1、代謝工程研究進展目錄1234代謝工程概述青蒿素代謝工程L-色氨酸菌種選育代謝工程展望1代謝工程代謝工程（metabolic engineering）是指利用多基因重組技術有目的地對細胞代謝途徑進行修飾、改造、改變細胞特性，并與細胞基因調控、代謝調控及生化工程相結合，為實現構建新的代謝途徑生產特定目的產物而發展起來的一個新的學科領域。目的在于構建具有新的代謝途徑、能生產特定的目的產物或具有過量生產能力的工程菌，用于工業生產。代謝工程的三種設計改變代謝流擴展代謝途徑轉移或構建新的代謝途徑123基因工程手段使發生代謝轉移或克隆引入外源基因使原來的代謝途徑向后延伸，生成新的末端產物加速限速反應；改變分

2、支代謝途徑流向；構建代謝旁路；改變能量代謝途徑2青蒿素代謝工程青蒿素代謝工程是植物基因工程研究領域熱點之一，轉基因技術超表達青蒿素生物合成途徑關鍵酶基因、抑制支路重要基因表達、重構青蒿素及其中間體代謝途徑、增加前體供應等代謝工程方法已取得較好的進展。超表達青蒿素生物合成途徑關鍵酶基因1利用轉基因技術提高青蒿中青蒿素的量是行之有效的策略2紫穗槐-4, 11-二烯合成酶（ADS）是由FPP合成青蒿素的關鍵酶參與青蒿素生物合成的細胞色素P450基因CYP71AV1 (編碼紫穗槐二烯C-12氧化酶)3靶點基因的選擇在青蒿代謝工程研究中起到了至關重要的作用ADS基因、CYP71AV1基因、IPI 基因、

3、FPS 基因、HMGR基因等4 青蒿素的量有不同程度的提高 抑制支路重要基因表達1抑制旁路基因促可進代謝流朝靶標產物積累2反義 RNA 技術或 RNAi 技術，降低特定代謝途徑上重要基因的表達3下調鯊烯合酶基因 SQS 表達，青蒿素生物合成途徑的 ADS、CYP71AV1 及 CPR 基因表達得到大幅度提高重構青蒿素及其中間體代謝途徑（1）青蒿素及其中間體固有代謝途徑的轉移、重構與工程化（2）全新青蒿素及其中間體合成途徑的設計、篩選、組裝與程序化 目前主要通過兩種模式在不同的底盤細胞中構建青蒿素及其中間體代謝途徑。青蒿素及其中間體固有代謝途徑的轉移、重構與工程化只導入了青蒿素生物合成特異途徑中

4、的基因導入了底物供應途徑的限速酶基因另外導入一條底物供應途徑增加前體供應（1）通過“開源”方式增加前體供應提高工程菌的 FPP 池中底物的總量，從而提高進入青蒿素生物合成途徑的底物的絕對總量（2）通過“節流”方式增加前體供應限制或減少底物流向別的代謝流促使相對更多的 FPP 進入青蒿素生物合成特異途徑抑制競爭代謝途徑下調競爭代謝途徑從而限制或減少流入競爭代謝途徑中的 FPP 供應3L-色氨酸菌種選育代謝工程人體必需的氨基酸，廣泛應用于醫藥、食品和飼料工業等領域生產成本較高，限制了其應用規模市場需求的加大，色氨酸的生產規模不斷擴大，對生產菌株的要求也越來越高基因操作，代謝工程新思路，大大提高了色

5、氨酸的發酵產酸水平代謝流分析代謝流分析（metabolic flux analysis，MFA）是對代謝途徑流量進行測定分析的方法。近年來，人們通過代謝工程方法改變細胞內部的代謝流分布，使其生成更多的目的產物。代謝流分析成為代謝工程中用以指導遺傳操作的理論基礎，是代謝網絡分析的基本方法。有研究通過分析大腸桿菌L-色氨酸合成的代謝流，利用各菌株在擬穩態下的代謝流分布圖，對L-色氨酸菌種進行選育，優化L-色氨酸的生物合成過程。L-色氨酸合代謝流量分布圖的建立1.過表達酮酶基因（tktA）和磷酸烯醇式丙酮酸合成酶基因（ppsA）使大腸桿菌中心代謝流能更多地進入色氨酸合成的代謝途徑構建轉酮酶基因（tk

6、tA）和磷酸烯醇式丙酮酸合成酶基因（ppsA）過表達質粒pEML03增加色氨酸前體物質4-磷酸赤蘚糖（E4P）和磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的濃度提高色氨酸產量L-色氨酸合代謝流量分布圖的建立2.貯碳因子基因（csrA）的敲除利用Red重組技術敲除貯碳因子基因（csrA），增加色氨酸前體物質PEP的供應量轉入pEML03，分批發酵試驗，考察基因重組對色氨酸發酵過程的影響。通過測定在擬穩態下主要代謝物濃度的變化速率，得到了原菌株和重組菌株L-色氨酸合成的代謝流量分布圖L-色氨酸合代謝流量分布圖的建立重組菌株與出發菌株的代謝流分析比較本研究所用菌種為苯丙氨酸和酪氨酸缺陷型，因此代謝途徑中不考慮苯丙氨

7、酸和酪氨酸合成支路。結合上述分析，建立代謝網絡。分別測定并計算擬穩態時期2628 h的葡萄糖消耗速率、色氨酸生成速率及發酵液中能夠檢測到的丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸和組氨酸的濃度變化速率。實驗分析出發菌株和重組菌株色氨酸合成的代謝流分布L-色氨酸菌種選育代謝工程總結12對大腸桿菌中心代謝途徑的基因操作，tktA和ppsA的過表達、csrA的敲除，以及二者的疊加，均能有效改變中心代謝途徑的流量，并增加L-色氨酸生成的代謝流。tktA和ppsA過表達的影響更為顯著，雖然csrA的敲除對各代謝途徑影響不大，但可以適當補充因分流而造成的PEP的不足，在質粒pEML03存在的情況下能顯著增加L-色氨酸生成的

8、代謝流。4展望請輸入您要的內容請輸入您要的內容請輸入您要的內容請輸入您要的內容請輸入您要的內容請輸入您要的內容藥物生物合成的新方向基因工程的高級階段新的科學領域參考文獻1劉萬宏,黃璽,張巧卓. 青蒿素生物合成與基因工程研究進展J. 中草藥,2013,01:101-107.2潘希武,盧山. 青蒿的萜類代謝及其生物工程J. 云南中醫學院學報,2009,04:60-63.3孔建強,王偉,程克棣,朱平. 青蒿素的合成生物學研究進展J. 藥學學報,2013,02:193-205.4申彤,徐慶陽,張成林,謝希賢. 大腸桿菌L-色氨酸合成的代謝流分析J. 生物技術通訊,2014,01:49-52.5Shen T, Liu Q, Xie X, et al. Improved production of tr