1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。Menke體外產氣法-Menke體外產氣法（Syringe系統）管子（一）基礎知識體外產氣法主要理念通過體外產氣裝置模擬瘤胃發酵體外產氣系統組成體外產氣裝置：產氣管（相當于獨立的瘤胃）、恒溫水浴搖床（模擬瘤胃溫度和蠕動速度）；微生物培養液：由瘤胃液與人工唾液按1:2的體積比混合，攪拌均勻而成影響實驗成敗的主要因素實驗過程中產氣裝置的溫度，整個操作過程的厭氧狀態、微生物活力是影響實驗成敗的關鍵（二）試驗前準備試配產氣管=1*GB3更換注入口處老化的塑膠管；=2*GB3試配外管和內塞，要求推拉自如又不過松（

2、現已將可匹配的外管和內塞統一編號，依號裝配即可）。稱量樣品=1*GB3產氣管編號；=2*GB3用自制的帶長柄的稱量紙，準確稱取待測樣品約200mg（DM），置于體外產氣管底部，注意不要讓樣品進入產氣管注入口和沾染30ml以上管壁；=3*GB3樣品稱取完畢后，管塞上均勻涂抹凡士林，將管塞塞回對映的外管，扣好夾子。配制原液正式實驗前一天，配制好人工唾液中的微量元素溶液（A液）、緩沖液（B液）、常量元素溶液（C液）和刃天青溶液（D液）（可過量配制，常溫下存放，配制方法見附表1）。其它=1*GB3調試恒溫水浴搖床的溫度至390.5，搖動速度510轉/min，如果使用兩個恒溫水浴搖床要求兩者溫度和搖動速

3、度盡量一致，另外還需要將一多聯水浴鍋溫度調至390.5（以實際量取溫度為準）；=2*GB3準備二層、四層、六層紗布各2-4塊（紗布可重復使用）；=3*GB3貯備兩瓶熱水，準備收集瓶（收集和過濾瘤胃液用）、水桶、溫度計，以備次日取瘤胃液用。（三）正式試驗配制人工唾液=1*GB3將恒溫水浴搖床、多聯水浴鍋打開后；=2*GB3計算人工唾液需要量：體外培養時每根產氣管內微生物培養液的體積是30ml（10ml瘤胃液和20ml人工唾液），依據試驗設計的產氣管數計算人工唾液和瘤胃液的需要量（預留20%，以備操作手法不當造成浪費）；=3*GB3配制還原劑（E液，見附表1）；=4*GB3按附表2的順序和比例將配

4、制好的各原液混合后，置入水浴搖床或水浴鍋內，通入CO2氣體（氣流不易過大），使人工唾液由藍色轉變為粉紅色，最終為無色。采集與處理瘤胃液為方便讀取12h產氣量，瘤胃液最好在7:30前取回。所取瘤胃液為早飼前2h瘤胃液。=1*GB3到牧場后，將熱水倒入水桶，調節水溫度至390.5，用于瘤胃液保溫（應經常用熱水調節）；=2*GB3用真空泵抽取三只湖羊的瘤胃液，混合，倒入收集瓶（注意蓋上瓶蓋，以防氧氣對微生物的影響）；=3*GB3回到實驗室后，將收集瓶置于水浴鍋內，四層紗布過濾（應盡量快，以保持微生物的活力），獲得的濾液用CO2氣體飽和；=4*GB3用量筒量取所需量的無色人工唾液和瘤胃液混合，不間斷地

5、通入CO2氣體。吸取微生物培養液用空的產氣管吸取微生物培養液30ml，通過三通管推入已經裝有樣品的產氣管。記錄初始微生物培養液量排氣過程：將注入口處夾子打開的同時，用手下拉管塞，以防樣品沖入塑膠管；搖晃產氣管使樣品與瘤胃液混合后，旋轉管塞，排出管內空氣；讀數：將產氣管豎直，注入口向下，讀取刻度。排氣后的產氣管應隨機置于恒溫水浴搖床內培養（搖床在操作過程中處于搖動狀態，以免溫度上升）。空白對照和標準對照實驗過程中要有至少3個空白對照和3個標準干草對照（樣多時，對照一定要多，尤其是空白對照）。空白對照不加樣品直接加入30ml微生物培養液，標準干草對照以200mg（DM）干草（優質的過80目篩的羊草

6、）為底物，加入30ml微生物培養液。為了消除操作順序和恒溫水浴搖床條件的差異，要求空白對照和標準對照平均分布于試驗前期、中期和后期，放置于水浴搖床的不同位置。整個過程要盡量快，特別是吸培養液和排氣，最好不要超過15min記錄產氣量培養2、4、6、9、12、24、36、48、72、96h時（試驗樣品為粗料，一般培養到72h或96h；精料一般培養到24h或48h即可終止培養，若要計算產氣常數，一般要72h），記錄產氣管的刻度讀數（讀數時輕搖產氣管，旋動管塞后讀數，讀數時，以管塞刻度的中部為準）。如果產氣量過多，下一時間點產氣量可能超出刻度范圍，則需放氣，其操作與排氣相同。產氣量計算（管子）式中，G

7、Pt為樣品在t時刻的產氣量（ml）；Vt為樣品發酵t小時后，產氣管刻度讀數（ml）；V0為樣品在開始培養時產氣管刻度讀數（ml）；W為樣品干物質重（mg）；GP空白為空白對照在t時刻的產氣量，其計算方式與GPt一致。重復試驗要求體外產氣試驗至少培養兩次，兩次標準干草產氣量相對偏差小于10%（若標準干草產氣量與實驗室積累的平均值29.5相差太大，應考慮重作，檢查動物狀況）。(四)樣品采集測定項目取樣時間取樣部位取樣量重復數處理保存溫度VFA實際需要上清液1ml-加入0.2ml8.2%偏磷酸，20000g離心10min4NH3-N24或48h混合液5ml-20MCP24或48h混合液24ml-20

8、附表1：人工唾液原液配制表A、微量元素溶液：CaCl2.2H2O13.2g;MnCl2.4H2O10.0g;CoCl2.6H2O1.0g;FeCl3.6H2O8.0g;加蒸餾水至100mlB、緩沖液：NH4HCO34.0g;NaHCO335.0g;加蒸餾水至1000mlC、常量元素溶液：Na2HPO4.12H2O9.45gKH2PO46.2gMgSO4.7H2O0.6g加蒸餾水至1000mlD、0.1%刃天青溶液：100mg刃天青溶解于100ml蒸餾水E、還原劑溶液（現用現配）：1MNaOH4.0mlNa2S9.H2O625mg加蒸餾水95ml附表2：人工唾液配制表（1000ml）順序原液體積

9、（ml）1蒸餾水520.22微量元素溶液（A液）0.13緩沖液（B液）208.14常量元素溶液（C液）208.150.1%刃天青溶液（D液）1.06還原劑溶液（E液）62.4嘌呤法測定體外微生物蛋白產量標準曲線制備樣品處理5、15、25、35、45、55mg酵母90-95水浴1h加入2ml0.6MHClO48ml發酵液420000g20min沉淀2.104ml0.6MHClO4加入冷卻加入6ml28.5mMNH4H2PO490-95水浴15min冷卻43000g10min上清液1.6ml加入6ml0.2MNH4H2PO4用85%磷酸調整溶液pH為23溶液3.8ml加入0.2ml0.4MAgNO

10、35避光、過夜43000g10min沉淀4.5mlpH=2的蒸餾水沖洗43000g10min沉淀加入5ml0.5MHCl90-95水浴30min43000g10min上清液0.5MHCl稀釋40倍0.5MHCl作參比260nm下比色（一）操作流程圖（二）試劑配制及具體操作1、試驗試劑A0.2M磷酸二氫銨23g磷酸二氫銨溶解于700ml蒸餾水，定容至1000mlBpH=2的蒸餾水在蒸餾水中加少許硫酸至pH=2C0.4M硝酸銀準確稱取1.6987g硝酸銀，溶解于15ml蒸餾水中，待完全溶解后定容至25ml。溶液需用棕色瓶存放，避光保存，并外覆不透光的黑紙D0.5M鹽酸用蒸餾水稀釋10ml鹽酸（37

11、%）至240mlE28.5mM磷酸二氫銨用蒸餾水稀釋100ml0.2M磷酸二氫銨至700mlF85%磷酸G0.6M高氯酸用蒸餾水稀釋10ml高氯酸（70%，12M）至200ml2、測定步驟A酵母RNA標準曲線的制作:分別稱取5、15、25、35、45、55mg酵母RNA于10ml離心管中，并加入2ml0.6MHClO4，于90-95水浴1小時，冷卻；再分別加入6ml28.5mMNH4H2PO4，于90-95水浴15min，冷卻后在3000g，4條件下離心10min；取1.6ml上清液，向上清夜中加入6ml0.2MNH4H2PO4溶液，并用85%磷酸調整溶液pH為23（一般需85%磷酸25l）；

12、取調整pH值后的溶液3.8ml，并向其中加入0.2ml0.4MAgNO3，混合，于5條件下避光、過夜；過夜后于3000g，4條件下離心10min，棄上清液；用4.5mlpH=2的蒸餾水沖洗沉淀；再于3000g，4條件下離心10min，棄上清液；向沉淀中加入5ml0.5MHCl溶液，混勻，在90-95條件下水浴30min后，以3000g離心10min；上清液用0.5MHCl稀釋40倍后，以0.5MHCl溶液作參比，在260nm下比色，根據光密度值作出標準曲線。B培養液中微生物蛋白質的測定:取8ml均勻發酵液于3個10ml離心管，在20000g，4條件下離心20min；棄上清液后加入2.104ml

13、0.6MHClO4，于9095水浴1小時，冷卻；按照制作標準曲線的步驟-操作；以0.5MHCl溶液作參比，在260nm下比色，根據光密度值和標準曲線求出RNA測定值；根據下面公式計算微生物蛋白氮產量：微生物蛋白氮（mg/ml）=RNA測定值（mg/ml）RNA含氮量稀釋倍數細菌氮中RNA含氮量其中，RNA含氮量為17.83%，細菌氮中RNA含氮量為10%。浙江大學奶業科學研究所比色法測定培養液氨態氮濃度標準曲線制備樣品處理0.4ml標準系列溶液加入=1*GB35ml發酵液3500-4000rpm10min2ml上清液8ml0.2MHCl加入取0.4ml混合液=2*GB3加入2mlE液搖勻、靜置

14、10min0號管液作參比700nm下比色搖勻2mlD液保存液工作液（一）操作流程圖（二）試劑配制及具體操作1試驗試劑A0.2M鹽酸溶液將18ml濃鹽酸用蒸餾水稀釋到1000mlB14%水楊酸鈉溶液稱取14g水楊酸鈉，用蒸餾水溶解，定容至100mlC0.3M氫氧化鈉溶液1.2g氫氧化鈉用蒸餾水溶解并定容至100mlDD液稱取0.08g亞硝基鐵氰化鈉溶解于100ml14%水楊酸鈉溶液中EE液量取2ml次氯酸鈉溶液（商品名安替福明，含活性氯5.2%），混于100ml0.3M氫氧化鈉溶液中搖勻2測定步驟A、氨氮標準系列溶液制備準確稱量0.382g氯化銨，用0.2M鹽酸溶解，并定容到100ml，作為保存

15、液，在冰箱中可存放數月。取保存液10ml，用蒸餾水稀釋定容至100ml，為工作液。含氮量為10mg/100ml。取工作液0、1、2、4、6ml置于5個編號的50ml容量瓶內，接著分別加入蒸餾水10、9、8、6、/4ml，使之都成為10ml，再用0.2M鹽酸定容。這就是每100ml中含氮量為0、0.2、0.4、0.8、1.2mg的標準系列溶液。B、比色與計算準確量取標準系列溶液0.4ml分置于5個10ml試管內，各管中再依次加入D液和E液2ml，搖勻，靜置10分鐘后比色。波長700nm，0.5cm的比色皿，用不含氮的0號管液作空白對照。記錄各消光值。用消光值作自變量，溶液含氮量作從變量導出回歸方

16、程式。樣品處理：取5ml瘤胃培養液在3500-4000轉/分下，離心10分鐘，量取2ml上清液（若含氮量較高，可取1ml上清液再加1ml蒸餾水），置于15ml試管內，再加入8ml0.2M鹽酸至10ml搖勻（稀釋倍數為5或10）。比色操作同：準確量取各溶液0.4ml置于10ml試管內，各管內再依次加入D液和E液2ml，搖勻，靜置10分鐘后比色。波長700nm，0.5cm的比色皿，用不含氮的0號管液作空白對照。記錄各消光值。把測得的消光值代入回歸公式，計算的結果乘以樣品稀釋的倍數就是原樣中氨氮的含量。浙江大學奶業科學研究所體外發酵產物中揮發性脂肪酸濃度的測定單標測定乙、丙、丁酸各自保留時間混標制備

17、標準曲線樣品中乙、丙、丁酸濃度測定（一）操作流程圖（二）試劑配制及具體操作1混標制備按表1或表2中梯度，配制6個梯度的混合標樣，用于制作標準曲線。表1乙酸、丙酸和丁酸混合標樣的配制（umol/ml）123456乙酸10204080160320丙酸12481632丁酸12481632表2乙酸、丙酸和丁酸混合標樣的配制（ul/ml）123456乙酸0.5711.1432.2854.5709.14018.280丙酸0.0750.1490.2990.5981.1962.390丁酸0.0920.1840.3670.7351.4702.9392上機測定色譜柱HP-INNOWAX（19091N-133）毛細

18、管柱，30m0.25mm0.25m氣化室溫度200檢測室溫度220柱溫采用程序升溫，80持續1min后，以15/min升溫至170后維持1.5min載氣及流速載氣為高純氮，壓力為100kpa，總流量63.8ml/min，柱流量1.19ml/min，分流比50，吹掃流量3ml/min，循環流量30ml/min檢測室氣體流速H2流量40ml/min，空氣流量400ml/min進樣量2l浙江大學奶業科學研究所發酵氣體中甲烷含量的測定（一）標準曲線建立用10l的微量注射器分別抽取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0l的甲烷標準氣，上機，根據甲烷的濃度和其峰面積的關系，確定甲烷的標準曲線。由于

19、在測定發酵氣體時取樣量是20l，故設定1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0l的甲烷標準氣的濃度分別為5、10、15、20、25、30%。（二）上機條件色譜柱HP-INNOWAX（19091N-133）毛細管柱，30m0.25mm0.25m氣化室溫度100檢測室溫度120柱溫80載氣及流速載氣為高純氮，壓力為179.5kpa，總流量46.2ml/min，柱流量2.7ml/min，分流比15，吹掃流量3ml/min，循環流量30ml/min檢測室氣體流速H2流量40ml/min，空氣流量400ml/min進樣量20l浙江大學奶業科學研究所壓力讀取式體外產氣法（RPT系統）產氣瓶（一）基礎

20、知識體外產氣法主要理念通過體外產氣裝置模擬瘤胃發酵體外產氣系統組成體外產氣裝置：產氣瓶（相當于獨立的瘤胃）、恒溫培養箱（模擬瘤胃溫度）；微生物培養液：1:9的瘤胃液與人工唾液；壓力傳感器；PC影響實驗成敗的主要因素實驗過程中產氣裝置的溫度，整個操作過程的厭氧狀態、微生物活力是影響實驗成敗的關鍵（二）操作流程圖（三）試劑配制及具體操作微生樣品39培養=1*GB3加入90ml人工唾液=2*GB3加入10ml瘤胃液2、4、6、9、12h讀取瓶內氣體壓力微量進樣器吸取20l氣體測定CH4，放氣24或48h讀取瓶內氣體壓力微量進樣器吸收20l氣體測定CH4，放氣=1*GB3=2*GB31ml上清液VFA

21、3個1ml混合液5ml混合液30ml混合液加入0.2ml8.2%偏磷酸420000g10min4保存物NH3-NMCP-80保存-20保存-20保存1、試驗前準備稱量樣品=1*GB3產氣瓶編號（因為產氣量的計算涉及瓶子體積，所以盡量保留原產氣瓶編號，使用新瓶時要量取瓶子體積）；=2*GB3加入磁力棒；=3*GB3準確稱取待測樣品一般約750mg（DM，適用0.5-1.5mgDM），置于體外產氣瓶底部。配制人工唾液=1*GB3計算人工唾液需要量：體外培養時每個產氣瓶內人工唾液的量為90ml，瘤胃液10ml，依據試驗設計的產氣瓶數計算人工唾液和瘤胃液的需要量（預留20%，以備操作手法不當造成浪費）

22、；=2*GB3配制人工唾液中的微量元素溶液（A液）、緩沖液（B液）、常量元素溶液（C液）、刃天青溶液（D液）（可過量配制，常溫下存放）和還原劑（E液，現用現配，見附表1）。=3*GB3按附表2的順序和比例將配制好的各原液混合后，置入水浴搖床或水浴鍋內，通入CO2氣體（氣流不易過大），使人工唾液由藍色轉變為粉紅色，最終為無色。分裝人工唾液不間斷地將CO2通入人工唾液瓶，用100ml注射器或產氣管吸取人工唾液90ml，注入稱有樣品的產氣瓶，并用CO2飽和（可通過三通管完成兩路CO2的同時輸入）。蓋緊橡膠塞后，390.5恒溫培養箱內過夜（對于青貯類等含酸較多的樣品，一定要過夜，而且在正式培養前將里面

23、所產氣體排空，不計入產氣量）。其它=1*GB3準備二層、四層、六層紗布各2-4塊（紗布可重復使用）；=2*GB3貯備兩瓶熱水，準備收集瓶（收集和過濾瘤胃液用）、水桶、溫度計，以備次日取瘤胃液用。2、正式試驗采集與處理瘤胃液為方便讀取12h產氣量，瘤胃液最好在7:30前取回。所取瘤胃液為早飼前2h瘤胃液。=1*GB3到牧場后，將熱水倒入水桶，調節水溫度至390.5，用于瘤胃液保溫（應時經常熱水調節）；=2*GB3用真空泵抽取三只湖羊的瘤胃液，混合，倒入收集瓶，蓋好蓋子；=3*GB3回到實驗室后，將收集瓶置于水浴鍋內，依次用二層、四層和六層紗布過濾（應盡量快，以保持微生物的活力），獲得的濾液不間斷

24、地通入CO2氣體；=4*GB3將密封的產氣瓶從恒溫箱中取出，用6.5號針頭將產氣瓶中多余氣體放盡；=5*GB3用20ml注射器吸取瘤胃液10ml，通過另一16號針頭注入產氣瓶，將兩根針頭取下，產氣瓶置于390.5恒溫箱中培養。空白對照和標準對照實驗過程中要有至少3個空白對照和3個標準干草對照。空白對照不加樣品只有90ml人工唾液和10ml瘤胃液，標準對照以750mg（DM）干草（優質的過80目篩的羊草）為底物，加入90ml人工唾液和10ml瘤胃液。為了消除操作順序和恒溫培養箱條件的差異，要求空白對照和標準對照平均分布于試驗前期、中期和后期，放置于培養箱的不同位置。記錄產氣量培養2、4、6、9、

25、12、24、36、48h時，如果條件允許可延長培養時間，培養粗料時，至少96h或更長（有人培養一周），用壓力傳感器讀取產氣瓶內壓力（輕拿、輕放），并放氣。要求：使用壓力傳感器前，熟練軟件的操作（有模擬程序可供練習）產氣量計算（瓶子）式中，GPt為樣品在t時間段的產氣量（ml）；Pt為t時間段讀取的壓力（mPa）；V0為瓶子體積；101.3為標準大氣壓（mPa）；W為樣品干物質重。產氣過程的總積累產氣量為各時間段產氣量之和。瘤胃發酵樣品制備=1*GB3培養中途取樣時，要求取樣同時，向產氣瓶內通入CO2，并于39水浴中操作;=2*GB3取混合液（發酵液及固體殘渣）時要求在控溫磁力攪拌機上操作。重復

26、試驗要求體外產氣試驗至少培養兩次，兩次標準干草產氣量相對偏差小于10%。附表1：人工唾液原液配制表A、微量元素溶液：CaCl2.2H2O13.2g;MnCl2.4H2O10.0g;CoCl2.6H2O1.0g;FeCl3.6H2O8.0g;加蒸餾水至100mlB、緩沖液：NH4HCO34.0g;NaHCO335.0g;加蒸餾水至1000mlC、常量元素溶液：Na2HPO4.12H2O9.45gKH2PO46.2gMgSO4.7H2O0.6g加蒸餾水至1000mlD、0.1%刃天青溶液：100mg刃天青溶解于100ml蒸餾水E、還原劑溶液（現用現配）：CysteineHCl625mg蒸餾水95m

27、l1MNaOH4.0mlNa2S9.H2O625mg附表2：人工唾液配制表（1000ml）順序原液體積（ml）1蒸餾水520.22緩沖液（B液）208.13常量元素溶液（C液）208.14微量元素溶液（A液）0.150.1%刃天青溶液（D液）1.06還原劑溶液（E液）62.4瘤胃液脂肪酸測定1ml樣品85水浴30min=1*GB3加入0.67ml5MNaOH=2*GB3加入一滴飽和甲基橙指示劑=3*GB3充滿N2冷卻=1*GB3加入0.67ml5.1MHCl=2*GB3加入1ml2mg/mlC17：0=3*GB3充滿2.5ml氯仿/甲醇渦旋2min2000g10min下層溶液過硫酸鈉干燥柱收集

28、下層氯仿N2吹干1.0ml正己烷懸浮2000rpm10min-20凍存上機測定（一）操作流程圖（二）試劑配制及具體操作1、樣品處理=1*GB3.取1ml樣品于帶蓋的水解管，加入0.67ml5MNaOH和一滴飽和甲基橙指示劑后，充滿N2；=2*GB3.85水浴30min，冷卻至室溫后，加入0.67ml5.1MHCl,使溶液pH低于2（溶液由橙色變為紅色），如果不確定，可以用pH計檢測；=3*GB3.加入1ml2mg/ml的內標C17：0；=4*GB3.加入2.5ml氯仿/甲醇（2:1,v/v）后，渦旋2min；=5*GB3.將樣品在2000g下離心10min；=6*GB3.移去上層甲醇/水層，輕

29、輕撥開中間雜質層，將下層溶液無損失轉移；=7*GB3.通過含硫酸鈉的干燥柱將下層氯仿濾入另一玻璃容量管；=8*GB3.用氮氣將樣品吹干；=9*GB3.用1.0ml正己烷懸浮后，簡單渦旋；=10*GB3.2000rpm下離心10min，樣品-20冷凍保存。2、上機條件色譜柱HP-INNOWAX（19091N-133）毛細管柱，30m0.25mm0.25m氣化室溫度260檢測室溫度270柱溫采用程序升溫，140持續5min后，以4/min升溫至240后維持20min載氣及流速載氣為高純氮，壓力為100kpa，總流量87.9ml/min，柱流量0.84ml/min，線速度：25.6cm/sec，分流

30、比100，吹掃流量3ml/min，循環流量30ml/min檢測室氣體流速H2流量40ml/min，空氣流量400ml/min進樣量產氣管，2l；產氣瓶4l浙江大學奶業科學研究所Real-timePCR測定瘤胃微生物數量一、樣品采集Invitro實驗終止時，若分析混合微生物，可取1ml混合培養液于1.5ml滅菌離心管(也可直接用滅菌過的含0.3g0.1mm和0.1g0.5mm鋯珠的2ml螺口管)-80度保存待用。若要分別分析固、液相微生物時，將混合培養液過40um尼龍袋，濾液于4度500g離心10，上清用于液體微生物DNA提取。尼龍袋于39度滅菌水中沖洗至澄清用吸水紙吸干水份，-80度保存用于固

31、相微生物DNA的提取。InSacco方法與此相似。二、總DNA的提取1試驗材料：1.5mLEP管、螺口管、鋯珠、1mL、200uL、20ul槍頭（均需滅菌）、渦旋器、高速離心機等。2所需試劑：NaOH、Tris堿、EDTA二鈉、NaCl、Tris飽和酚、氯仿、異戊醇、冷乙醇。3.溶液配制方法：試劑方法A10MNaOH稱取40gNaOH，加到100mL水中。無需除菌。B5MNaCl稱取29.22gNaCl，加水溶解定容至100mL。C1M，pH8.0Tris-HCl稱取12.114gTris堿，加80mL水，用濃鹽酸調pH至8.0，加水定容至100mL。D0.5M，pH8.0EDTA將18.61

32、gEDTA-Na.加入80mL水中，在磁力攪拌器上劇烈攪拌。用10N的NaOH調節溶液的pH值至8.0，加水定容至100mL。ETE緩沖液（10mMTris-HCl，1mMEDTA，pH8.0）吸取1mL1M的Tris-HCl和0.2mL0.5M的EDTA，加水定容至100mL。FTN150(10mMTris-HCl;150mMNaCl，pH8.0)1ml1M的Tris-HCl和3ml5MNaCl,加水定容至100ml。GTris飽和酚(pH8.0)購買H24：1的氯仿異戊醇240mL氯仿+10mL異戊醇I無水乙醇-20度保存。J70%乙醇70mL無水乙醇加30mL水-20度保存。4提取步驟：

33、液相微生物：冰上解凍樣品后于4度20000g離心5min，棄上清液。加入1mLTN150懸浮沉淀，再加150L的Tris飽和酚，Bead-beater勻漿（4600g，2min），冰上兩分鐘冷卻，重復三次。固相微生物：稱取0.35g固體培養物于2ml螺口管，再稱0.3g0.1mm和0.1g0.5mm滅菌過的鋯珠。加入1mLTN150，150L的Tris飽和酚，Bead-beater勻漿（4600g，2min），冰上冷卻兩分鐘，重復三次。以下步驟相同(2)加入150L氯仿異戊醇，渦旋混勻。20000g離心5min，上清液轉至已1.5mLEP管中。(3)加入150L氯仿異戊醇和150LTris飽和

34、酚，渦旋混勻1min，10000g離心1min，上清液轉至1.5mLEP管中。(4)重復上述步驟直至水相和有機相之間的界面清晰為止(一般需3-5次)。上清液轉至1.5mLEP管中。(5)加入300L氯仿異戊醇，渦旋混勻1min。10000g離心1min，準確量取上清液轉至1.5mLEP管中。(6)加入2倍上清體積的冷無水乙醇及1/10倍上清體積的5MNaCl，渦旋混勻，-20C沉淀DNA2小時（或30min以上）。10000g離心10min，棄上清。(7)加入500L70冷乙醇洗滌沉淀，10000g離心5min，棄上清，重復三次，風干沉淀。(8)加入50-100LTE緩沖液溶解DNA。提取的D

35、NA部分用于紫外分光光度計測OD值，其余-20C保存。(9)DNA質量檢測：紫外分光光度計測OD值濃度計算：DNA（ngul）OD26050稀釋倍數純度：OD260OD280為1.8-2.0，若低于此值，則可能有蛋白污染。完整性：取5L+1uL上樣緩沖液作0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(DNA與上樣緩沖液比例為5：1)。三、Real-timePCR操作步驟(ABI7500)：1.稀釋DNA模板至0.5或1ng/ul。2.按所測微生物種類及樣品數量計算出所需試劑量：(由于我們現階段用的還是相對于總菌的定量，每一樣品所測菌都要求對應一個總菌，所以同一樣品最好在同一塊板上同時測出所有菌，一方面可以減少試

36、劑用量，另一方面也可以減少板與板之間的差異。每一樣品設三個復孔)。舉例：測包括總菌在內的5種菌時，一個96孔板可以測的樣品數為：3復孔*5種菌*6個樣+5種菌陰性對照=95孔，或3復孔*6種菌*5個樣+6種菌陰性對照=96孔，最大限度地利用96孔板)。以TaKaRa(DRR041A)SYBRPremixExTaq試劑盒為例：試劑使用量ulN+1個反應X種菌SYBRPremixExTaq(2)1010.410.4(N+1)需X*(N+1)個混合液，除引物不同，其余都相同，冰上操作。(*ABI7500需用ROXII校正)ROXII(50)*0.4上游引物(10uM)0.40.4(N+1)下游引物(

37、10uM)0.40.4(N+1)水6.86.8(N+1)=18*(N+1),分裝為N個孔，每孔18ul模板(0.5或1ng/ul)2總體積20分裝完之后，小心撕開real-timePCR專用光學透明膜覆蓋于96孔板上，用刮板將膜刮緊密封在96孔板上，以防液體蒸發。稍作離心。3.反應程序按如下程序進行：四、ABI7500型熒光定量PCR儀操作指南1.開機(1).確認電腦與主機的數據通訊線(灰色USB連線)連接正確。(2).確認電腦處于外接電源供電狀態。(3).啟動電腦，進入Windows操作系統。(4).待桌面圖標出現后，打開ABI7500主機的電源。(5).待主機的電源指示燈點亮后，啟動750

38、0SystemSoftware應用軟件。2.實時定量的軟件運行(1).新建文件菜單CreatenewDocument，Assay選擇AbsoluteQuantification(實時定量模式)，下一步(2).選擇adddetector,或者添加已有的detector到右邊欄，完成，打開一個空白的96孔板文件。.選擇命名孔，雙擊或右擊鼠標，打開WellInspector窗口。(3).首次使用軟件，或者探針（Detector）沒有設置好，請點擊AddDetector按鈕，打開DetectorManager窗口。如果Detector列表中沒有合適的探針，點擊按鈕FileNew，新建探針：設定探針的名

39、稱(建議使用所研究基因符號加標記熒光，如GAPDH_FAM、ACTIN_VIC等)、報告基團(FAM或者VIC)、淬滅基團(TaqMan探針選TAMRA；MGB探針選None)、顏色(任意指定)等。設置完成后點擊OK，該探針即出現在探針列表中。重復此過程，設立其他的探針。(4).在DetectorManager窗口，從探針列表中點擊選擇所需探針，按住Ctrl鍵可以選擇多個探針，再點擊AddtoPlateDocument按鈕。最后點擊Done關閉DetectorManager窗口。此時WellInspector窗口仍然是打開的。(5).填樣品表在96孔表中選定有樣品的一個或多個孔，在WellIn

40、spector頁面的SampleName欄中填入樣品名稱；在探針列表的Use項下的方框中，打鉤選擇要用的一個或多個探針；在Task欄中選擇指定樣品類領：陰性對照選NTC；未知樣品選Unknown；標準品選Standard。對于Standard，還要在Quantity欄中輸入DNA拷貝數。注意：只有在這里輸入拷貝數后，軟件才能自動生成標準曲線。建議標準品的濃度在5點以上。建議每個樣品(包括標準品)都按照統計學要求作一定數量的復管。(6).參比熒光(PassiveReference)選ROX；如果使用的試劑中不含有參比熒光，請選None。完成后點擊右上角的X按鈕，關閉WellInspector窗口

41、。(7).循環參數切換到Instrument頁面，設定及修改PCR熱循環程序：在ABI公司默認的程序中，50C2min是UNG酶起作用的步驟，UNG酶可以預防PCR產物(其中以U代替T)對定量PCR的污染；95C10min的作用是激活金牌Taq酶，同時滅活UNG酶；40個循環的95C15sec和60C1min是定量PCR的循環步驟。7000默認在最后一步，也就是60C1min復性和延伸時收集熒光信號。如果使用ABI公司的定量PCR試劑，上述參數不需要調整，直接運行PCR循環就可以了。在使用其他廠家試劑的情況下，如果其中沒有UNG酶，請刪除50C2min步驟；如果使用的不是金牌Taq酶而是其他普

42、通的Taq酶，請刪除95C10min步驟。如用的是TaKaRa試劑盒，刪除50C2min步驟，95C10min改為95C5秒。(8).循環參數的修改方法刪除：按住Shift鍵并在相應的Stage或Step中點擊，使該步驟被選中變黑，再按Del鍵即可刪除。插入：在需要插入參數的位置點擊，出現粗黑豎線后，分別點擊AddHold、AddCycle或AddStep按鈕添加保溫、循環或循環中的一個步驟。修改溫度和時間：拖動鼠標，選中需要修改的溫度或時間數字，輸入新的數值即可。(9).其他設置：反應體積：定量PCR的標準反應體積是50L；使用96孔板可以用20uL，依所用試劑而定。融解曲線試驗：點擊Add

43、DissociationStage，儀器即在定量PCR循環完成后繼續做融解曲線試驗。如果是采用SYBRGreenI染料方法進行定量研究，建議進行融解曲線試驗，以判定PCR反應特異與否。單峰表示單一的PCR擴增產物，多峰表示PCR擴增有雜帶。注意：只有SYBRGreenI染料方法才需要進行融解曲線試驗，TaqMan探針和MGB探針法都不需要。(10).Save按鈕保存文件設置。確認96孔板或全部樣品管在主機內放置妥當后，點擊Start按鈕，開始PCR循環。屏幕上動態顯示PCR進程和剩余時間。(11).監控進程切換到Results頁面的AmpPlot子頁面，可以實時顯示PCR曲線隨著循環增加而逐步

44、增長的實際情況。可在Detector中選相應的目標觀察。如果選All，則同時顯示所有探針的反應進程。(12).程序結束后，點擊AnalysisSettings中的AutoCt,再點菜單上方向或的綠色箭頭分析結果，保存結果(可以保存為.sds格式，也可以保存為.sdt格式，作為以后同類實驗的模板，節省軟件設置時間)。退出程序，關閉ABI7500主機電源。3.實時定量的數據分析(1).數據分析切換到Result頁面，進入擴增曲線(AmplificationPlot)子頁面，查看軟件已經自動分析好的實驗結果。注意：此時的數據是軟件根據默認值（基線起點為3，終點為15）得到的初步結果，還需要根據本次實

45、驗的具體情況，精細調節Baseline（基線）的起止點后，重新分析，以得到更精確的數據。(2).基線的起點和終點確定原則基線(Baseline)是指PCR開始時信號很低、接近背景且比較平穩的那個階段。起點要避開開始幾個循環由于高溫導致的信號增高，設在信號已經降到背景高度且能維持平穩的地方，一般在3到6個循環之間；終點要避免覆蓋信號已經開始有明顯增長的地方，一般在本組數據中最小的CT值前再3個循環處。另外，起點與終點之間最好能間隔8個循環以上，以滿足統計基線標準偏差的數學要求。調整好起止點以后，再點擊Analyze按鈕，軟件即自動計算新的閾值和CT值，并更新實驗報告。注意：此時擴增曲線頁面上顯示

46、的閾值數字并不更新，但是這不影響后臺數據運算的準確。(3).線性圖譜在默認的設置中，PCR擴增曲線圖譜的縱坐標代表經過ROX和空白校正后的相對熒光信號強度，橫坐標代表PCR循環次數（從1到40）；縱坐標以對數表示，橫坐標以線性表示。如果要看完全線性的S形圖譜，請雙擊縱坐標軸線，打開坐標設置窗口，將縱坐標改成線性形式。(4).原始數據切換到Component子頁面，察看原始數據。正常的SYBR信號強度，中間呈S形增長；ROX信號是水平穩定的，不隨PCR進程而改變，因為ROX是以固定濃度加入到PCR試劑中的，它本身并不參與PCR擴增。(5).原始數據切換到Spectra子頁面，也可以察看原始數據。

47、Spectra與Component這兩個頁面的區別是：Component顯示的是信號強度隨時間(即PCR循環次數)的變化，是縱向的；而Spectra顯示的是每個PCR循環點上信號強度在不同波長上的分布，也就是在4個濾色片上的分布，是橫向的。(6).標準曲線切換到StandardCurve子頁面，察看標準曲線。注意：只有在Setup時輸入標準品的拷貝數后，軟件才能自動生成標準曲線。(7).實驗報告切換到Report子頁面，察看實驗報告。確認無誤后，保存結果。也可以從File菜單中選擇Export，再選擇數據類型，輸出各種類型的數據，包括CT值、相對信號強度、原始數據、融解曲線數據和實驗結果等。輸

48、出的數據可以用Excel打開，并可在Excel中重新生成擴增曲線、標準曲線等圖譜。(8).結果計算：總菌的三個Ct值算平均值，再用其他菌的Ct按如下公式計算：target(%bacterial16SrDNA)=2-(Cttarget-Cttotalbacteria)變性梯度凝膠電泳（DGGE）操作規程一樣品總DNA的提取1試驗前準備材料離心管、螺口管、鋯珠、各式槍頭（均需滅菌）、移液槍、渦旋器、低溫離心機、Bead-beater、玻璃器材、一次性塑料手套試劑Tris、EDTA、TE飽和酚、TE緩沖液、乙酸鈉、氯仿、異戊醇、無水乙醇、NaCl2試劑配制A0.5M，pH8.0EDTA將186.1g

49、EDTA-Na2H2O加入800mL水中，在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用10N的NaOH調節溶液的pH值至8.0，加水定容至1LB1M，pH8.0Tris-HCl稱取121.1gTris，加800mL水，加濃鹽酸42mL調pH至8.0。待溶液冷至室溫后，方可最后調定pH值。加水定容至1LC3M，pH5.2NaAc稱取40.827gNaAc溶于90mL水中，用冰乙酸調至pH5.2后補加水至100mLD氯仿/異戊醇（V/V=24/1）量取氯仿240mL，加入異戊醇10mL，棕色瓶保存備用ETE緩沖液吸取1mL1M的Tris-HCl和0.2mL0.5M的EDTA，加水定容至100mLFTN150緩沖液稱

50、取0.8766g的NaCl，加入1mL1M的Tris-HCl，加水定容至100mLG70冰乙醇量取無水乙醇70mL，加入30mL水，-20保存備用3操作步驟取出在-20下凍存的樣品，室溫解凍。10000g離心5min。棄上清液。沉淀加人1mLTN150緩沖液懸浮，轉移至已加入鋯珠（0.1mm、0.3g）的滅菌螺口管中，再加150L的TE飽和酚，Bead-beater勻漿（5000g，3min），冰上冷卻。加入150L氯仿異戊醇，渦旋混勻。10000g離心5min，上清液轉至新管中。加入150L氯仿異戊醇，和150LTE飽和酚，渦旋混勻1min，10000g離心1min，上清液轉至新管中。重復上

51、述步驟至水相和有機相之間的界面清晰為止。加入300L氯仿異戊醇，渦旋混勻1min。10000g離心1min，上清液轉至新管中。加冷無水乙醇1mL，和50L3MNaAc（pH5.2），渦旋混勻，-20C沉淀DNA（30min）10000g離心10min，棄上清。加入500L70冷乙醇洗滌沉淀，10000g離心5min，棄上清，風干沉淀。加入50-100LTE緩沖液溶解DNA，-20C保存提取的DNA。4注意事項酚是致癌物質，實驗操作應配帶手套，且不要將該溶液灑在桌面上或地面上。試驗中使用了揮發性有毒物質，操作應在通風櫥中進行。試驗過程中樣品應放置冰面上，所有離心操作在4C下進行。二瓊脂糖凝膠電泳

52、檢測DNA1試驗前準備材料瓊脂糖凝膠電泳系統（電泳儀、電泳槽等）、微波爐、凝膠成像系統、錐形瓶、移液槍、槍頭試劑Tris、EDTA、硼酸、Goldviewer染色液、DNAMarker（一般DL2000）、瓊脂糖、6上樣緩沖液、雙蒸水2試劑配制A5TBE電泳緩沖液（pH8.3）Tris54.0g，硼酸27.5g，0.5MEDTA溶液（pH8.0）20mL，加水定容至1L。使用時稀釋為0.5TBE，4保存備用3操作步驟1.2瓊脂糖凝膠的制備將制膠槽、樣品梳等清洗干凈、晾干，梳子插入制膠槽中。稱取0.6g瓊脂糖置于小錐形瓶中，加入50mL0.5TBE電泳緩沖液。在微波爐中加熱溶化至完全溶解成為無顆

53、粒狀的瓊脂糖凝膠液。待冷卻至60-65C，加入3LGoldviewer染色液。搖勻，輕輕倒入制膠槽中，使之形成均勻的膠面，盡量避免產生氣泡。待凝固（30min左右）后，拔掉樣品梳，將制膠槽置于電泳槽中，倒入適量0.5TBE電泳緩沖液，以完全浸沒膠面0.2cm左右為宜。上樣將樣品DNA與6上樣緩沖液以5：1比例混勻，用移液槍上樣。每個樣品槽的進樣量不宜過多，以免溢出后串樣。并記錄上樣順序和進樣量。電泳接通電泳儀和電泳槽的電源（注意進樣孔應在負極），電壓100V，電泳30min左右。觀察和拍照電泳結束后，將凝膠在成像系統下成像，拍照，保存。三細菌16SrDNA片段擴增1試驗前準備材料PCR管、各式

54、槍頭（均需滅菌）、移液槍、鑷子、冰盒、一次性手套試劑PCR反應相關試劑：Taq酶、10PCRBuffer、Mg2+、dNTPs、引物U（U968-GC）、引物L（L1401）、ddH2O2試驗步驟依次在PCR管中加入下列試劑（50L體系、冰上操作）單管量（L）N個（N=反應數1）ddH2O37.7537.75N10Buffer（含Mg2+）55NdNTPs（各2.5mM）44N引物U（10M）11N引物L（10M）11N模板DNA（1-10ng）1依次加入稍離心后，加Taq酶（5UL）0.25L混勻，稍離心用鑷子蓋好PCR管蓋將PCR管放入PCR儀中，設置熱循環程序。如下：945min9430s56.51min30個Cycles721min725min4保存3電泳檢測反應結束，取5L作1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，細菌16SrDNA的V6-V8區的PCR產物片段大小在470bp左右。4注意事項PCR各種試劑置冰上融化（Taq酶先存放在-20），操作應在冰上進行。PCR反應應在一個沒有DNA污染的