是被測定的物質和/或它在身體里面的新陳代謝產物擴散。（xvv）代謝是被測定的物質由酶或非酶反應在身體中產生化學結構和物理性質的

4、變化過程。B.1.急性-重復劑量/亞慢性及慢性毒性使用多種多樣的毒性測定方法(方法B.1-B.5)跟隨單一劑量,對物質的急性毒性對器官或全身毒性作用進行評估，可以對毒性進行大概的指示。對于物質的毒性，雖然在吸入研究中沒有提及極限測定，但是可以考慮極限測定方式或完整的LD50測試,因為現今還不太可能對單一吸入接觸極限下定義。我們應該考慮使用盡可能少的動物，并且把動物的痛苦減少到最小的程度,比如固定劑量的方法(方法B.1兩步法)和急性毒性級別法(方法B.1三步法).第二項研究可能彌補第一項研究得出的結論。在這種情況下，可能會用一個標準的測定方法或一種對更少的動物采取測定的方法。重復劑量毒性測定(方

5、法B.7，B.8和B.9)包括從重復的實驗中評估毒性作用。為了獲得盡可能多的實驗數據，強調對動物樣品細心的臨床觀察。這些測定幫助識別毒性的目標器官和毒性劑量。另外，在長期的科研中需要進行進一步的深入研究(方法B.26-B.30和B.33)。B.2誘變（性）生殖毒性誘變性指的是細胞或生物的遺傳基因的材料結構或數量上可遺傳的突變的歸納方法。這些變化“突變”可能發生于單一基因或基因片段，一組基因或者整個的染色體。染色體變異可能是結構的或數量的變化。物質的致突變作用,在基本集信息中，通過細菌的基因（點）突變（方法B.13/14）和哺乳動物樣品的結構染色體細胞失常(方法B.10)的體外分析進行評估。在體

6、內程序中也是如此,例如，微核測定(方法B.12)或骨髓細胞分裂中期分析,.(方法B.11)不管用任何辦法,體外方法是無任何禁忌的首選。附加的對誘變性深遠的或現今對致癌性的研究調查是批量生產或管理，進行一個危險評估的需要,這些可用于許多方面:確定在基礎模型中獲得的結果;在基礎模型中沒有涉及到的終點測試，在活體研究中開始或擴充，開始和擴充在體內的研究。為了這些目的，方法B.15到B.25既包括體內和體外真核細胞系統又包括廣泛的生物學終端測試。這些測定提供比細菌模型更復雜的關于點突變的信息和其它終點測試的信息。作為基本原則,考慮進一步研究誘變性的實驗步驟,應該提供有關誘導有機體突變的物質和/或物質的

7、致癌潛在性的附加信息。在實際研究中一種合適的詳細的例證須依據諸多因素,包括物質的化學和物理特性,開始的細菌和細胞學的化驗，物質新陳代謝的簡述,其他的毒性研究結果和已知的物質的用途。選擇固定的測定時間表對于應當考慮到可能的各種因素是不恰當的。一些測定方案總的原則是93/67/EEC制定的,但是一些用于危險評估的詳細的測試方法可以在技術指導文件上查閱，它們是不固定的并且可以根據具體的環境進行調整。進一步的調查的方法列在下面,以其遺傳基因的終點測試為標準:調查基因(點)突變的研究(a)使用真核微生物(啤酒酵母)進行正向和反向突變的研究(方法B.15)(b)體外研究哺乳動物細胞的正向突變,(方法B.1

8、7)(c)黑腹果蠅的伴性-隱性致死測定,(方法B.20)(d)體內體細胞突變測定,小鼠現場測定,(方法B.24)染色體異常研究(a)哺乳動物體內細胞遺傳研究;如果這些研究沒有被包含在初始評估中，體內骨髓細胞的分裂中期分析應該被考慮進去(方法B.11).除此之外,應該探索體內生殖細胞的細胞遺傳性(方法B.23)(b)哺乳動物體外細胞增生研究，如果這沒有被包含在最初的評估中,(方法B.10)(c)嚙齒類動物顯性致死因子的研究,(方法B.22)(d)小鼠遺傳性變異測定,(方法B.25)遺傳性作用對DNA影響遺傳毒性,確認為在遺傳基因的材料上的有害作用未必與誘變性有關,因為其沒有對DNA的傷害直接的證

9、據。以下使用真核微生物或哺乳動物細胞的方法可適當地用于此項調查:(a)啤酒酵母的有絲分裂的重組,(方法B.16)(b)DNA損壞和修復-S期外DNA合成-哺乳動物細胞-體外。(方法B.18)(c)哺乳動物樣品細胞中姐妹染色體交換-體外,(方法B.19)調查致癌潛在性的替代方法哺乳動物細胞的變化分析對于測量物質在細胞培養時對它的形態和行為的誘導是有用的，這和體內惡性腫瘤細胞的遷移有關(方法B.21)。許多的不同細胞類型和標準可能在測試時被用到。哺乳動物遺傳效應的危險評估許多基因（點）突變方法可以用來測量哺乳動物樣品的遺傳效應,例如小鼠特性現場測定,為了測量第一代生殖細胞突變，(不包含在這一個附屬

10、物中),或為染色體變異,例如小鼠可遺傳突變的測定,.(方法B.25)當估計一物質對人遺傳基因的危害的時候,可以用這種方法。然而,這些復雜性的測定及這些測定需要非常大量的動物,特別是實驗需特殊場所，故在實施這些研究時需要充分的論證。B.3致癌物質化學藥品依據作用機制分，可以描述為神經毒性或非神經毒性致癌物質。現在關于神經毒性物質的致癌潛在性信息可能是從誘變性/神經毒性研究獲得。從重復的劑量實驗，亞慢性的或慢性的毒性測定,重復的劑量毒性測定中可獲得附加的實驗數據。方法B.7和比較長的重復劑量研究包括在在重復的劑量毒性測定中觀察以評估生理的變化。例如某些組織的增生應該得到關注。這些研究和毒物動力學實

11、驗數據可能幫助識別化學藥品致癌潛在性,這些可能需要在致癌性測定(方法B.32)或經常的慢性毒性/致癌性的綜合性研究中獲得。(方法B.33)B.4生殖毒性生殖毒性可以用不同的方法檢測。例如男性和女性生殖功能的損害,確認為在生殖力方面的影響,或歸納為后裔不可遺傳的有害的作用，分泌乳汁期間的致畸性和作用也被確認為“發展的毒性“。對致畸性的研究,作為正在發展的毒性測定的部份,測定方法(方法B.31)主要通過口飼途徑。另外，其他的途徑依靠測定物質的物理性質以及人類接觸途徑。在此種情況下，測定方法應該適合應用于28天的測定。第三代的生殖(生殖力)測定是需要的,二代的生殖的測定描述方法(方法B.35),可延

12、伸至第三代。B.5.神經毒性神經毒性可以以不同的方式來檢測，例如中樞或周圍神經系統方面的功能的變化和/或結構的生物化學變化。神經毒性的早期跡象可以從急性毒性測定中獲得。為了獲得很多的實驗數據，必須采用重復劑量毒性測定方法B.7,包括神經毒性作用的評估,仔細的觀察動物樣品的臨床表現。方法應該幫助識別有神經毒性化學藥品，這可能需要對這一個方面進行比較深入的調查。此外，必須著重考慮物質的潛在的引起特定的神經毒性作用，這些潛在的作用在其他的毒性研究中不能被發現。例如,某有機磷物質可延緩神經毒性作用并且可以在方法B37和B.38中被評估。B.6免疫毒性免疫毒性可用多種方法檢測，如免疫抑制劑法和/或超敏反

13、應或應激自動免疫增強信號法。重復劑量毒性測定，B.7方法，包括免疫毒性因子的評估。該方法有助于識別潛在的免疫毒性化學物質，但有待于進一步討論。B.7毒性動力學毒性動力學的研究有利于對毒性的闡述和評價。這些研究是為了通過測定闡明化學藥品毒物的特性以及對未來毒性研究帶來幫助.并不是在每一種情況下所有的參數都要被測定。只有在極少的情況下，整個系統的毒性影響參數（吸收，排泄，分布和新陳代謝）才都需要測定。對于某些特定的化合物來說，這一系列的因素的變化可以是有幫助作用的或者某一特定單獨計量研究可以是很充分的。（方法B.36）關于化學結構和物理化學性質的信息可以通過指定路線的藥劑使用方法和新陳代謝組織分布

14、的可能性來提供關于吸收性質的說明。通過先前有關毒性和毒性擴散的研究，也可以得到的有關毒性控制因素的信息。C.測定物質的性質在任何毒性研究開始前，我們必須了解實驗物質的組成。它包括主要成分的不純程度和包含穩定性在內的物理化學性質。實驗物質的物理化學性質為實驗方法的選擇，每個特定研究的設計和實驗物質的處理和儲存提供了重要信息。在開始實驗前，我們要設計出實驗物質在藥劑介質和生物材料中定性定量分析的方法。所有有關論證，物理化學性質、純度和實驗物質的行為的信息都應在實驗結果報告中給出。D.動物樣品的飼養在毒性實驗中，對飼養環境條件進行嚴格的控制和合適的飼養動物樣品的技術是必須的。(i)飼養環境在實驗動物

15、樣品的籠子中，要提供適合該實驗動物種類生存的環境條件。對于大鼠、小鼠和天竺鼠而言，合適的條件為籠子溫度為223,相對濕度為30%70%；對兔子而言，溫度為203，相對濕度為30%70%。有些技術對溫度的作用特別敏感，在這種情況下，有關合適的測定條件的細節會在實驗方法的描繪中有所說明。在所有關于毒性作用的研究中，溫度和濕度的信息都應被監控、記錄并寫在最終的實驗研究結果報告中。光照條件應被人工控制為12小時白天，12小時黑夜。光照類型的細節應該記錄并寫在最終的研究實驗結果報告中。除非在實驗方法中有特別的說明，動物一般可以分別飼養或把少量的同性別的動物共同飼養；對于共同飼養來說每個籠子中的動物數量不

16、應超過5只。在關于動物樣品的實驗結果報告中，在化學分析和任何結果觀察階段，把關養類型和每個籠子中關養動物樣品的數目交代清楚是很重要的。（ii）喂養條件食物應該滿足被實驗的動物樣品的所有的營養需求。當實驗物質在食物中給動物使用時，食物的營養價值可能因實驗物質與食物成分的相互作用而降低了其營養價值。在得出實驗結果時，這種相互作用的可能性應該被考慮。可以不斷地提供飲用水來組成實驗室的便利食品。在用這種方法是用實驗物質時，食物的選擇可能為確定某種實驗物質的某種特定狀態的需要而被影響。已經確認能夠產生毒性影響的食物污染物不應該作為干擾因素。E.動物樣品的保護當設計實驗方法時，我們必須考慮如何減輕動物痛苦

17、的問題。下面將給出一些例子，但并不全面。準確的說明或條件應該能在方法的全文中找到：對于急性口飼毒性實驗，“固定劑量實驗方法”和“急性中毒分級方法”這兩種方法應被考慮。“固定劑量實驗方法”并不利用死亡作為終點，它使用的動物數量很少。“急性中毒分級方法”使用的動物樣品的數量平均比B.1法少70%。這兩種方法比傳統的方法能造成較少的痛苦。使用的動物數量減少到科學上可以接受的最小的數目。對于方法B.1和B.3來說，每個計量等級只測定同種性別的5只動物；對于用天竺鼠（方法B.6）來做皮膚致敏的測定實驗的最大化的方法，也只有10只動物被使用（只有5只作為陰性對照組）；當測定體內的突變性時用作陽性控制組所需

18、的動物量也減少了。（方法B.11和方法B.12）在實驗過程中應該把動物樣品的疼痛和痛苦減到最小；對非常痛苦的動物應該采取人道主義的方法宰殺；在定量實驗中由于腐蝕或刺激導致顯著疼痛的物質最好不要采用（方法B.1，方法B.2和方法B.3）。不僅在急性中毒實驗（方法B.1,B.2和B.3）,而且在體內的突變性實驗中，用無聯系的高劑量進行測定都應當通過極限實驗的說明來避免。當能夠提供充足的科學證據時，對刺激測定的方案現在允許非行動測定或減少到用單個動物個體的研究。這些科學證據可以基于物質的物理化學性質，即其它有效實驗的結果，或是在體外實驗中獲得的良好結果上。例如,一個皮試急性中毒測定在限制性劑量水平下進行，并且沒有觀察到皮膚敏感度現象，就不需要進行進一步測定了。在皮試過敏測定中確認有腐蝕性或導致嚴重皮膚敏感度的物質（方法B4）不應進一步去做眼睛過敏的實驗。（方法B5）F其它測定方法歐盟的一個科學目標是研究出一種有效的替代技術。它能像現有的動物測定方法一樣提供同水準的信息，卻用很少的動物，引起較少的痛苦甚至完全不用動物。當這種技術變得可行時，就得考慮是否能用來劃分物質的危險性及其其帶來的影響以及用做潛在危險的標識。G實驗結果評價與分析當實驗結果評價與分析時，必須考慮測定結果可以在何種程度