1、 第 10 章 基因診斷 Gene diagnosis China Medical University Department of Medical Genetics p480. 本章內容提示 基因診斷概念 基因診斷方法 直接診斷Southern 間接診斷PCR-RFLP DNA多態 基因診斷 實例：.第一節 基因診斷技術 第二節 基因診斷方法及實例. 基因診斷： 利用分子生物學技術從DNA 程度檢測人類遺 傳性疾病的基因缺陷，又稱DNA分析法。 傳統的診斷：表現型基因型 基 因 診 斷：基因型表現型 逆向診斷.基因診斷的特征：1 不受資料來源影響 外周血、活體穿刺組織、孕婦外周血、血斑等2

2、病癥前診斷 尤其對于一些延遲顯性疾病如Huntingtong舞蹈病3 產前診斷 防止患兒出生，提高人口質量.第一節 基 因 診 斷 技 術Southern印跡雜交.基 因 診 斷 技 術Northern印跡雜交.基 因 診 斷 技 術斑 點 雜 交點樣Probe-32P檢測AB1 2 3 4.基 因 診 斷 技 術熒光原位雜交.基 因 診 斷 技 術熒光原位雜交.基 因 診 斷 技 術聚合酶鏈反響.基 因 診 斷 技 術聚合酶鏈反響.基 因 診 斷 技 術 多重PCR在一個PCR體系中參與數對PCR引物，覆蓋區域不重疊用于檢測同一基因多個外顯子的缺失E1 E2 E3.基 因 診 斷 技 術 R

3、T-PCR以mRNA為模板，經逆轉錄酶合成cDNA用于研討基因表達使微量mRNA迅速擴增，提高mRNA檢出的靈敏度.基 因 診 斷 技 術 PCR-SSCPSingle Strand Conformation Polymorphism單鏈DNA由于堿基序列不同可引起構象差別，這種差別將呵斥一樣或相近長度的單鏈DNA電泳遷移率的不同。據此，可用于DNA中單個堿基的替代、微小的缺失或插入的檢測。.基 因 診 斷 技 術 - primer - 32P-dNTP摻入 PCR擴增 產物 變性 單鏈DNA 中性聚丙烯酰胺凝膠電泳 1 2 3 4 5 自顯影 1為正常 結果分析 2、4、5為純合患者 3為雜

4、合子 . .基 因 診 斷 技 術生 物 芯 片.第二節 基 因 診 斷 方 法及實例直接診斷直接檢測致病基因的突變 基因突變類型缺失、點突變、反復、插入等間接診斷運用DNA多態為遺傳標志進展連鎖 分析，確定待測者能否得到帶有致病的染色體，從而間接地作出診斷 DNA多態RFLP、VNTR、SNP.一 DNA多態DNA多態DNA Polymorphism： 群體中每個個體DNA區域中等位基因或片段存在兩種或兩種以上的方式，對基因功能沒有影響，稱DNA多態。 它經過孟德爾方式遺傳。常用做遺傳分析中的標志。.DNA分析中常用的遺傳性多態性標志有3類：1RFLP：稱限制性片段長度多態性，為第一代多態性

5、標志；2反復序列多態性VNTR：如短串聯反復序列STR，為第二代多態性標志；3單堿基多態性SNP：DNA序列的單個核苷酸的差別，為第三代多態性標志。.一) 限制性片段長度多態性 Restriction Fragment Length Polymorphism ，RFLP由于堿基變異能夠導致限制酶切點消逝或新的酶切點出現，引起不同個體DNA在用同一限制酶切割時，產生不同長度的DNA片段，稱 RFLP RFLP按孟德爾共顯性方式遺傳，是非常有用的遺傳標志。.Allele II 產生了新的酶切點 Allele I Allele II12Kb8Kb4Kbprobe12Kb8Kb RFLPSouther

6、n blot檢測結果 .AlleleII酶切位點消逝 .二)數目變異串聯反復，variable number tandem repeats, VNTR反復序列以各自的中心序列反復單元，首尾相連多次反復，稱為串聯反復序列，其反復次數在人群中存在變異，構成多態即 VNTR。散在分布于染色體上。反復單位625bp長，稱為小衛星DNA。反復單位26bp長，如TAn, (CGG)n等，稱為微衛星DNA。.VNTR兩側酶切位點固定，但兩酶切點之間的串聯反復拷貝數不同，酶切后產生不同長度的片段。DNA多態可以經過PCR擴增后電泳來檢出，稱擴增片段長度多態amplified fragment length p

7、olymorphism, Amp-FLP.VNTR 酶切，電泳后的檢測結果大小.PCR-VNTR檢測.PCR-VNTR.三)單核苷酸多態性SNPSingle Nucleiotide PolymorphismSNP：發生在基因組中的單個核苷酸的替代根據SNP在基因中的位置，分為： 基因編碼區SNP 基因周邊SNP 基因間SNP在人類基因組中每100300個核苷酸就有一個SNP.二、基診斷方法及實例 直接檢測致病基因本身的異常。通常運用基因本身或臨近DNA序列作為探針，進展Southern 雜交，或經過PCR 擴增產物，以檢測基因點突變、缺失、插入等異常及性質。主要適用于知基因異常疾病的診斷。直接

8、基因診斷及實例.直接基因診斷 突變型遺傳病的直接基因診斷e.g. 鐮形細胞貧血的Gene診斷 .1Southern blot 珠蛋白鏈基因第6位密碼子發生突變 GAGGTG 谷Aa纈Aae.g. 鐮形細胞貧血的Gene診斷.知限制酶Mst 1識別序列 CCTNAGG CCTGAGG CCTGTGG突變后不能識別，酶切位點消逝，限制酶切片段長度發生變化。.2) ASO探針診斷 知突變Gene部位和性質，合成寡核苷酸探針，32P標志，進展斑點雜交。 Normal Gene Probe與正常 Probe 雜交穩定 Mutation S Gene Probe與異常 S雜交 穩定 .等位基因特異性寡核苷

9、酸探針ASOAllele-specific-oligonucleotide .斑點雜交結果： / /S S/S 正常探針 突變探針突變型遺傳病的直接基因診斷.突變型遺傳病的直接基因診斷.BamHIBamHI212 10 kb14 kbprobe 1 地中海貧血的基因診斷基因不同程度的缺失可引起不同類型的地中海貧血。直接基因診斷 缺失型遺傳病的直接基因診斷.Southern blot 檢測結果： / /- /- - - /- - - - / - - 正常 缺1 缺2 缺3 缺414kb10kb缺失型遺傳病的直接基因診斷.2地貧的Gene診斷珠蛋白基因兩側有pst1酶切位點， pst1酶切正常可得

10、到4.4kb片段珠蛋白基因缺失0.7kb片段， pst1酶切那么得到3.7 kb片段為0 缺失型遺傳病的直接基因診斷.以Gene為探針，Southern blot 方法檢測 /A /0 0/0 4.4kb3.7kb缺失型遺傳病的直接基因診斷.3 DMD的基因診斷DMD屬XRDMD基因是最大的基因，有79個外顯子DMD基因突變主要以缺失為主，可涉及基因的不同部位E1 E2 E3缺失型遺傳病的直接基因診斷.病例外顯子 1 2 3 4 5 6 7 8Pm34350136476052bp535113缺失型遺傳病的直接基因診斷.二間接基因診斷方法及實例 當致病基因雖然知，但其異常性質未知時，或疾病Gen

11、e本身尚未知時，主要經過Gene和DNA多態的連鎖分析間接地作出診斷。. 連鎖分析基于遺傳標志與Gene在染色體上連鎖， 經過對受檢者及其家系進展連鎖分析，分析子代獲得某種遺傳標志與疾病的關系，間接推斷受檢子代能否獲得帶有致病基因的染色體，間接地判別并做出診斷。 遺傳標志是基因組中的DNA 多態 如：RFLP，VNTR 等。間接基因診斷.遺傳標志相關基因表型分析間接基因診斷.1 Southern blot-RFLP診斷(PKU) PAH基因兩側有Msp1酶切位點,用該酶消化可產生23kb、19kb 兩種等位片段，以PAHcDNA為探針與PKU家系成員外周血DNA雜交。間接基因診斷.患者為19k

12、b片段的純合子,闡明患者缺陷的PAH基因與19kb片段連鎖其父、母親缺陷的PAH基因與19kb片段連鎖，其23kb片段與正常PAH基因連鎖。II2為23kb 和19kb片段的雜合子，為表型正常的致病基因攜帶者。間接基因診斷.2 成年型多囊腎病的診斷例：成年型多囊腎病APKD，AD ，臨床表現為腰痛，蛋白尿，血尿，高血壓，腎盂性腎炎，腎結石。最終導致腎功能衰竭和尿毒癥。APKDGene定位16p13，但致病基因尚未克隆，基因產物的生化性質和疾病發病機理也尚未闡明，但已證明APKD Gene與珠蛋白基因3端附近的一段小衛星DNA序列3HVR嚴密連鎖，因此，可以經過連鎖分析進展診斷。間接基因診斷.

13、以3HVR為探針，與PvuII酶切后的家系有關成員的基因組DNA進展Southern Blot 基因組DNAPvuII酶切DNA片段變性轉膜探針變性雜交結果分析間接基因診斷. 1 2 1 2 3 4 5 5.7kb 3.4kb 2.3kb 間接基因診斷.結果分析 患者I1、II1和II2有3.4kb片段，闡明致病基因與3.4kb片段連鎖，并按孟德爾方式遺傳。II5不含3.4kb片段，產前診斷正常。間接基因診斷.3 甲型血友病診斷PCRRFLP 甲型血友病的基因診斷：知甲型血友病XR，獲得家系成員基因組DNA 。 PCR 142 bp BcLI 142bp 99 bp 43bp 電泳 結果分析p

14、1p2142bp99bp43bpBcl IBcl I -Bcl I +間接基因診斷.間接基因診斷. 142bp99bp1 2123III 1間接基因診斷.結果分析1先癥者II 1具有99bp片段而發病，該片段來自母親。2II2有142bp/99bp，為雜合子。142bp來自父親，為正常片段，99bp片段是來自母親而成為攜帶者。31為99bp片段 假設是 男性 為患者99bp片段來自母親；女性為攜帶者來自父母雙方間接基因診斷.單體型分析有時用一種酶和一個探針不能提供可供分析的信息，需采用一種以上的酶結合幾個基因探針雜交分析。根據同一條染色體上限制性位點的喪失或獲得而出現的一組多態位點所構成的不同

15、片段長度的組合類型進展分析，該分析方法稱單體型分析Haplotyping)間接基因診斷. 舉例：PKU家系Hind 酶切： 患兒4.2/4.0kb雜合體 父母4.2/4.0kb雜合體 均為雜合體，無法分析。再用sph酶切：患兒 純合7.0kb 父親 純合7.0kb 母親 9.7kb和7.0kb雜合體間接基因診斷.結 果 1 2 1 2 3 4.2kb 4.0kb 11kb 9.7kb 7.0kb IIIHind Sph 間接基因診斷.分析： 患兒1從母親和父親各獲得一個7.0kb突變型從Hind 酶切結果看出： 正常同胞3為純合4.0kb ，也是sph 7.0kb純合體，故母親H 4.0kb S 7.0kb 構成單體型，母親7.0kb為突變型，因此，母親H 4.0kb S 7.0kb為突變單體型。間接基因診斷.患兒1為H