1、酶的催化活性和調節機制(1)1主要內容介紹酶是生物催化劑酶的結構與催化功能酶促反應機制酶的調節作用酶活性分析2一、酶是生物催化劑1.1 酶的研究歷史18世紀初，人們注意到胃液能對肉類進行消化，唾液及植物提取物能將淀粉轉變為糖；1837年，Berzelius認為發酵活動由活細胞造成的，首先想到了催化作用；1857年 Pasteur認為酒發酵是酵素催化作用的結果；1878年Kuhne提出enzyme一詞；1894年Fisher提出酶與底物作用的“鎖與鑰匙”學說，用以解釋酶 作用的專一性。31.1 酶的研究歷史1897年Buchner用酵母菌提取液完成發酵，證明了發酵是酶作用的化學本質；1903年H

2、enri提出酶與底物作用的中間復合物學說；1913年Michaelis和Menten提出酶動力學原理和米氏方程式；1925年Briggs和Handane對米氏方程作了修正；1926年Sumner從刀豆中結晶了脲酶，并證明酶是蛋白質，提出“所有的酶都是蛋白質”；1930年Northrop結晶了胃蛋白酶和胰蛋白酶，確定了酶的蛋白質本質；41.1 酶的研究歷史1946年Sumner和Northrop因酶的結晶和對酶的研究獲得諾貝爾化學獎；1965年Blake對溶菌酶結晶進行了X光衍射分析，使該酶活性中心的催化反應機制獲得直接證據；1969年，Gutte和Merrifield用有機合成方法制得核糖核酸

3、酶，并證明酶與無機催化劑作用相同；1982年Cech發現個別RNA具有酶的催化活性，更新了“酶是蛋白質”的概念；1983年Altman和Pace證明RNase P中RNA具催化活性。51.1 酶的研究歷史1986年Lerner首次研制成功了水解羧酸酯的抗體酶（Proc Natl Acad Sci USA, 1986, 83: 6736；Science, 1986, 234(4783): 1566).1994年Joyce發現DNA具有催化活性（chem biol 1994, 1(4): 223-9)。酶的新概念： 酶是生物體內一類具有催化活性和特殊空間構象的生物大分子，包括蛋白質和核酸。61.2

4、 酶的特性酶和一般催化劑的共性：1.用量少而催化效率高；2.能加快化學反應的速度，而其本身在反應前后沒有結構和性質的改變；3.催化劑只能縮短反應達到平衡所需的時間，而不能改變反應的平衡點，酶亦如此。4.降低反應的活化能。71.2 酶的特性 酶作為生物催化劑，還具有以下特點：催化效率高：酶催化反應的速率比非酶催化反應的速率高1081020，比一般催化劑高1071013。催化作用有高度專一性：一種酶只能催化一種或一類反應，作用于一種或一類物質。81.2 酶的特性催化作用要求一定的溫度與pH值：如NH3的合成在植物中由固氮酶來催化，通常在27C和中性pH值下進行。酶易失活：強酸、強堿、高溫等條件都能

5、使酶破壞而完全失去活性。酶的活力受調節控制: 酶活力與輔酶、輔基、底物、金屬離子等密切相關。91.3 酶的組成全酶：酶蛋白與酶活力所需的任何形式輔助因子所組成的完整功能的復合體。輔酶：在酶的催化過程中一類小分子化合物，負責運載底物的電子或基團，與酶蛋白結合松弛，可作為多種酶蛋白的輔助因子，如NAD+、NADP+等。輔基：與輔酶的作用相同，只是與酶蛋白結合緊密，從不與酶蛋白分離，如血紅素、黃素腺嘌呤二核苷酸等。101.3 酶的組成常見的金屬輔助因子酶金屬輔助因子醇脫氫酶、碳酸苷酶、羧肽酶Zn2+磷酸轉移酶、精氨酸酶Mn2+細胞色素酶、過氧化物酶、過氧化氫酶、鐵氧環蛋白Fe2+、Fe3+酪氨酸酶、

6、細胞色素氧化酶Cu2+、Cu+磷酸水解酶類、磷酸轉移酶類Mg2+質膜ATP酶Na+、K+、Mg2+丙酮酸激酶K+、Mg2+111.3 酶的組成常見的非金屬輔助因子類型輔酶和輔基轉移基團輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD+)H、電子（與VPP有關）輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸H、電子（與VPP有關）輔酶輔酶QH、電子輔酶焦磷酸硫胺素醛類輔酶輔酶A、硫鋅酰胺酰類輔酶鈷胺酰胺輔酶類烷類輔酶生物胞素二氧化碳輔酶磷酸吡哆醛氨基輔酶四氫葉酸輔酶類甲基、亞甲基、甲酰基、亞氨甲基輔基黃素單核苷酸（FMN）H（與VB2有關）輔基黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）H（與VB2有關）輔基鐵卟啉電子121.3 酶的組成根據

7、酶蛋白分子的特點，將酶分為：單體酶：由一條多肽鏈構成,一般為催化水解反應的酶,如胰蛋白酶、溶菌酶等, Mr為1335KDa。寡聚酶：有多條相同或不同的多肽鏈組成，可能為別構酶，Mr為35幾百萬道爾頓。多酶體系：由多種酶嵌合形成的復合體，分子量巨大，往往上一個酶產物是下一個酶底物。有三種形式：游離狀態、固定于膜上或組成復合體（反應中間物一般不離開酶復合體）。13二、酶的結構與催化功能 2.1 酶的一級結構與催化活性活性中心：酶分子上參與底物結合與催化作用的少數特殊的氨基酸殘基較集中的區域。 一般認為活性中心有兩個功能部位： A. 催化部位：底物的鍵在此處被打斷或形成新鍵； B. 結合部位：底物分

8、子靠此部位結合到酶分子上。肽鍵：蛋白質酶一級結構的主鍵，斷裂后酶失活。二硫鍵：斷裂后影響酶的空間結構及活性。142.1 酶的一級結構與催化活性與酶活性緊密相關的序列：是酶活性的關鍵，在進化中具高度保守性。如磷酸甘油醛脫氫酶在不同的生物中，一活性Cys前后的17個氨基酸相同： Val-Ser-Asn-Ala-Ser-Cys*-Thr-Thr-Asn-Cys-Leu-Ala-Pro-Leu-Ala-Lys-Val活性氨基酸：活性中心中常見的氨基酸如Cys, His, Ser 等。來源于不同酶的活性氨基酸功能相同，如胰蛋白酶中的活性Ser和菠蘿蛋白酶中的活性Cys功能相同。152.2 酶的二、三級結

9、構與催化活性酶的二級、三級結構是所有酶必備的空間結構，是維持酶活性中心的必需構型。二者的改變可使形成有利于催化作用的構型而發揮作用（“誘導契合學說”的基礎）酶分子的肽鏈大部分不是螺旋而是折疊，其間以螺旋及折疊肽段相連。16 2.2 酶的二、三級結構與催化活性 酶的結構特點：酶分子中的肽鏈通常都緊湊包裝呈球狀或橢圓狀；球表面有幾個凹槽。酶的活性中心位于蛋白分子表面的凹槽，凹槽內為疏水性氨基酸構成的疏水環境；肽鏈所形成的二級結構和三級結構，在酶發生催化作用時，空間位點相近的氨基酸會發生位移，引起酶的構象變化。17 2.2 酶的二、三級結構與催化活性酶活性中心的 空間構型在底物的作用下能發生改變以行

10、使催化功能。如羧肽酶A，由307個氨基酸組成的單一肽鏈，當和底物Gly-Tyr結合時，Tyr248的酚羥基移動1.2nm，與酰胺鍵的N原子形成氫鍵；Arg145移動2nm與底物羧基形成氫鍵；Glu270移動0.2nm, 通過水分子與底物氨基形成氫鍵。但若底物換成Lys-Tyr時，酶不會發生構象變化。182.3 酶的四級結構與催化活性酶的四級結構及亞基與催化活性 每個亞基都具有催化功能，用適當方法分離后，每個亞基都具有生物活性，否則各亞基將失去催化活性。如天冬氨酸轉氨酶，用琥珀酰化方法將亞基分離后，每個亞基都具有生物活性；而用酸，堿和表面活性劑破壞四級結構時，所得的亞基則沒有催化活性，這是由于所

11、使用的化學藥劑抑制了酶活性所造成的。192.3 酶的四級結構與催化活性酶的四級結構與代謝調節 酶的亞基有調節和催化兩種：催化亞基具有催化功能，但受調節亞基影響，如調節亞基有激活中心和抑制中心，可分別與激活劑和抑制劑結合，使酶的活性受到激活或抑制，從而調節酶反應的速度和代謝進程。20三、酶促反應機制3.1 酶作用的專一性專一性種類：根據酶對底物的選擇分 A. 結構專一性：酶對底物的結構有一定的要求，如酶作用點的鍵，鍵兩端基團等； B. 立體專一性：酶對底物的立體結構有一定的要求。又分為旋光異構專一性（如胰蛋白酶只作用于L-AA殘基構成的肽鍵）和幾何異構專一性（如琥珀酸脫氫酶只能催化琥珀酸脫氫生成

12、延胡索酸，而不能生成順丁烯二酸）。213.1 酶作用的專一性223.1 酶作用的專一性專一性的機理：“鎖與鑰匙”假說(1894, Fisher)，“誘導契合”假說(1958, Koshland)；專一性研究的意義： A 了解生命現象:生物有序代謝及酶作用機制; B 指導工業生產； C 物質結構分析； D 用于藥物手性體的合成和拆分。233.1 酶作用的專一性243.1 酶作用的專一性酶專一性研究的一般方法：首先篩選被酶解的活性底物，對底物結構進行切除或化學修飾；最好對一種以上的底物進行類似的處理，以驗證專一性。酶反應專一性研究示例： 以紅曲酶葡萄糖淀粉酶(EC3.2.1.4.)為例，底物用多糖

13、、寡糖，結果如下表：25底物濃度（%）結構特征水解限度(%)直鏈淀粉0.1-1,4糖苷鍵，直鏈100支鏈淀粉0.25-1,4糖苷鍵和-1,6糖苷鍵, 分支91.3茁霉多糖0.25-1,4糖苷鍵和-1,6糖苷鍵, 分支8.7右旋糖苷0.25-1,4糖苷鍵和-1,6糖苷鍵, 分支0-環糊精0.25-1,4糖苷鍵，6糖成環0-環糊精0.25-1,4糖苷鍵，7糖成環0-環糊精0.25-1,4糖苷鍵，8糖成環0麥芽糖0.1-1,4糖苷鍵，雙糖100異麥芽糖0.1-1,6糖苷鍵，雙糖1.4纖維二糖0.1 -1,4糖苷鍵，雙糖0紅曲霉葡萄糖淀粉酶對不同底物的水解限度結論：專一性水解-1,4糖苷鍵，且為線形分

14、子263.2 酶促反應的本質酶的逼近與定位功能 酶能使溶液中游離的分子、基團或原子逼近底物分子，并使其定位不動，增大親核攻擊機會，從而加快反應速度。 酶與專一性底物結合時，酶蛋白分子會發生一定的構象變化，使其催化基團與結合基團的正確排列并定位，便于底物分子逼近及定位。273.2 酶促反應的本質底物分子變形與扭曲 酶與專一性底物相互作用時，底物分子在酶的作用下發生變化，敏感的基團電子云密度增高或降低，產生“電子張力”，變得更為敏感，易于形成過度態構型，加快反應發生。酸堿催化 即質子受體和供體的催化。酶分子側鏈上有些功能基團如-NH3、-COOH、-SH、酚羥基及咪唑基等，具有質子授受功能，執行酸

15、堿催化。283.2 酶促反應的本質共價催化 酶與底物分子共價結合形成高活性的中間產物，此產物很容易變成過度態，大大降低反應的活化能而加快催化反應的進行。 親核催化是其中之一。酶分子中有很多親核基團如-NH3、-COOH、-SH、酚羥基及咪唑基等，親電基團H+，各種金屬離子及輔酶的親核中心等。293.2 酶促反應的本質酶分子活性中心低介電性 一些酶的活性中心為非極性的，其催化基團被低介電環境所包圍。這有利于專一性底物分子敏感鍵與催化基團反應，加快反應進行。如溶菌酶底物結合部位的狹長裂縫，提供了特殊結合環境。 同時，由于酶的此類性質，改變了反應的環境，也有利于催化反應的進行。303.3 酶促反應機

16、制的研究方法1. 動力學研究 在實驗中改變酶促反應條件，利用酶動力學理論對取得的數據進行分析研究。 A. 改變底物濃度：研究反應復合物出現的次序； B. 改變底物結構：用結構相近的底物考查酶促進反應速度，可以了解結合部位和催化活性有關的結合要素，即活性部位的圖解。313.3 酶促反應機制的研究方法1. 動力學研究 C. 可逆抑制：選擇一定的抑制劑，比較它們與底物的異同，可以測知與酶活性部位相關的結構，如Ala-Phe-Arg是木瓜酶強有力的抑制劑。 D. 改變pH條件：測定酶反應速度對pH變更的曲線，能找到那些與已經電離的AA側鏈的pKa值，再與此AA的pKa比較，推測哪些AA與酶活性有關。

17、E. 恒態前反應動力學：檢測ES形成及分解速度。323.3 酶促反應機制的研究方法2. 反應中間物檢測：一般難以達到，但有些酶反應中間物比較穩定，如胰凝乳蛋白酶催化酯類水解有一個酰基酶中間體(Ser-195被乙酰化)；3. X射線晶體衍射：比較煩瑣，但可以得到酶底物復合物精細結構；4. 氨基酸側鏈的化學修飾：檢驗活性基團氨基酸,如Hg對含-SH Cys的特殊修飾.33 3.4 抗體酶催化的反應概念：將經過特殊設計并合成的有機小分子作為半抗原，用細胞雜交技術生產單克隆抗體，這種抗體具有酶的特性。抗體酶催化的反應： 酰基轉移反應、水解反應、分子重排、光誘導反應、氧化還原反應、金屬螯合反應等。抗體酶研究的意義：發展專一性酶；用于蛋白質序列分析；研究酶的催化機制；發展抗體藥物；等等。34*3.5 核酶對RNA加工的反應概念: 核酶(ribozyme)是指具有酶催化功能的RNA或DNA。核酶的功能主要是切割RNA，有阻斷基因表達和