1、全國基層(jcng)醫療機構抗菌藥物合理應用培訓(pixn)項目共六十七頁臨床(ln chun)微生物實驗室規范化管理天津市第一(dy)中心醫院 張堅磊共六十七頁臨床微生物學所面臨(minlng)的挑戰 （一）新傳染病的不斷出現 使臨床對感染性疾病的診斷和治療陷入了困境 （二）多重耐藥細菌的出現 隨著抗生素的廣泛應用，我國已經提早步入(b r)抗生素高水平耐藥的國家行列，某些菌株的耐藥性甚至位居全球之首 共六十七頁及時、準確的病原菌診斷正確的形態學分析(fnx)與病原鑒定，具備疑難病原確認技術細菌耐藥性監控標準的抗藥性檢測與結果解釋醫院感染的監控 能快速反應醫院感染與應急事件 必須規范臨床微生

2、物實驗室的管理臨床(ln chun)微生物室所面臨的任務共六十七頁國際(guj)上實驗室的規范化標準美國國會的臨床實驗室改進法案修正案1988（簡稱(jinchng)CLIA88）法國政府也于1999年11月發布了NOR：MESP9923609A關于正確實施醫學生物分析實驗的決議。 ISO 15189醫學實驗室質量和能力的具體要求共六十七頁衛生部于2006年6月1日頒布 醫療機構臨床實驗室管理辦法2008年31家醫院實驗室通過(tnggu)認可ISO15189醫學實驗室質量和能力的專用要求我國實驗室規范化管理(gunl)進程共六十七頁臨床(ln chun)實驗室管理辦法第一章 總則 （5條）第

3、二章 實驗室管理的一般規定 （16條）第三章 實驗室質量(zhling)管理 （11條）第四章 實驗室安全管理 （11條）第五章 監督管理 （9條）第六章 附則 （4條）共六十七頁5. 技術要求5.1 人員5.2 設施和環境條件設施5.3 實驗室的設備(shbi)5.4 檢驗前程序5.5 檢驗程序5.6 檢驗程序的質量保證5.7 檢驗后程序5.8 結果報告ISO 15189醫學實驗室質量(zhling)和能力的專用要求共六十七頁ISO15189認可(rnk)與微生物實驗室 ISO15189醫學實驗室質量和能力的專用要求按照其質量管理體系要求，改進檢驗流程、規范實驗操作、提高檢測能力，使每項微生

4、物檢驗技術與診斷報告可追溯到體系的源頭，為客戶提供準確、快速、安全、經濟的微生物專業診斷服務. 既從病人準備(zhnbi)、標本采集、標本傳遞與方法選擇，到診斷報告得出、結果解釋與指導臨床的標準化過程. 共六十七頁參考(cnko)CLSI 文件從以下7方面提出建議標本采集和運送的基本規范；培養前標本質量檢測基本規范標本分離的基本規范細菌鑒定基本規范；細菌藥物敏感試驗(shyn)基本規范；實驗室質量保證基本規范；細菌報告基本規范； 共六十七頁一.標本采集(cij)和運送標本采集和運送是細菌培養成功的最最重要的關鍵微生物人員和臨床醫護人員一道，根據臨床微生物檢驗規范的規定，研討和制定本院微生物標本

5、采集、保存和運送的具體要求。要廣泛宣傳，認真實施，建立健全標本驗收制度(zhd)，對于不合格的標本要堅決退回，說明原因，要求重送。共六十七頁美國(mi u)與歐洲對實驗室的新要求NCCLS M40 標 準 DIN 58942 標 準 共六十七頁1.痰標本的采集(cij)和運送 1. 標本采集(cij)時間：用抗生素前2. 采集方法：自然咳痰：必須用請水漱口3次，應包括咽喉部，立即用力咳出痰，于滅菌容器中或輸送培養基中。支氣管鏡或支氣管毛刷:由醫生采集，建議直接種入輸送培養基共六十七頁2.泌尿標本(biobn)的采集和運送 1采集后的標本應立即送檢。2采集時間：多數藥物(yow)從尿道排泄，所以

6、不管用哪種方法都應在用藥前采集。應采集早晨第一次的尿。3 標本管不應含防腐劑和消毒劑。4.長期留置導尿管的患者應在更換新管時留取尿標本。5. 做厭氧培養時應膀胱穿刺采集尿。共六十七頁3.分泌物的采集(cij)和運送 1. 對開放性病灶的采集：如眼結膜膿性分泌物、扁桃體、外耳道、手術后切口、導管治療(zhlio)感染、瘺管內膿液、生殖道分泌物等均屬于開放性病灶。應先用滅菌生理鹽水沖洗表面污染菌，去除舊的分泌物，用滅菌拭子采集病灶深部的分泌物，也可取感染部位下的組織送檢。2. 閉鎖性膿腫：如淋巴膿腫、肺膿腫、肝膿腫、腹腔膿腫、盆腔膿腫等，對封閉的膿腫常采用穿刺或引流的的方法采樣，應在用藥前采集，應

7、注意膿液的氣味、性狀、顏色注意厭氧菌存在的可能。不能及時送檢應應用輸送培養基。共六十七頁4.便標本的采集(cij)和運送 1.采集時間：腹瀉患者應在用藥前、急性期采集；沙門菌感染、腸熱癥應在2周內采；厭氧菌出現癥狀即采集。2.采集方法：自然排便者可用小木棒挑取有膿血和黏液的部位的糞便2-3克，如液狀糞便取絮狀物盛于無菌的、密封的、不吸水的、容器內或直接盛于增菌液或保存(bocn)液中；對不易獲得糞便患者及幼兒，可用直腸拭子采集后置保存(bocn)液或輸送培養基中送檢。共六十七頁便標本(biobn)的采集和運送 注意事項：雖然糞便標本本身含很多細菌但也要用無菌容器。在患者病情許可的條件(tioj

8、in)下應在用藥前采集標本。應床邊接種或置輸送培養基送檢。厭氧細菌（難辯梭菌）培養的標本應盡量減少與空氣接觸。共六十七頁5.厭培養標本的采集(cij)和運送 1.痰標本的厭氧培養標本采集：必須用氣管穿刺(chunc)法獲得痰液，從口腔吐出的痰標本不能用于厭氧培養。2.尿標本的厭氧培養標本采集：恥骨上膀胱穿刺獲得尿標本可用于厭氧菌培養 3便標本厭氧培養標本采集： 可用排出的便做厭氧培養但也應少與空氣接觸。共六十七頁 6.血液及骨髓標本的采集(cij)和運送 1.采血時間：盡可能在用抗生素前，心內膜炎例外。2. 采血量：至少應采一套2瓶，分需氧和厭氧。血量按培養瓶要求，先將1注入需氧瓶，再將剩余血

9、注入厭氧瓶。3. 采血方法：不要與血氣和血沉標本一起采血；不推薦血入瓶前換針頭；不推薦靜脈血直接入瓶；不宜在靜脈導管(dogun)或靜脈留置口采血。共六十七頁血液及骨髓( su)標本的采集和運送 4.采血間隔：如第一次采集(cij)2套（4瓶）血培養標本，在以后的2-5天不必采血，但除外心內膜炎和導管相關性敗血癥。5. 兒童：采血量是總血量的1%。6.延遲培養瓶處理: 延遲培養瓶不要放冰箱或孵箱，放常溫，盡早送往臨床細菌室。7.皮膚消毒液推薦：建議先用70-80%異丙醇去脂，再用葡萄糖酸氯乙定消毒。共六十七頁二.標本培養(piyng)前的基本規范1.痰培養(piyng)標本實驗室在接種前必須作

10、痰涂片革蘭染色，當在低倍鏡下白細胞25個/LP時應作為不宜做培養的標本；當白細胞 10個/LP，上皮細胞20個/油鏡或該菌占所見到細菌的50%,可推測是標本中的優勢細菌.共六十七頁 有了合格的標本是保證培養成功的重要條件，但如果沒有適宜的分離培養基和培養環境同樣不能獲得好的結果(ji gu)，為此制定如下基本條例以保證致病細菌分離成功。三.分離(fnl)培養基本規范共六十七頁1.痰培養(piyng)1培養基：5%羊血瓊脂、5%兔血巧克力瓊脂、中國蘭瓊脂或伊紅美蘭、或加MRSA顯色瓊脂。2培養環境：5%羊血瓊脂、5%兔血巧克力瓊脂、置5-7%CO2、35環境培養，其他(qt)培養基置35空氣培養

11、。3結核培養：羅氏雞蛋斜面，每一標本種2支，37空氣培養。共六十七頁2.尿標本(biobn) 1培養基：5%羊血瓊脂、中國蘭或伊紅美蘭，或CP3尿致病菌分離顯色瓊脂。2.菌落(jnlu)計數：每個標本都要做，用加樣器或定量接種環取樣本10ul分別接種于上述培養基均勻涂布整個平皿，此日作菌落(jnlu)計數。3培養環境：35空氣環境培養 共六十七頁3.便培養(piyng) 1培養基：中國蘭或伊紅美蘭，沙門氏志賀氏瓊脂（SS瓊脂）或加沙(ji sh)門菌分離瓊脂。2培養環境：35空氣環境培養。3疑似偽膜性腸炎：5%羊血瓊脂、沙保弱瓊脂斜面、梭狀芽孢桿菌分離瓊脂（CCFA）。5%羊血瓊脂、沙保弱瓊脂

12、斜面置35空氣環境培養。CCFA置35厭氧環境培養。其他特殊腸道致病菌培養按國家CDC要求執行。 共六十七頁4.腦脊液培養(piyng) 1培養基：5%兔血巧克力瓊脂(qingzh)、5%羊血瓊脂(qingzh)。 2培養環境：35，5-10%CO2環境培養。共六十七頁5.分泌物培養(piyng) 1培養基：5%羊血瓊脂(qingzh)、5%兔血巧克力瓊脂(qingzh)、 中國蘭或伊紅美蘭、葡萄糖肉湯2培養環境：35空氣環境培養。共六十七頁6.膽汁(dnzh)或胸水或腹水 1培養基：如標本量大時可按血液培養方法直接取16-20ml分別(fnbi)種入需氧和厭氧培養瓶。如標本量有限，可接種5%

13、羊血瓊脂、5%兔血巧克力瓊脂、中國蘭或伊紅美蘭、葡萄糖肉湯。2培養環境：35空氣環境培養。共六十七頁四.細菌(xjn)鑒定規范操作1. 涂片染色一涂片染色：應具備最基本的兩種染色技術，即革蘭氏染色和抗酸染色。1 革蘭染色：革蘭染色報告必須包括染色反應或微生物種類和類別，描述物種的形態或結構。如革蘭染色見到革蘭陽性球菌，呈葡萄(p to)狀排列；又如革蘭染色見到真菌小分生孢子及菌絲。共六十七頁涂片(t pin)染色 2.抗酸染色：抗酸染色報告應顯示找到或未找到或可疑抗酸桿菌(gnjn)三種結果，報告中應以加號體現標本中抗酸桿菌(gnjn)的存在量。如找到抗酸桿菌(gnjn)+；見到染色不典型抗酸

14、桿菌(gnjn)+，建議再送標本。不能報告找到結核桿菌但可報告未找到結核桿菌共六十七頁2. 趨向性鑒定(jindng)試驗 革蘭陽性球菌:觸酶試驗:3%H2O2用30%的H2O2稀釋10倍后使用，避光4度保存 ；試驗時設立陽性和陰性(ynxng)對照；1分鐘內產生大量氣泡為陽性。凝固酶試驗：采用商品試劑或EDTA抗凝的多個兔混合血漿；測定玻片法測定凝聚因子10秒鐘即可觀察結果；測定凝固酶需在37度3-4h，若陰性還應放置24h再觀察結果。共六十七頁革蘭陰性桿菌(gnjn):氧化酶試驗 建議用紙片法保存比較方便；試劑配制：1%鹽酸四甲基對苯二胺水溶液陽性(yngxng)：由粉紅變為藍紫色為陽性(

15、yngxng)對照：銅綠假單孢菌 ATCC 27853 + 大腸埃希菌 ATCC25922 - 共六十七頁3.血清學試驗(shyn) 腸道致病菌生化特征符合的前提下必須有血清學的試驗作最后確認，基層細菌室應具備1-3項血清試劑。 1.志賀氏菌多價和單價凝集血清：2.沙門氏菌(sh mn sh jn)多價和單價凝集血清3.致病性大腸桿菌多價和單價凝結血清共六十七頁4.真菌(zhnjn)鑒定1每一基層實驗室必須開展真菌涂片，報告臨床是否找到真菌；是否見到真菌菌絲；從形態辨別常見(chn jin)絲狀真菌;區別曲菌或毛霉菌。2開展酵母樣真菌分離培養，應具備最基本的沙保弱培養基或用顯色培養基，鑒別白念

16、和非白念，隱球菌等。3.有條件的實驗室應開展非培養的鑒定方法，如-D葡聚糖的檢測。共六十七頁五.藥敏試驗的規范(gufn)操作 1. 用CLSI指南推薦的KB藥敏標準進行(jnxng)常規藥敏試驗判斷。2.根據CLSI更新及時替換應用的標準。3.根據CLSI推薦的方法，開展重要耐藥菌的檢測，如MRSA、VRE、HLARE、ESBL。共六十七頁 紙片擴散(kusn)法AST操作步驟 制備(zhbi)接種物（0.5麥氏單位） 接種（15分鐘內接種，涂抹均勻） 在接種好的瓊脂平板上貼加紙片 孵育（15分鐘內反轉平板，35C空氣孵育） 苛養菌5CO2孵育 判斷結果和解釋結果共六十七頁AST紙片擴散(k

17、usn)法 判讀結果 將游標卡尺置于反轉的平板的背面，測量到最接近的整數毫米數。平板應距離一個黑色不反光的背景(bijng)，并用反射光照明。 如果是加血的瓊脂培養基，則應在透射光照射下，打開培養皿蓋，從上表面測量抑菌圈。 如果被測菌是葡萄球菌或腸球菌，則應孵育24小時，再在透射光下分別觀察苯唑西林或萬古霉素的透明抑菌圈內有無耐甲氧西林或耐萬古霉素菌落的微弱生長。共六十七頁ESBL初步篩選(shixun)實驗頭孢泊肟 10ug or 頭孢他啶 30ug氨曲南 30ug or 頭孢噻肟 30ug頭孢曲松 30ug 藥敏紙片頭孢泊肟抑菌圈 =17mm* 頭孢他啶抑菌圈 =22mm氨曲南抑菌圈 =

18、27mm 頭孢噻肟抑菌圈=27mm頭孢曲松抑菌圈 127Cefotaxime NANAAztreonam122Ceftazidime1*22*Cefpodoxime稀釋法 (g/ml)紙片擴散法 (mm)Drug*P. mirabilis 不同于其他(qt)菌 (比如 17 mm and 4 g/ml for E. coli and Klebsiella spp.); NA, 不適用 CLSI M100-S16; Table 2A (M2, M7)43NEW共六十七頁ESBL確認(qurn)試驗共六十七頁ESBL的質控頻率(pnl)篩選試驗和表型確證(qu zhn)試驗均可每日進行或每周進行，

19、所選擇菌株為肺克700603或大腸埃希菌25922。 應該注意的是：肺克700603ESBL基因在質粒上，應將其凍存于-60或以下。共六十七頁可誘導的克林霉素耐藥 (erm-介導)常規D試驗: 陽性(yngxng) 15 g 紅霉素紙片及 2 g克林霉素之間距離為15-26.“D Test” 陽性反應 共六十七頁2006強調(qing dio)mecA介導的葡萄球菌(p to qi jn)耐藥的表型試驗 紙片擴散法 用頭孢西丁 (CX DD 30 g) 紙片金葡菌 其結果等于苯唑西林紙片(OX DD)結果。CoNS 結果優于苯唑西林紙片的結果。結果清晰，讀起來比苯唑西林容易。報告時仍寫苯唑西林

20、，而不寫頭孢西丁。MIC試驗 仍用苯唑西林藥。43共六十七頁 Confirmatory Tests for Suspected Carbapenemase Production in Enterobacteriaceae 2009共六十七頁需證實(zhngsh)藥敏試驗的結果和確認菌種的鑒定共六十七頁CLSI 在表格的導言中對ESBL增加(zngji)了警告 “Warning” 條文NEW共六十七頁六.質量(zhling)控制的規范化1藥物敏感試驗的質量控制：應包括30天的初始質量穩定測試；每周一次的常規質量控制；5天的糾控程序。2鑒定試劑質量控制：購入新的試劑；在更換批號(p ho)；更換生

21、產廠家；結果發生異常等情況時均應進行質量控制。3染色液質量控制：每天臨床標本染色前應包括染色結果陽性和陰性的對照物及染色液污染的質量檢查。共六十七頁質量(zhling)控制內容4分離培養基：如血瓊脂和巧克力，用肺炎鏈球菌、B-溶血和草綠色溶血的鏈球菌、流感嗜血桿菌、等苛養細菌的標準菌株或經標準化試劑已證實結果正確的菌株進行測試(csh)，判斷其分離能力。5.培養箱溫度的質量控制：每天第一個開箱和最后離開實驗室均應對培養箱的溫度作記錄；CO2培養箱還應記錄CO2的含量。 共六十七頁質量(zhling)控制內容6冰箱溫度記錄：按每一冰箱存放的物品不同設置不同的質控范圍，特別對低溫冰箱；每天記錄一次

22、。7自動化設備：按廠家提供的SOP文件進行質控；在設備軟件升級或修改(xigi)版本時均應進行質量控制程序。8.每一有權向臨床發報告的實驗室都應參加全國或省或市級質量控制活動。共六十七頁細菌實驗室應對不同的細菌檢驗報告時間和內容應有(yn yu)相應的規定，并告訴臨床各科，依此可防止不明原因的報告延遲應分兩種報告形式：1.危重感染報告:2.常規報告:七.臨床(ln chun)細菌室報告制度的規范共六十七頁 1.涂片(t pin)報告1.革蘭染色： 危急報告30分鐘報告。 報告內容應包括染色反應、是細菌或真菌、細菌形態(xngti)。有無細胞內吞嗜現象，有無菌絲。2.抗酸染色：報告抗酸染色陽性或

23、陰性；菌量以加號表示。 常規報告24h,危重報告1h2。共六十七頁2.血液(xuy)和無菌體液培養的報告制度 實行三級報告制度：第一級：培養液直接涂片結果；第二級：初步(chb)藥敏結果和平皿菌落涂片結果；第三級：正式細菌鑒定和藥敏報告。共六十七頁3.便培養(piyng)24小時可發出初始報告;72小時應報告藥敏試驗結果(ji gu)；根據檢測范圍報告檢測結果，如未檢測出沙門菌、志賀菌。 錯誤報告: 未見到致病菌共六十七頁4.尿培養(piyng)可在24小時報告初始結果，包括菌落計數和可能細菌種類(zhngli)，如氧化酶陰性的革蘭陰性桿菌；金黃色葡萄球菌等。 共六十七頁5.痰培養(piyng)24小時初始報告，報告內容包括痰標本是否合格(hg)，優勢細菌，金葡菌、銅綠假單孢菌等特征明顯細菌的鑒定結果。共六十七頁6.分泌物報告(bogo)24h初始報告：有無細菌生長；革蘭陽性(yng