1、4. Western Blot 定量分析（1）腎臟組織總蛋白的提取1）用4的0.01M PBS 稀釋10細胞裂解液。取300l/EP管，標記，置冰上。2）從-80冰箱中取出約50mg冰凍組織，置于液氮中速凍。研磨后移入EP管；3）每個EP管中加入300L細胞蛋白裂解液，反復吹打混勻，振蕩器振蕩15s，冰上靜置反應20min；4）低溫快速離心收集管壁殘液；5）用UP200S超聲粉碎儀在冰上進行超聲粉碎，500Wx30s，以剪切DNA，降低粘稠度；6）低溫(4)離心12000轉15min，留取上清； 7）取2L上清，測定蛋白濃度，其余分裝后儲于-80備用。(2) 基側膜蛋白提取：取足量腎皮質于冰蔗

2、糖（250mmol/l蔗糖，5mmol/l tris-hepes,pH 7.4, 0.1mg/ml PMSF）緩沖液，離心1200gx15min；留上層物，離心22000gx15min；將松散的上層懸于蔗糖緩沖液，吹打均勻，并加入Percoll，離心39250gx30min，保留最暗的一層，用KCL緩沖液（85mmol/l KCl, 83mmol/l 蔗糖，2mmol/l trishepes，pH7.4）清洗3次，最后將膜蛋白提取物重懸于250mmol/l甘露醇緩沖液（250mmol/l 甘露醇，10mmol/l tris-hepes, pH 7.4, 0.1mg/ml PMSF）。基側膜成分

3、以Na-K-ATPase活性鑒定，該酶在基側膜活性比在勻漿中活性可高10倍【50】。 （2）蛋白濃度的測定1）標準曲線的繪制：將牛血清白蛋白（BSA）標準品用無菌生理鹽水稀釋成0l/ml、12.5l/ml、25l/ml、50l/ml、100l/ml、200l/ml共六管蛋白標準品。在核酸蛋白測定儀上設定相應的參數，以無菌生理鹽水為空白管調零，在儀器上測定上述各管蛋白標準液的A值，然后繪制成標準曲線。2）樣品蛋白濃度的檢測：取2l蛋白樣品溶液加入無菌生理鹽水98l中，在儀器上測定A值，根據標準取曲線及稀釋倍數即可得出樣品總蛋白濃度。（3）SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳1）按Bio-Rad 說明書裝好

4、電泳用的玻璃裝置2）灌注分離膠和積層膠：分離膠 水 1.9ml30%丙烯酰胺 1.7ml 1.5M Tris HCL 1.3ml 10%SDS 0.05ml 10%過硫酸氨 0.005ml TEMED 0.005ml (灌膠前加)按上述成分和比例混勻，先加分離膠至玻璃緣下2cm 左右（預留梳子1cm 和積層膠1cm 左右），去離子水覆蓋。1020min 待分離膠聚合后，可見凝膠和水層之間明顯的界面。積層膠水 1.4ml30%丙烯酰胺 0.33ml1.0M Tris-HCL 0.25ml10%SDS 0.05ml 0.02ml10%過硫酸氨 0.002mlTEMED 0.005ml (灌膠前加)

5、灌積層膠：待分離膠聚合后倒掉去離子水，加按上述成分和比例混勻的積層膠。插入梳子，避免氣泡混入。放置至凝膠完全聚合。3）樣品準備：2上樣緩沖液和蛋白溶液按體積1：1 混勻，100加熱10min，瞬時離心。4）電泳：待濃縮膠完全聚合后，小心拔出梳子，去離子水沖洗梳孔，吸去多余水分。將玻璃板固定于垂直電泳槽中，充滿1電泳緩沖液。按照預定的上樣順序，每樣本20l，上樣完畢在剩余的加樣孔中加入等體積1SDS上樣緩沖液。積層膠電壓90V，待蛋白在積層膠和分離膠交界線壓薄后，換成電壓140V 至溴酚藍達分離膠底部，結束電泳。5）轉膜：將與分離膠大小一致的NC 膜100甲醇中浸泡1min，與分離膠、濾紙墊和海

6、綿墊一起放入預冷的1轉膜緩沖液中15min。按操作說明安裝轉膜系統：從負極到正極依次為海綿墊、濾紙墊、分離膠、NC 膜、濾紙墊和海綿墊。充滿預冷的1轉膜緩沖液，在負極側放入冰盒，以維持轉膜系統溫度不致太高。恒壓100V，轉90min。6）抗原抗體反應：電轉結束后，取出NC 膜，標記正反面后在TBS 中漂洗。7）麗春紅溶液染膜2min，去離子水漂洗，可以看到紅染的分子量大小不一的蛋白。TBST 洗去麗春紅。8）5脫脂奶粉室溫下阻斷60min，TBST 洗，10min3 次。9）孵育一抗：分別加入1：800 一抗稀釋液 稀釋的兔抗大鼠OAT1多克隆抗體，1:400一抗稀釋液稀釋的兔抗大鼠OAT3多

7、克窿抗體和1:1000 TBST 稀釋的-actin。4振蕩過夜后，TBST 洗，10min3次。10）孵育二抗：加入1：1000 5脫脂奶粉稀釋的HRP 標記的抗兔二抗，室溫下孵育60min 后，TBST 洗，10min3 次。11）顯影檢測：按Phototope-HRP Western Blot Detection System（CST，USA）操作規范，去離子水稀釋20X LumiGLO 和20 xPeroxide 成1x工作液。把NC 膜浸入ECL 發光液1min，濾紙吸除過多水份，保鮮膜包裹后放入暗盒。暗室中把KODAK膠片放入暗盒，曝光1min。然后放入自動洗片機中沖洗和烤干。12

8、）圖像分析：在凝膠成像和化學發光圖像分析系統上掃描和進行灰度分析。5.Na,K-ATPase活性：按照南京建成生物研究所Na-K-ATPase活性試劑盒說明書測定基側膜Na，K-ATPase活性小弟是新人，最近要用Xho和Hind酶切pGL2載體的MCS，由于兩種酶的Buffer不一樣所以只好分開兩次酶切。設第一次酶切的體系為20l，那反應后怎樣才能回收這20l中的載體以用作第二次酶切的底物呢？謝謝！我是直接用1/10醋酸鈉（PH5.2），2倍體積的無水乙醇直接沉淀過夜或者35個小時，然后離心，晾干，水溶后再用第二個酶進行切割。一般建議同時進行雙酶切（在兩種酶有通用buffer的情況下）第二，

9、采用酒精沉淀的方法。（1）在你第一次酶切后的產物中直接加入2.5-3倍體積的95%的乙醇，同時還要加入十分之一體積的3M的醋酸鈉（PH=5.2),混勻 放入-20度凍幾個小時或者過夜都沒有關系（2）13000RPM離心，傾倒出上清（但建議你最好用槍頭慢慢吸取上清，以免DNA有損失），應該可以看到顆粒狀的貼壁沉淀物（3）再加入一定量的70% 乙醇，輕輕洗滌沉淀后，離心去上清（同上面）（4）超靜臺里吹干（不能太干，10分鐘左右就好），水溶，加入第二種酶切體系對于第二次酶切產物，建議用回收試劑盒回收純化，這樣的話，DNA的損失是不大的第三，可以對第一次的酶切采取去另酸化處理，然后再進行二次酶切，這樣

10、也可以酶切充分的以上三種方法，你可以根據具體條件進行選擇沒必要，第一次酶切完后高溫使酶失活（具體溫度要看酶的失活溫度），然后再加入第二個酶及buffer，兩種酶的使用先后應該視所用的buffer而定，先用鹽離子濃度低的酶切再用鹽離子濃度高的酶切酶切，如果要使用兩種BUFFER不一樣的酶進行酶切，則應該先用鹽濃度低的再用鹽濃度高的去切。系統配好好，放37溫箱4個小時，4小時后取出，加入第二個酶系統，記得扣除先前加的那些液體的量，具體操作見我的那個本子。北大徐國恒教授做westernBLOT 的心得“樣品制備盡量用標準的protocol，因為步驟越多，則越容易出錯。蛋白樣品制備步驟過于繁瑣，是很多

11、新手失敗的原因。忠告，不要用所謂的蛋白制備方法，把所有的蛋白裂解在loading buffer里就可以了。抗體濃度高，可能是做不出來的主要原因。商品化的抗體很少做不出來。要是濃度太高了，背景可能漆黑一片。建議一抗1：1000-1：2000，二抗1：40001：10000.關于轉膜液中加入SDS，最好不要這樣做。標準的做法是轉膜前洗膠，把SDS洗掉。因為加SDS可能增加某些大分子150kd蛋白的溶解度，但是小分子則可能就此穿膜而過。轉膜前的泡膠最好小于十分鐘，因為過小的蛋白可能被洗去，要小心。電轉的問題，電泳的時候最好用恒壓80-100 2h（不要小于兩個小時。），但是轉膜的時候最好用恒流，200-400mA，保證充足的電流和時間。雖然低溫有利于保存抗原性，但是稍高一點也沒太大損失。（不正規操作，慎）、轉膜最好用硝酸纖維素膜。關于多余條帶。含天冬氨酸脯氨酸的蛋白，如IL-10，容易在偏酸性的條件下加熱降解，樣品bufferPH中性即可避免，應盡量避免過分煮沸2-5分鐘即可。熱變性是非常重要的，甚至重要過sds變性。在轉膜液中需不需要加甲醇，甲醇可防止大于20%的凝膠在水中膨脹變形，但小于