1、1. Western Blotting方法直接法：優點： 1.快速（一種抗體） 2.沒有二抗交叉反應引起的非 特異性條帶 缺點： 1.免疫反應性降低 2.無信號二級放大 3.抗體標記費時昂貴,使用不方便1Western Blotting方法間接法：優點： 1.免疫特異性不受標記影響 2.信號放大,靈敏度高（多個二抗結合位點） 3.多種標記的二抗可供選擇 4.可選擇不同的Marker缺點： 1.有交叉反應引起的非特異性條帶 2.額外的二抗孵育以及條件優化2YYHRPHRPHRPSuperSignal 底物與二抗HRP,AP反應,顯色或發光5SuperSignalHRP,AP標記二抗與一抗蛋白復合

2、物結合42漂洗和封閉1電泳分離，轉膜，固定蛋白于膜上3一抗與蛋白結合 (小鼠單抗 或兔多抗)間接Western Blotting操作流程: 32. 兩種檢測酶系統的比較43. 檢測方法化學發光法: 靈敏、快速、高效、無害、特異性高化學顯色法: 方便、有毒、靈敏度較低、不易保存同位素法 : 靈敏度高、不安全、 環境污染、不方便和半衰期短熒光底物法54. 影響Western blotting成功的要素蛋白抽提/樣品制備/電泳膜的選擇和轉膜封閉液的選擇和封閉條件的優化一抗和二抗的選擇以及稀釋倍數的優化 “通用”二抗合適的底物：發光或顯色底物曝光時間的掌控X- 光片,信號增強劑Striping 抗體剝

3、離bufferEraser it底片背景去除劑6蛋白抽提/樣品制備/電泳蛋白抽提M-PER培養細胞總蛋白提取試劑Pro#78501, 78503, 78505T-PER動物組織總蛋白提取試劑Pro#：78510B-PER細菌總蛋白提取試劑Pro#：78243, 78248，78260，78266Y-PER酵母總蛋白提取試劑Pro#:78990，78991，78998 和78999I-PER昆蟲細胞總蛋白提取試劑Pro#:89802P-PER植物細胞總蛋白提取試劑Pro#:89803Mem-PER真核膜蛋白提取Kit Pro#:89826NE-PER胞質 & 核蛋白抽提試劑Pro#78833線粒

4、體抽提Kit Pro#：89874蛋白酶抑制劑樣品中是否有干擾物質各種預制膠，轉膜液，Markers7膜的選擇和轉膜膜：NC，PVDF轉膜成功？QentixTM信號增強劑MiserTM抗體節約緩沖液（1/3100)膠上Western blotting8轉印膜比較PIERCE：NC，PVDF9封 閉封閉液的選擇無生物素，無血清蛋白無交叉反應115分鐘封閉時間1020：1的信噪比封閉條件的優化時間溫度去污劑10如何選擇封閉液11漂洗緩沖液即開即用用途廣泛12一抗和二抗的選擇以及稀釋倍數的優化一抗和二抗的選擇：一抗的特異性（單抗，多抗，片斷）濃度二抗：HRP活性（耦聯效率）來源，濃度通用”二抗：HR

5、P標記蛋白A,G,A/G,L以及SA-HRP酶標二抗活性的保持 (1) ethylene glycol,Pro#29810,20可保存2年 (2) SuperFreez HRP二抗穩定劑：1：1稀釋（Pro#:31503), 20可保存1年 (3) Guardin HRP二抗穩定保存劑 （Pro#:37548，37552)，1：1000或1：100，000 倍稀釋，4可保存1年，室溫6個月稀釋倍數的優化13最佳抗體稀釋倍數（點雜交）25ul不同稀釋梯度的樣品于NC膜，自然干燥1030min室溫封閉1h加入一抗/二抗：1/20,1/100; 5/20,5/100) X000TBS或PBS洗膜46

6、次X5min(0.05% Tween-20)加入二抗,室溫孵育1hTBS或PBS洗膜46次X5min底物孵育：8cm2/mL曝光時間：3060 Sec14底物選擇：靈敏度方便與否經濟與否15Pierce Western Blotting底物一覽16SuperSignal Western 化學發光底物Western Pico底物和KitWestern Dura增強底物和KitWestern Femto 超高靈敏型底物KitPierce ECLLumi Phos堿性磷酸酶化學發光底物Twice the flash. Half the Cash17SuperSignal 化學發光底物發光的原理和特點

7、高靈敏度：比化學顯色法高103-106倍快 速：1 min高特異性：高信/噪比檢測方便： X光片或CCD檢測多次曝光：選擇滿意的信號強度反復檢測：用不同特異性抗體，對同一蛋白上不同決定簇進行檢測分析181. SuperSignal West Pico化學發光底物 是用于Western bloting 的最經濟高效的選擇19SuperSignal West Pico與ECLTM發光強度和靈敏度比較SuperSignal West Pico 5分鐘發光ECLTM系統5分鐘發光結果：相同條件下:一抗1ug/mL,二抗20ng/mL，SuperSignal West Pico底物產生的光強度是ECL底

8、物的2倍20穩定性常溫下穩定保存至少1年，無須預熱，直接使用工作液常溫下至少保持24小時，光或黑暗均可用21圖示：SuperSignal West Pico 與ECLTM系統發光動力學比較：兩種底物系統6h后相對發光強度比較 信號持久性信號持續至少6小時，足夠的時間來優化曝光條件22更節約寶貴的抗體:極大的減少一抗用量,是同類產品一抗用量的1/5-1/10，稀釋倍數是10005000倍二抗用量是同類產品二抗用量的至少1/10，稀釋倍數是2000010000倍注意：抗體的稀釋倍數是由底物和待檢測蛋白質的豐度決定的，為了獲得最佳實驗結果，強烈推薦進行點雜交預實驗，以確定具體的實驗參數。23Supe

9、rSignal與ECL花費比較24如何選擇合適的Pico底物或Kit底物（50ml，100ml，500ml，1L）標準檢測Kit：500ml底物2ml山羊抗鼠，兔二抗完整檢測Kit： 500ml底物2ml山羊抗鼠，兔二抗1L封閉液4包洗脫液252. Pierce ECL Western Blotting Substrate 一半的價錢無須優化任何條件Pro#:32106(500mL);32209 (250mL) 32109 (50mL)New263. SuperSignal Dura-化學發光底物24小時發光時間：比任何其它改良的HRP化學發光底物提供的要長10倍；10-14克級靈敏度節省抗體

10、：抗體稀釋度達一抗1000-50,000和二抗50,000 -250,000倍立即產生強烈信號，特別適合CCD儀器檢測工作液穩定24小時；常溫保存一年27如何選擇合適的Duro底物Kit底物Kit：20ml標準檢測Kit： 100ml底物1ml山羊抗鼠 1ml山羊抗兔二抗 200ml底物1ml山羊抗鼠 1ml山羊抗兔二抗284. SuperSignal Femto化學發光底物最靈敏的化學發光底物： 10-15克一抗稀釋度：1/5000-100,000二抗1/100.000-500.000用于極端微量樣品的檢測抗體珍稀樣品的檢測穩定：4一年，室溫半年免費Pierce高質量二抗29如何選擇合適的F

11、emto底物Kit底物Kit：20ml標準檢測Kit： 100ml底物1ml山羊抗鼠 1ml山羊抗兔二抗 200ml底物1ml山羊抗鼠 1ml山羊抗兔二抗305. 堿性磷酸酶化學發光底物：Pro#:3415031SuperSignal 底物的突出優勢花費更少 強信號824小時的發光時間多種靈敏度選擇：10-12-10-15節約抗體:是其它底物用量的1/101/1000底物穩定326. PIERCE HRP化學顯色底物337. PIERCE AP化學顯色底物34底物與膜孵育X- 光片曝光時間的掌握顯影和定影液信號增強劑抗體剝離緩沖液底片背景去除劑底片和曝光成敗的最后關頭35特別推薦：不需反復作W

12、B的選擇一選擇抗體剝離buffer無須反復電泳和轉膜，節省寶貴時間節省珍貴的樣品溫和的無氣味配方，對嬌嫩的蛋白質絲毫無損一份樣品，一次電泳，一次轉膜，多次印跡，更多數據 36特別推薦：不需反復作WB的選擇二用于各種X光片的背景處理，例如常規的Western、Northern、Southern、EMSA等。特點/優點：去除不需要的背景，包括過度曝光、抗體濃度過高，封閉差，抗體/酶沉淀形成的高背景、陰影、雜點等不需要費時的重復曝光不需要重復優化各種實驗參數濃縮液可制備3升工作液操作極為簡便37操作，哈哈選擇Eraser it底片背景去除劑：無須反復曝光即可獲得背景干凈的X光片38特別推薦三：直接在

13、電泳膠上作WB解決了轉膜難的問題減少了因不完全轉膜造成的誤差1ng的靈敏度可剝離抗體和重新檢測Pro#：33500；33505；33510；33515；3355039特別推薦四：特定蛋白質在不同組織表達譜分析將17種正常組織和17種相應腫瘤組織如：腦，腎，肝，肺，皮膚，乳腺，卵巢，子宮，子宮頸，前列腺，膀胱，甲狀腺，腎上腺，食道，胃，結腸，直腸，點樣于NC膜，利用蛋白質免疫印跡技術來篩選和檢測特定蛋白質在17種正常組織和17種相應腫瘤組織的表達情況。對照點34種樣品3張NC膜微列陣，高通量分析Pro#:81040-81058405. 常見問題分析比較均一的高背景斑點或發泡式或閃爍式的高背景信號

14、弱或者無信號非特異性條帶彌散型條帶白色條帶/黑點/信號下降太快41比較均一的高背景原因：解決辦法抗體濃度太高優化/降低一抗和二抗濃度封閉液不適合比較嘗試不同的封閉液封閉不完全封閉液的選擇與優化增加封閉液中蛋白質濃度優化封閉時間和溫度（RT至少1小時；4過夜）封閉液中加入Tween-20；濃度0.05抗體稀釋液中加入Tween-20；濃度0.05抗體與其它蛋白質的交叉反應更換不同的封閉液；勿在Biotin/avidin體系中使用脫脂奶粉封閉減少二抗濃度檢測二抗與膜的交叉反應性42原因：解決辦法漂洗不完全增加漂洗時間和緩沖液體積漂洗液中加入Tween-20；濃度0.05曝光時間太長縮短曝光時間膜的

15、問題使用干凈鑷子；戴手套操作換一張新膜用足夠的液體，膜始終保持濕潤孵育時使用脫色搖床避免膜重疊，互相覆蓋小心操作，勿毀損膜緩沖液污染使用新緩沖液過濾緩沖液比較均一的高背景續表43斑點或發泡式或閃爍式的高背景原因：解決辦法抗體濃度太高優化/降低一抗和二抗濃度二抗聚集0.2um過濾或更換新二抗封閉液不適合比較嘗試不同的封閉液封閉不完全封閉液的選擇與優化增加封閉液中蛋白質濃度優化封閉時間和溫度（RT至少1小時；4過夜）封閉液中加入Tween-20；濃度0.05抗體稀釋液中加入Tween-20；濃度0.05抗體與其它蛋白質的交叉反應更換不同的封閉液；勿在Biotin/avidin體系中使用脫脂奶粉封閉

16、減少二抗濃度檢測二抗與膜的交叉反應性44原因：解決辦法膜沒有正確濕潤使用干凈鑷子；戴手套操作換一張新膜用足夠的液體，膜始終保持濕潤孵育時使用脫色搖床避免膜重疊，互相覆蓋小心操作，勿毀損膜緩沖液污染使用新緩沖液過濾緩沖液儀器污染保證所有儀器，用具干凈確保膜上無殘留膠斑點或發泡式或閃爍式的高背景續表45信號弱或者無信號原因：解決辦法轉膜不完全1.轉膜后，染膠以決定轉膜效率2.使用Memcode染膜以決定轉膜效率3.保證轉膜時膠與膜充分結合4.濾紙膜膠，電極方向正確裝配5.根據說明書，對膜進行處理如濕潤6.電轉時防止過熱7.使用陽性對照或預染Marker8.優化轉移時間和電流9.使用Pierce轉膜

17、緩沖液10.保證樣品處理時，樣品不被破壞（抗原決定簇）蛋白質與膜結合不充分加20甲醇于轉膜緩沖液；低分子蛋白質透過膜；使用小孔徑膜抗體增加抗體濃度；抗體與抗原結合差；抗體喪失活性抗原不足增加上樣量46抗原被封閉液遮蔽試用不同的封閉液優化封閉液中蛋白質濃度縮短封閉時間緩沖液里有疊氮鈉去掉疊氮鈉曝光時間太短延長曝光時間底物孵育時間太短5分鐘膜的選擇錯誤Pico底物首先推薦使用NC，PVDF膜需要條件優化Duro/Femto底物，推薦使用NC； PVDF；尼龍或電荷修飾的尼龍膜底物喪失活性Pico/ Duro底物室溫穩定12個月Femto底物室溫穩定至少6個月底物與二抗孵育發光檢測保證兩種底物成分沒

18、有交叉污染膜被剝離過剝離會導致抗原丟失或變性避免重復檢測膜上蛋白質被消化（gelatin)封閉物質可能有蛋白質降解活性蛋白質在儲存過程中降解重新制備樣品信號弱或者無信號續表47非特異性條帶48彌散型條帶原因：解決辦法：抗體濃度太高降低抗體濃度蛋白質上樣量太多降低蛋白質上樣量49白色條帶/黑點/信號下降太快原因：解決辦法：抗體濃度太高1.降低抗體濃度，特別是二抗濃度50部分區域發黑或有信號原因：解決辦法：不完全轉膜1.確保膠與膜之間無氣泡2.濕潤膜3.用干凈的鑷子或手套以避免污染4.換新的膜5.保證膜孵育時，膜沒有互相覆蓋51Pierce免疫印跡手冊一切問題盡在掌握!特別推薦五：52二.生物素標

19、記和化學發光檢測技術在核酸雜交中的應用“Everything is possible - with the right tools”53原理標記：采用隨機引物標記法，利用DNA聚合酶，以目標DNA為模板，在隨機七核苷酸為起始引物的作用下，將生物素標記的dUTP摻入到合成的DNA探針中，產生可用于Southern或Northern雜交實驗的高活性生物素標記的DNA探針檢測：雜交形成雙鏈，洗膜后，探針DNA上的生物素與HRP上的鏈親和素結合，HRP與Pierce 的Dura化學發光底物孵育曝光或冷光CCD檢測54 North2South 雜交原理和操作流程3、雜交：生物素標記的探針與靶DNA結合5

20、、SuperSignal Dura 底物在HRP的催化下反應發光，檢測2、洗膜封閉1、DNA電泳，轉膜，紫外交聯固定SAHRP底物BB4、HRP標記的鏈親和素與探針上的生物素結合55Kit組成該試劑盒由探針標記，雜交洗膜和化學發光檢測三部分組成North2South生物素隨機引物Kit(該試劑盒含有足以完成10次標記反應的試劑，每次可合成至少1ug的生物素標記的探針)化學發光檢測Kit 89880可檢測1080cm2的雜交膜. 56探針得率高高產率 ：模板DNA可以少至100ng，Klenow聚合酶無核酸外切酶活，產率提高，每次標記至少產生1-2 ug的生物素標記的探針; 使用方便：標記好的探

21、針可以在冰箱里保存一年。57檢測安全采用非同位素的化學發光系統，免除放射性的危險與處理同位素廢物的麻煩，減少環境污染；無須專門的同位素操作室，易于使用推廣anyone,anywhere and anytime58高靈敏度與高信噪比生物素標記的dUTP保證了與HRP標記的鏈親和素（Kd=10-15M； 抗體10-58M ）最大結合，經受最嚴謹的洗膜條件優化雜交液和封閉液保證了探針與靶DNA的完美結合Dura （10-14克）底物保證了保證了高于地高辛（DIG）-AP標記系統，等同于或者超過同位素的檢測靈敏度59方便快速0.510分鐘即可檢測到特異性信號24小時的超長發光時間允許多次曝光可以使用冷

22、光CCD成像儀掃描成像 60操作流程與時間探針標記與純化（1小時）預雜交（0.1mL/cm2 ,55或者65, 0.5小時）雜交（812小時）嚴謹洗膜（3X15分鐘,提高溫度,降低離子強度）封閉（ 0.25mL/cm2 , 輕柔振蕩15分鐘）SA-HRP孵育（,1:300稀釋度,輕柔振蕩15分鐘）洗膜（ 4X5分鐘）平衡（5分鐘）底物孵育(0.125mL/cm2 , 5分鐘) 曝光檢測（0.5 10分鐘）611. 探針制備一之探針標記 將20ul生物素標記的N4-dUTP與80ul的5XdNTP混合物充分混合備用（總量100ul）24ul 100ng探針模板于離心管中(模板DNA要定量和純化)

23、加入10ul隨機引物于上述離心管中，煮沸變性5分鐘，迅速在冰水混合物退火5分鐘加入10ul N4-dUTP與5XdNTP的混合物加入5ul 反應緩沖液加入1ul Klenow酶片斷，混勻，37孵育60分鐘加入2ul EDTA以滅活Klenow酶活性622. 探針制備二之探針純化加入5ul醋酸銨于上述50ul反應離心管，吹打混勻加入110 ul 冰預冷的無水乙醇，充分混勻，冰或70放置15分鐘12000rpm 4離心15分鐘，小心吸取出上清用冰預冷的70乙醇洗滌一次，12000rpm 4離心15分鐘，小心吸取出上清，風干沉淀50ulTE或RNA酶free 的水溶解沉淀（20或70長期保存）63探

24、針制備三之探針定量500ul去離子水，260nm調零充分混勻2.5ul 探針和47.5ul 去離子水（即稀釋20倍）分光光度計測定OD260值定量計算公式：1 OD260 dsDNA = 50 g/ml； 樣品濃度ng/ul= OD260值X50X20（注：如果稀釋20倍，實際測定的OD260值應該在0.020.05之間）Note:大多數情況下，由于各實驗室用來測定核酸的儀器不同，檢測靈敏度不同以及樣品中的一些干擾物質，測出的OD值往往是0甚至是負值，如果出現這種情況，再進行核酸定量沒有實際價值，因此，根據經驗，保守估計，在每次至少合成1ug探針的前提下，在雜交時，探針的用量按照每ul含有20

25、ng探針來使用，即每毫升雜交液加入變性的純化過的探針1-2ul.642. 雜交和洗膜之雜交平衡雜交液到室溫預雜交:將轉好的膜置于雜交管，點樣面朝上，確保膜被雜交緩沖液均勻覆蓋，雜交爐要緩慢轉動以保證雜交液與膜能充分接觸，（每平方厘米膜至少0.1ml雜交液。除了RNA:RNA雜交用65外，其他的都用55）,50-100rpm旋轉，至少30分鐘。熱變性探針：煮沸變性10分鐘，迅速在冰/鹽水混合物退火5-10分鐘雜交：加入已經變性的DNA探針于雜交液，充分混勻（探針加入到雜交液，不要加到膜上，要輕輕晃動，使探針均勻分散在雜交液中），探針濃度約30ng/ml雜交液, 50-100rpm旋轉，孵育過夜。

26、 652. 雜交和洗膜之嚴謹洗膜配制1X嚴謹洗膜緩沖液，平衡嚴謹洗膜緩沖液到室溫（溶解充分），加等體積去離子水配制所需洗膜液（0.2ml/cm2膜）將膜轉移到一個新的容器中（雜交管）。加入1X嚴謹洗膜液1020ml，旋轉洗膜3次（DNA雜交55），每次1520分鐘。663. 化學發光檢測 Note:要保證所有緩沖液充分溶解，沒有顆粒封閉：封閉液20ml（0.25ml/cm2膜）于3750振蕩封閉15分鐘抗體孵育：20ml抗體稀釋液（ 66.7ulSA-HRP20ml封閉液），室溫孵育15分鐘洗膜：20ml的1X漂洗緩沖液分別室溫輕柔振蕩漂洗4次，每次5分鐘平衡：雜交膜與30ml的底物平衡液室溫

27、輕柔振蕩孵育5分鐘底物孵育：把濕潤的膜放在一個干凈的塑料盤（平皿）里，與底物工作液在室溫下孵育5分鐘（推薦在暗室中）。確保膜被底物溶液完全淹沒或覆蓋底物工作溶液需足夠以完全覆蓋雜交膜（約0.1ml/cm2）。曝光：濾紙吸附多余底物，作好標記，保鮮膜包裹，確保保鮮膜和雜交膜間無氣泡和皺褶。把包好的雜交膜放在暗夾里，放上X光片，曝光15分鐘。曝光時間長短可以稍有變化以獲得理想的信號。從暗夾里取出X光片，顯影和定影。 Note:可與底片背景去除試劑配合使用，以獲得更理想的實驗結果67對照DNA點雜交 備用試劑：0.1N NaOH煮沸變性DNA變性成單鏈（ 對照DNA，5l，250ng/l）準備生物素

28、標記的對照探針或陽性樣品探針（見探針標記，純化和定量）準備目標膜（注意：推薦使用帶正電尼龍膜，需帶無粉手套并用乙醇凈化的鑷子拿膜。）0.1N NaOH稀釋變性DNA得到1，0.5，0.25，0.125，0.0625，0.0312，和0.015ng/l稀釋梯度。在膜上平行點兩點。點前最好把膜預洗一下，半干的時候點，但干點同樣有用。用1X TE輕輕漂洗膜（10秒），微波爐高火加熱2分鐘，紫外交聯（自動交聯）或烘干固定。注：如果沒有紫外交聯儀，則可以將膜置于80度溫箱烘烤23小時，可達到固定目的交聯固定完，用0.1SDS預濕潤膜，進入下面預雜交，雜交以及底物孵育和曝光雜交，嚴謹洗膜和封閉，抗體孵育，

29、洗膜，平衡，底物孵育以及曝光見前所述 68-Transfer BufferTransfer MethodFixationFragmentsActive GroupsNitrocellulose20X SSC or SSPECapillary1-2 hr 80C300bp80 g/cm2 sites, Non specific, hydrophobicNylon10X SSC or 10X SSPE, or 0.01-0.4 N NaOHCapillary, alkaline, electroblotting UV, microwaveAll sizes, especially smaller4

30、50 g/cm2 sites No modification-relies on UV link+ Nylon10X SSC or 10X SSPE, or 0.01-0.4 N NaOHCapillary, alkaline, electroblotting1-2 hr 65-80C, UV, microwave, alkalineAll sizes especially smaller450 g/cm2 sites, Surface amine enhances ionic/electrostatic interactionPVDFNaOHCapillary, alkaline1-2 hr

31、 80CAll sizesNon specific, hydrophobicNote 1:使用帶正電的尼龍膜69片段化以確保轉膜（去嘌呤）：. DNA 10kb ， 0.2-0.25 N HCl孵育20分鐘. RNA 5kb 0.05 N NaOH 30分鐘變性：0.4 N NaOH漂洗30分鐘 中和： 1 M Tris, pH 8, 0.6 M NaClEB去除：0.1SDS清洗轉膜：防止核酸擴散固定：微波爐固定（TE濕潤，700900W 2分鐘） 紫外交聯（120mJ/cm2,254nm1分鐘； 302nm 2分鐘（如果沒有紫外交聯儀，則可以將膜置于80度溫箱烘烤23小時，可達到固定目的）

32、 Note 2:電泳，轉膜，固定70Note 3:模板與探針使用干凈容器，以避免污染. 模板DNA要純化定量定量時不要稀釋過度，造成讀數誤差 純度：A(260)/A(280) 應該在 1.8-2.0 (DNA 1.8, RNA 2.0)擴增出的探針要苯酚/氯仿抽提純化，去掉dNTP,并且準確定量雜交前的探針要變性探針濃度:RNA:35ng/mL;DNA:-30ng/mL 71Note 4:探針剝離 Stripping SolutionStrengthDNARNATemperatureTime0.5% SDSMildYesYes6060 min5 mM Tris-Cl, pH 8.0, 2 mM

33、 EDTA, 0.1X Denhardts ReagentMildYesYes65 2 hr50% Formamide, 2X SSPEModerateYesYes65 1 hr0.4 M NaOH, 0.1% (w/v) SDS*ModerateYesNo45 , + RT30 min, + 2 x 10 minBoiling 0.1% SDSHarshYesYes100 remove from heat3 x allow to come to RT0.1X SSPE or SSC/0.5% SDSHarshYesYes100 remove from heat2 x 15 min72問題與對

34、策一問題原因解決方法出現斑塊/點 在酶、緩沖液、或底物中有不溶顆粒未稀釋探針接觸到了膜手套上的粉塵膜上的氣泡放到適當溫度，離心或過濾去除顆粒注意不要把探針打到膜上帶不含粉末的手套用緩沖液和底物均勻覆蓋膜。 73問題與對策二問題原因解決方法高背景 探針濃度過高太多HRP未稀釋的探針接觸膜錯誤的封閉液或雜交液漂洗液溶解不完全膜預雜交不完全印跡紙 降低探針濃度增加HRP稀釋度探針加到雜交液里檢查預先拿出平衡帶正電的尼龍膜增加預雜交時間膜下面用合格的濾紙（即3mm） 74問題與對策三問題原因解決方法無信號 標記失敗或探針降解曝光時間太短轉膜失敗，錯誤膜HRP失活或濃度不適當嚴謹洗膜不夠探針太少探針變性

35、不完全靶DNA/RNA降解靶DNA/RNA濃度太低靶DNA/RNA變性不完全靶DNA/RNA固定不恰當探針丟失在塑料品上膜干了漂洗液沒有稀釋 檢查延長曝光時間用EtBr染色確證轉膜用底物檢測探針活性0.1X或增加溫度增加探針濃度10010分鐘，驟冷5分鐘檢查均一性增加靶DNA/RNA濃度，轉膜前充分變性靶DNA/RNA固定前用1X TE或水輕輕漂洗膜使用低吸收率的塑料始終保持濕潤稀釋到1倍 75問題與對策四問題原因解決方法出現非特異性條帶 探針過量洗膜嚴謹度不夠雜交溫度不正確靶DNA/RNA降解或過量EtBr或膠污染妨礙雜交 降低探針濃度0.1X或增加溫度檢查溫度降低靶DNA/RNA濃度用1X

36、 TE或者0.1 SDS寬泛洗膜 76Note 5:中文說明書完整的中文說明書提供了您所需要的一切773. LightshiftTM化學發光 EMSAPIERCE卓越的HRP/SuperSignal化學發光檢測系統與傳統凝膠阻滯實驗的完美結合0.5個工作日完成整個實驗78用 途檢測蛋白質-核酸相互作用 相互作用部位 相互作用強弱鑒定調控序列79將純化的蛋白和細胞粗提液和32P同位素標記的DNA或RNA探針一同保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復合物和非結合的探針。DNA-復合物或RNA-復合物比非結合的探針移動得慢。同位素標記的探針依研究的結合蛋白的不同，可是雙鏈或者是單鏈。Traditi

37、onal EMSA80化學發光EMSA原理靶DNA探針上末端標記生物素探針末端的生物素與HRP上標記的親和素結合化學發光底物與HRP反應DNA-復合物或RNA-復合物比非結合的探針移動得慢，在X光片呈現位置滯后，檢測出DNA或RNA蛋白質是否有相互作用 81LightshiftTM化學發光EMSA 特點 安全：化學發光檢測靈敏：亞飛克級，等同于同位素靈敏度穩定：生物素標記的探針可保存一年生物素末端標記，不影響相互作用快速： 從標記探針到EMSA結果分析只需一天的時間82操作流程核蛋白提取物與生物素標記的靶DNA或RNA孵育形成復合物電泳和轉膜化學發光檢測NE-PER核蛋白提取物target D

38、NASuperSignal+gel/transferBBBBdetection83操作時間84Lightshift EMSA Kit與傳統的地高辛，P32標記在靈敏性，曝光時間和信噪比的結果比較等同于同位素的靈敏度,同樣曝光時間,是地高辛靈敏度的8倍85極高的信噪比和極短的曝光時間86完整Kit:100個反應800cm2的膜87抽提液的制備（核酸酶和磷酸酶污染會使探針降解）結合蛋白的濃度探針的濃度非特異性探針的濃度緩沖液的配方和pH聚丙烯凝膠電泳的特點和電泳條件保溫時間和溫度是否有輔助因子（比如鋅，或鎘等金屬離子，或激素）反應總體積應最小（20ul） 成功進行凝膠遷移實驗，需要優化哪些因素？8

39、8待檢測蛋白，可用純化蛋白，部分純化蛋白，或核細胞或胞質（RNA)抽提液。純化蛋白的量在20-2000ng間，可將蛋白：DNA的等摩爾比調整為蛋白的摩爾數是DNA的5倍。用粗制核抽提液，需要1-20ug蛋白以形成特異的復合物。用pierce78833，需要23ul。加入反應的探針的量是50fmole競爭實驗中所用競爭DNA用量為4Pmole（200倍）反應體積為20ul。探針應保存在-20C以防止降解，可長期保存蛋白質或抽提物以及標記DNA探針用量89 由肌苷和胞嘧啶組成。由于其特定的結構，可抑制蛋白對標記探針的非特異結合，避免假復合物。 在凝膠遷移反應中加入poly(dI:dC)，可抑制粗制

40、核抽提液中其它DNA結合蛋白結合，比如轉錄調節因子的非特異結合。 當用純化的蛋白作凝膠遷移反應時，不必一定加入poly(dI:dC)，如加入，則普通反應中所用終濃度不超過50-100ng。對核抽提液，每2-3ug核抽提液用1 ug poly(dI:dC)。poly(dI:dC)90非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離。濃度一般為6%，在特定條件下可用高或低的濃度。PH, 聚丙烯酰胺的濃度。目前還可用高強度瓊脂糖凝膠分離蛋白/探針復合物大多數蛋白用10-15伏的電壓，解離快的蛋白用短時間和高的電壓（30-35伏的電壓），電泳時所用的TBE和TAE必需是新配制的，無沉淀。低的離子強度和丙烯酰胺基質的箱子

41、效果有助于復合物的穩定。也可將TGE緩沖液（12.5mMTris,pH8.3, 95mM甘氨酸，0.5mMEDTA）用于不穩定的蛋白/DNA復合物。可在4oC進行結合和電泳實驗以阻止不穩定復合物和探針的解離。加樣樣品液中的色素會導致不穩定復合物的解離，應用不含考馬斯蘭和二甲苯藍的加樣樣品液。蛋白質/探針復合物和游離的探針分開91部分純化的蛋白或粗制核抽提液和一個特定的探針可形成一個或幾個特異的蛋白復合物。多個復合物的存在表明蛋白降解，應在制備抽提液的溶液中和結合反應中加入蛋白酶抑制劑。確定復合物中蛋白的特征可能會困難，但有一些方法作這方面的研究。如有目的蛋白的抗體，可進行超遷移實驗。抗體可加入

42、到蛋白和探針反應后，也可將抽提物與抗體結合后，再加入探針。取決于抗體的特定的抗原決定簇，前者有利于超遷移復合物地形成，后者阻止復合物的形成導致原復合物的強度的減少。在大多數實驗中，應對抗體作滴定，先使抗體：蛋白的摩爾比為1：1，然后應需要增加抗體的量。除超遷移實驗外，復合物中蛋白的特征也可用UV交聯和標記轉移來分析如何在一個特定的復合物中確定一個蛋白質的存在？92其它注意事項凝膠必需完全聚合，當帶型不緊密出現拖尾時，表明復合物存在解離。以避免帶型拖尾。上樣：如復合物不進入凝膠則表明所用的蛋白或探針過量，或鹽的濃度過量不適用于這一反應。探針降解：在含抽提液的帶中不含游離探針或復合物，但在只含探針

43、的帶中有探針表明抽提物有核酸或磷酸酶污染，應在抽提液中和結合反應中加入相應的抑制劑。設對照紫外交聯93Troubleshooting9495三. IP和Co-IP在抗原沉淀和蛋白互作研究中的應用In-vitro Tools for Discovery and Confirmation96蛋白質相互作用是細胞活動過程中發生的最重要和最廣泛的事件 轉錄/翻譯/翻譯后修飾分子轉運蛋白質折疊細胞周期調控信號轉導等.97蛋白質相互作用的研究方法Co-Immunoprecipitation (Co-IP)Pull-Down AssaysFar-Western AnalysisCross-Linking A

44、gentsTwo-hybrid systemProtein MicroarraysSurface Plasmon ResonanceNMR X-ray CrystallographyIn-vitro Methods98免疫沉淀技術ProFound免疫共沉淀技術ProFound Pull-Down技術Far-Western 蛋白質相互作用檢測技術991. 免疫沉淀免疫沉淀技術是利用固相化的protein A或者Protein G與抗體的結合，從而將能與抗體特異性結合的抗原蛋白質沉淀或分離純化的一項常規方法Seize Classic免疫沉淀Kit：抗體與Protein A或G沒有共價耦聯 Seiz

45、e X免疫沉淀Kit：抗體和Protein A或G共價耦聯Seize Primary免疫沉淀Kit：沒有Protein A或G而是將抗體直接和凝膠共價耦聯100Seize Classic免疫沉淀Kit利用固相化的protein A或者Protein G與抗體的結合，從而將能與抗體特異性結合的抗原蛋白質沉淀或分離純化特點：重現性好離心管設計，取樣方便固定化Protein A，G，方便選擇1小時內完成IPYTProtein AY+TiYTbCDefGhjGbDCfjProtein A101Seize X和Seize Primary免疫沉淀Kit免疫沉淀KitSeize X原理：利用交聯劑DSS將抗

46、體共價耦聯到瓊脂糖固相化的ProteinA或G上，來進行免疫沉淀。Seize Primary原理：直接將抗體共價耦聯到氨基活化的凝膠上，來進行免疫沉淀，可以共價偶聯任何種類的抗體（包括雞IgY 102特點洗脫次數少而快更多抗原可被洗脫下來樹脂可重復使用可以共價偶聯任何種類的抗體（包括雞IgY）在SDS中可消除抗體的重鏈及輕鏈條帶的干擾可用于小規模純化，比其他免疫沉淀法得到更多的目標蛋白質可至少偶聯20種抗體，每次偶聯的抗體可進行多達10次免疫沉淀反應 103操作流程：104AminoLink Plus產品對人和鳥類抗體的偶聯效率試驗 室溫下用200l AminoLink Plus固定膠偶聯來自

47、不同物種的200g純化抗體，時間14小時。雞抗體用量為500g，4個小時內抗體的偶聯效率達到了80-88% 105利用SeizePrimary免疫沉淀法純化GFP蛋白試驗 室溫下，經親和層析純化的羊抗GFP抗體（1mg/ml,200ul）與活化的200ul載體作用4小時，即可完成共價偶聯，效率達87%。用此偶聯載體沉淀經B-PER細菌蛋白抽提試劑處理而得到的75ul過量表達的BL21GFP蛋白細胞裂解液。在4-20%PAGE膠上分別上樣：10%體積比的細胞裂解產物（lysate）、5%體積比的沖洗成分1、2、3（wash 1、2、3）、和10%體積比的洗脫成分1、2、3（Elution 1、E

48、lution 2、Elution 3） 1062. ProFound免疫共沉淀試劑盒Pierce最新推出- 不同于傳統Co-IP的,無抗體干擾的免疫共沉淀技術107傳統 Co-IP相互作用蛋白被抗體沉淀下來操作流程YTiProtein AY+T +iiYTbCDefGhjGbDCfjProtein A108傳統Co-IP的缺點取上清難共洗脫產生非特異行條帶抗體被破壞洗脫不完全Heavy ChainAntigenLight Chain109摒棄了蛋白質A或G, 將特異性抗體直接偶聯于AminoLink加強型活化的瓊脂糖載體上，通過抗體和相互作用蛋白質復合物特異性結合，發現和檢測蛋白質相互作用Pr

49、oFound免疫共沉淀試劑盒的特點原理圖： 110ProFound免疫共沉淀試劑盒特點The SPIN Cup可共價偶聯任何種類的抗體（雞IgY, 人Ig，鼠IgG1 , IgM） 85%的偶聯效率不破壞抗體,樹脂可重復使用,每次偶聯的抗體可進行多達10次免疫沉淀反應,節約了寶貴的抗體自帶CoIP結合緩沖液以及用來建立對照CoIP的對照膠生理條件Co-IP結合緩沖液,更容易形成相互作用蛋白質復合物離心柱可以高效沖洗，抗體不被洗脫,可消除抗體的重鏈及輕鏈條帶的干擾離心柱設計,可高效洗脫小體積樣品,克服了取上清難的問題更多抗原可被洗脫下來2mL膠,可作40-80個Co-IP反應111操作流程112

50、操作流程Continued.Step 5: Analyze Protein113Co-IP of p53 and MDM2Labeled Proteins MDM2 p53 LucMDM2 MDM2 p53 LucCoIPMDM2Luciferasep53MDM2, p53, and luciferase were translated and 35S-labeled in reticulocyte lysate. Co-IPs were performed using a monoclonal antibody against MDM2. Precipitated proteins were

51、 eluted with ImmunoPure Elution Buffer, run on a 4-20% gel and visualized by autoradiography.114產品信息： 目錄號產品名稱包裝23600ProFound 免疫共沉淀試劑盒Kit23605ProFound 哺乳動物免疫共沉淀試劑盒Kit28314Sulfact-Amps X-100（活性成分是Triton X-100）610ml21027ImmunoPure 溫和條件Ag/Ab洗脫緩沖液500ml1153. ProFound Pull-Down 蛋白質相互作用分析Three powerful new

52、tools for interaction discovery or confirmation116ProFound Pull-Down 蛋白質相互作用檢測 用固相化的、已生物素標記的餌蛋白或PolyHis-或GST-標簽蛋白，從細胞裂解液中或體外轉錄翻譯體系中釣出與之有相互作用的蛋白質酵母雙雜交后，驗證已知的“誘餌”蛋白與釣出蛋白或已純化的相關蛋白間的相互作用關系結合容量大:8 mg GST/ml 10-25 mg 6xHis-tagged protein/ml 9 mg/ml biotinylated BSA/ml117影響Pull-Downs的因素融合蛋白純度是否修飾是否天然狀態濃度Co

53、-factors etc. 1181.GST和PolyHis標記的Pull-Down操作流程119PolyHis-GST Pull-Down實驗結果Note: Gels were stained with the Pierce GelCode SilverSNAP Stain Kit (Product # 24602).BaitPreyLane # PolyHis-Tag Pull-Down1Lysate from E. coli expressing 9xHis-tagged wild-typeSmac (bait protein ). 2Flow-through from the lysa

54、te in Lane 1 bound to animmobilized cobalt metal chelate support for 1 hour at 4C. 3 Wash #1 of the support.4 Wash #2 of the support. (Washes 3-5 not shown.)5Lysate from E. coli expressing GST-tagged BIR2(prey protein). 6Flow-through from the lysate in Lane 5 is allowed tointeract with the immobilized bait for 1 hour at 4C. 7 Wash #1 of the support.8 Wash #2 of the support. (Washes 3-5 not shown.)9Bait control. Bait treated as described in Lanes 1-8 andsubsequently eluted. No prey added just bindingbuffer. 10Prey control. Prey treated as described in Lanes 1-8