1、免疫毒理學 2021/7/16 星期五1 免疫毒理學（immunotoxicology）是研究外源化學物和物理因素等對機體免疫系統的損害作用、生物學機制及其危險度評價與管理，在免疫學和毒理學基礎上發展起來的一門毒理學分支學科。定義的提出 1984年，國際化學品安全規劃署（IPCS）和歐共體委員會（CEC）共同組織了“免疫系統是毒物損傷的靶”的研討會，會議對免疫毒理學進行了上述定義，并達成共識。會議提出了免疫毒性評價必不可少的兩個步驟： 藥物和化學物對免疫系統毒性的鑒定 免疫毒性的危險度評價2021/7/16 星期五2 各種免疫器官和組織、免疫細胞及免疫分子共同構成了復雜的免疫系統，這是機體免疫

2、功能正常發揮的物質基礎 第一節 免疫生物學基礎概述2021/7/16 星期五3一、免疫系統的組成及其功能粘膜相關淋巴組織 完整的免疫系統由免疫器官和組織、免疫細胞及免疫分子所組成。 2021/7/16 星期五4免疫系統可以識別自身和非己抗原，對自身耐受，且清除非己，維持內環境的穩定，表現為免疫防御、免疫自穩和免疫監視三大功能。 2021/7/16 星期五5（一）免疫器官和組織2021/7/16 星期五6骨髓：B淋巴細胞發育成熟的場所。胸腺：由胸腺基質細胞和胸腺細胞組成。是T淋巴細胞尤其是+T細胞發育的場所。胸腺基質細胞與胸腺細胞的相互作用，對T細胞的發育是至關重要的。2021/7/16 星期五

3、7脾臟 T：35%、B：55%M：10%淋巴結 T：75%、B：25%2021/7/16 星期五8粘膜相關淋巴組織 在呼吸道、腸道及泌尿生殖道的黏膜上皮細胞下，均聚集有無包膜的淋巴組織。在小腸黏膜上皮細胞間存在一類T細胞稱上皮淋巴細胞。即： +T細胞特異免疫應答； +T細胞固有免疫應答2021/7/16 星期五9（二）免疫細胞 免疫細胞（immunocyte）廣義地指對抗原物質產生特異性和非特異性免疫應答的各種細胞。大體上分為免疫活性細胞、輔佐細胞和其它細胞三類。 2021/7/16 星期五101免疫活性細胞（immunoconpetent cell, ICC）指能識別特異性抗原以及受抗原刺激

4、后向母細胞轉化、分裂增殖并分化為能產生免疫效應物質（如抗體、淋巴因子）的淋巴細胞群，包括T淋巴細胞和B淋巴細胞。2021/7/16 星期五11淋巴細胞（Lymphocyte） 分B細胞和T細胞，分別來源于骨髓和胸腺。在機體免疫應答中起核心作用。B淋巴細胞：表面的BCR及分泌的抗體均為免疫球蛋白。由B細胞介導的免疫稱為體液免疫。T淋巴細胞：TCR為雙鏈分子。細胞毒性T細胞、調節性T細胞（輔助性T細胞和抑制性T細胞）2021/7/16 星期五122021/7/16 星期五13人類T細胞亞群及其功能亞群MHC限制表面標記主要功能TH1MHC-II類限制TCR+、CD3+、CD4+分泌以IL-2、 I

5、FN-和TNF-為主的細胞因子，引起炎癥反應或遲發行超敏反應TH2MHC-II類限制TCR+、CD3+、CD4+分泌以IL-4、5、6、10等為主的細胞因子，誘導B細胞增殖、分化、合成、分泌抗體，引起體液免疫反應。TcMHC-I類限制TCR+、CD3+、CD8+可特異性的殺死帶有致敏抗原的腫瘤或病毒感染的細胞，發揮細胞免疫效應。TsMHC-I類限制TCR+、CD3+、CD8+釋放抑制性細胞因子(如IL-4、IL-10等)和IFN- ，抑制體液和細胞免疫發生和發展.2021/7/16 星期五14B 淋 巴 細 胞始祖B細胞前B細胞不成熟B細胞成熟B細胞來于骨髓淋巴樣干細胞，無smIg表達， CD

6、19+無smIg表達，但胞漿中出現鏈，同時有MHC-II表達，CD19+、20+膜表面出現單體IgM，開始表達CD21，CD19、20、MHC-II類分子表達量增多表達smIgM、 smIgD、IgGFc-R、C3bR、絲裂原受體及CD19、20、21等無免疫應答功能smIgM同自身抗原結合可產生抑制信號，導致自身反應性B細胞處于無功能抑制狀態，產生自身耐受具有接受抗原的刺激并發生增殖分化的能力，是抗體產生的源泉細胞；其中部分可成為記憶性B細胞2021/7/16 星期五152021/7/16 星期五16主要抗原呈遞細胞的比較APC主要特征分布簡稱C3bRFcRMHC分子吞噬B細胞朗罕氏細胞并指

7、狀細胞樹突狀細胞巨噬細胞BCLCIDCDCM外周血、淋巴結、脾表皮組織某些上皮層淋巴組織、胸腺依賴區淋巴濾泡全身細胞和組織+-+-2輔佐細胞（accessory cell，A細胞） 在免疫應答中呈遞抗原，又稱抗原呈遞細胞（antigen presenting cell；APC），主要有樹突細胞（DC）、單核細胞和巨噬細胞。B細胞是抗原特異性呈遞細胞。 2021/7/16 星期五17 掃描電鏡顯示：在感染早期，M伸出長長的偽足去捕獲細菌M吞噬處理入侵細菌及提呈抗原的機制2021/7/16 星期五18 來源：骨髓。 分布：外周血和淋巴組織。 標志：CD16、CD56。 特征：胞漿中含豐富的嗜天青顆

8、粒，又稱大顆粒細胞。 功能：非特異性殺傷某些腫瘤細胞和病毒感染細胞，在早期抗病毒感染、清除突變細胞的免疫監視和免疫調節過程中發揮作用。其殺傷作用無需抗原致敏，不受MHC限制。3其他免疫細胞NK細胞 LAK細胞 在IL-2的作用下，體外培養的淋巴細胞才能發揮強烈的殺傷功能，也叫淋巴因子激活的殺傷細胞。能殺傷Tc、NK不敏感的腫瘤細胞2021/7/16 星期五19單 核 吞 噬 細 胞 包括骨髓中的前單核細胞、外周血中的單核細胞和組織內的巨噬細胞，具有重要的抗感染、抗腫瘤和免疫調節的作用。（一）表面標志：表面抗原：高表達MHC-I/II類分子表面受體：IgG Fc受體，包括高親和力的FcRI、中親

9、和力的FcRII和低親和力的FcRIII。作用：參與調理和ADCC。補體受體（CRI），為C3b受體，與吞噬和免疫黏附作用有關。2021/7/16 星期五20單核吞噬細胞生物學功能 1、吞噬殺傷作用：直接吞噬、調理吞噬作用2、抗原提呈作用：即外來的抗原性異物通過巨噬細胞的捕獲、加工和處理后，與胞內合成的MHC-1/II類分子形成抗原肽MHC分子復合物，并被呈遞到細胞膜表面，被TCR識別的作用。具有此作用的細胞叫抗原呈遞細胞（antigen presenting cell,APC）。 巨噬細胞表面還表達多種共刺激分子，如B7、ICAM-1、LFA-1,3等分別與T細胞上的CD28、LFA-1(C

10、D11)、LFA-2(CD2)等相互作用，為T細胞的活化提供第二信號。3、抗腫瘤作用：M被某些細胞因子如IFN-激活后能有效殺傷腫瘤等靶細胞，其吞噬殺菌能力也顯著提高。4、分泌生物活性介質，產生免疫應答和其它免疫效應：如IL-1,12、IFN、TNF、PGE等;以及某些補體成份和凝血因子、組織修復因子等。2021/7/16 星期五21（三）免疫分子免疫球蛋白（immunoglobulin；Ig）補體（complement；C）細胞因子（cytokine；CK）HLA分子2021/7/16 星期五22二、免疫應答過程及其病理反應免疫應答（immune response）是機體非特異性和特異性的識

11、別并排除異己成分以維持自身穩定的全過程，因而免疫應答是整個免疫學的核心。非特異性免疫應答指吞噬作用和炎癥反應，特異性免疫應答是指細胞免疫應答和體液免疫應答。抗原刺激TB細胞產生致敏T細胞和或抗體稱正應答，未產生致敏T細胞或抗體的為負應答即耐受，抗原還可誘導TB細胞凋亡。免疫應答維護了內環境的穩定，因而是保護性的，但不適當的應答也會導致病理性損傷。2021/7/16 星期五23（一）免疫應答的三個階段 1.啟動階段 指T細胞或B細胞對APC呈遞的抗原識別階段。主要包括抗原呈遞、T細胞對抗原和MHC的識別、B細胞雙識別、T細胞活化的雙信號和B細胞活化的雙信號等重要環節。2.誘導階段（1）T細胞活化

12、、增殖和分化 （2）B細胞活化、增殖和分化 3.效應階段（1）T細胞介導的細胞免疫效應 （2）抗體介導的免疫效應 2021/7/16 星期五24（二）免疫應答的病理反應異常的免疫反應主要包括免疫抑制與免疫增強兩種情況。免疫增強是指機體過度的或不適當的免疫反應狀態。過度的或不適當的免疫應答可導致機體各種病理損害，有關的疾病主要有超敏反應和自身免疫性疾病等。2021/7/16 星期五251.超敏反應指機體再次接觸同一抗原時所發生的不同形式的免疫病理損害過程。超敏反應的發生往往取決于外來物質作為抗原的特異性和機體反應的特性兩大因素。超敏反應的類型2021/7/16 星期五26Comparison o

13、f hypersensitivity reactions2021/7/16 星期五272021/7/16 星期五28I型超敏反應的基本過程2021/7/16 星期五292021/7/16 星期五302021/7/16 星期五312021/7/16 星期五322021/7/16 星期五33Type IV hypersensitivity the three forms2021/7/16 星期五342.自身免疫反應自身免疫反應是指機體免疫系統對自身抗原發生免疫應答，產生自身抗體或/和自身致敏淋巴細胞，引起機體病理損害甚至導致疾病的過程。器官特異性自身免疫性疾病 器官非特異性自身免疫性疾病又叫全身性

14、或系統性自身免疫性疾病 2021/7/16 星期五35第二節 免疫毒性作用及其機制 外源化學物和物理因素可以直接損傷免疫器官和組織、免疫細胞的結構和功能，影響免疫分子的合成、釋放和生物活性，或通過干擾神經內分泌網絡等間接作用，使免疫系統對抗原產生不適當的應答，即過高或過低的應答，或對自身抗原的應答，都會導致免疫病理過程，發展為免疫性疾病。應答過低可引起免疫抑制(immunosuppression)，使宿主對病原體或腫瘤的易感性增加，嚴重時表現為免疫缺陷；應答過高則表現為超敏反應（hypersensitivity）；自身抗原應答細胞被激活則引起自身免疫(autoimmunity)外源化學物對免疫

15、系統的影響常常是復雜的。 2021/7/16 星期五36一、免疫抑制 免疫抑制的結果是機體抵抗力降低，主要表現為抗感染能力降低和腫瘤易感性增加。 具免疫抑制作用的外源化學物種類繁多 外源化學物引起免疫抑制的機制較為復雜，僅就其作用方式而言，通常分為直接作用和間接作用兩大類。2021/7/16 星期五37 外源化學物對神經-內分泌-免疫系統網絡某一環節的損害，都可能影響正常的免疫功能。 外源化學物免疫損傷的分子機制: 轉錄核因子（NF-B）或活化的T細胞核因子（NF-AT）是免疫應答過程中重要的免疫調節因子。 外源化學物還可以通過氧化應激反應、破壞細胞內鈣穩態、抑制cAMP等機制影響淋巴細胞的正

16、常功能，引起免疫抑制 2021/7/16 星期五38二、超敏反應外源化學物引起的超敏反應同樣涉及、和型反應類型。能引起超敏反應的外源化學物或混合物有數百種，可來自食物、藥物，也可以從職業或生活環境中接觸。化學物引起超敏反應機制 外源性化學物本身作為抗原或半抗原引發超敏反應 改變抗體免疫應答的敏感性或強度而導致超敏反應 2021/7/16 星期五39三、自身免疫很多能誘發型、型和型超敏反應的外源化學物都可以引起自身免疫，尤以藥物多見。 外源化學物引起自身免疫的機制 （1）引發機體針對自身抗原產生自身抗體進行免疫應答 （2）引發機體產生針對自身抗原的自身應答性T細胞進行免疫應答 （3）造成自身隱蔽

17、抗原的暴露或釋放、改變自身抗原或形成新的自身抗原，從而引起自身免疫。 （4）改變血細胞或其他組織細胞的抗原性，這種改變了的抗原刺激機體產生自身抗體。 （5）影響正常免疫調節功能，如激活對自身抗原處于耐受態的T細胞，或通過APC表面輔助刺激因子異常表達，或引起Th1和Th2功能失衡，引起自身免疫 2021/7/16 星期五40免疫缺陷（immunodeficiency, ID），是指因先天性或繼發性免疫系統功能不全的疾病。這主要源于抗體缺陷、細胞免疫缺陷、巨噬細胞缺陷或補體系統缺陷。發生免疫缺陷的主要原因是先天性免疫系統遺傳基因異常 能引起免疫抑制作用的外源化學物多數可能導致機體免疫缺陷的發生。

18、影響其發生的主要因素是化學毒物作用的劑量、持續時間和機體免疫應答狀況等。妊娠期或圍生期接觸外源化學物會嚴重影響胎兒出生后T細胞、B細胞、吞噬細胞的發育、遷移、歸巢及其功能，可能暫時或永久性地損傷機體的免疫系統。 2021/7/16 星期五41第三節 免疫毒性作用的試驗方法與評價一、檢測方案（一）美國NTP推薦的嚙齒類動物（多用雌性小鼠）免疫毒性檢測方案（二）WHO推薦的人群免疫毒性檢測方案（三）美國FDA/ CDER的新藥免疫毒理學評價規范2021/7/16 星期五42美國NTP推薦的小鼠免疫毒性檢測方案（USNTP,1988） 檢 測 項 目檢 測 內 容篩選（一級） 免疫病理血液學白細胞總

19、數及分類臟器重量體重、脾臟、胸腺、腎臟、肝臟細胞學脾臟組織學脾臟、胸腺、淋巴結 體液免疫對T淋巴細胞依賴抗原（RBC）IgM抗體生成細胞數對有絲分裂原LPS的反應 細胞免疫對有絲分裂原ConA的反應及混合淋巴細胞反應 非特異性免疫NK細胞活性全面試驗（二級） 免疫病理脾臟T、B淋巴細胞數體液免疫對T淋巴細胞依賴抗原（SRBC）IgG抗體生成細胞數細胞免疫細胞毒T細胞的溶細胞作用（CTL）遲發型變態反應（DTH）非特異性免疫巨噬細胞功能宿主抵抗力對不同腫瘤和感染因子的抗性（選擇23種）2021/7/16 星期五43WHO推薦的人群免疫毒性檢測方案（WHO，1992） 檢 測 項 目檢 測 內 容

20、全血細胞計數及分類 體液介導免疫（檢測一項或多項） 對蛋白抗原的初次抗體反應；血清中免疫球蛋白水平（IgM、IgA、IgG、IgE）對蛋白抗原的二次抗體反應（白喉、破傷風或脊髓灰質炎）對回憶抗原的增殖反應。細胞免疫 用試劑盒檢測皮膚遲發型過敏反應對蛋白抗原（KLH）的初次DTH反應對血型抗原的天然免疫（如抗A、抗B）自身抗體和炎癥C-反應蛋白自身抗體滴度對過敏原產生的IgE水平流式細胞儀分析淋巴細胞表型 分析淋巴細胞表面標記CD3、CD4、CD8、CD20 非特異性免疫的檢測 NK細胞數（CD56或CD60）或對K52細胞的溶解活性吞噬作用（NBT或化學發光）臨床化學指標檢測 2021/7/1

21、6 星期五44美國FDA/ CDER的新藥免疫毒理學評價規范(2002) 提出要考慮藥物對免疫系統五個方面的影響，除了免疫抑制、超敏反應和自身免疫外，還有免疫原性（immunogenecity）和不良免疫刺激（adverse immunostimulation）。前者指藥物及其代謝產物引起免疫反應的能力，后者指藥物對免疫系統某些成分的任何抗原非特異性的、不適當的或難以控制的活化作用，并指出可根據不同藥物的特點和具體情況靈活選擇合適的參數項目和評價。 2021/7/16 星期五45二、檢測方法 （一）免疫病理學檢查 觀察免疫器官的大小（重量）和大體形態，然后進行組織病理學檢查 主要觀察胸腺、脾臟、淋巴結和骨髓的組織結構和細胞類型，同時要注意檢查局部粘膜相關淋巴組織一般先用常規染色法染色，根據需要再選擇免疫組化等特異性方法利用熒光標記單克隆抗體和流式細胞儀觀察淋巴細胞表面標記是目前檢查淋巴細胞表型的可靠方法，而以往多采用直接或間接免疫熒光法2021/7/16 星期五46（二）免疫功能檢測固有性免疫應答評價 1NK細胞活性測定 觀察NK細胞對敏感的腫瘤細胞的溶解作用 LDH釋放法 2巨噬細胞功能檢測 同位素鉻標記雞紅細胞（51Cr-cRBCs）吞噬法 炭粒廓清試驗、巨噬細胞溶酶