1、生物化學(xué)方式及其在中醫(yī)研究中科學(xué)應(yīng)用引言局部比較全面完整地介紹了生化的開展歷程，及其燦爛的里程碑。仔細(xì)閱讀，有利于我們更好地理解這門學(xué)科，及其技術(shù)。生物化學(xué)是運(yùn)用化學(xué)理論和技術(shù)來研究組成生物體的根本成分及其在生物體內(nèi)所進(jìn)行的化學(xué)變化規(guī)律的一門學(xué)科，從而揭示生命現(xiàn)象的化學(xué)本質(zhì)。生物化學(xué)的開展可以分為靜態(tài)生化、動態(tài)生化和功能生化三個(gè)階段，這三個(gè)階段并不是截然分開的，它反映了人們對生命活動認(rèn)識的深入過程。靜態(tài)生化，主要指以別離、制備、純化和檢測某物質(zhì)。動態(tài)生化，主要指活體內(nèi)的化學(xué)反響，及其動態(tài)平衡。功能生化，主要指研究某化學(xué)物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系P169。從發(fā)揚(yáng)中醫(yī)學(xué)角度來說，掌握生物化學(xué)理論和技

2、術(shù)，不僅能更深刻理解人體的生長、發(fā)育、壯盛、衰老等問題，而且從蛋白質(zhì)、核酸的分子結(jié)構(gòu)變化來探討疾病的診斷、治療和預(yù)防，無疑會起到如虎添翼的作用。一、生物化學(xué)的主要方法生物化學(xué)技術(shù)是研究生物內(nèi)物質(zhì)的化學(xué)組成、結(jié)構(gòu)、功能以及在生命過程中化學(xué)物質(zhì)代謝變化規(guī)律，調(diào)節(jié)控制等的實(shí)驗(yàn)方法。常用的生物化學(xué)技術(shù)主要有物質(zhì)的別離、提純法，離心法，層析法，電泳法，光譜法以及分子雜交技術(shù)等。一生物大分子物質(zhì)的別離和提純生物大分子主要指蛋白質(zhì)、核酸、糖類和脂類等物質(zhì)。制備高度純化的生物大分子是研究大分子結(jié)構(gòu)與功能的前提，整個(gè)別離提純過程可分為以下幾個(gè)階段：1材料選擇。2細(xì)胞破碎。3亞細(xì)胞器的別離。4提取。5別離純化。6

3、濃縮、枯燥及保存。1材料選擇。原那么：選取所需成分含量較高、來源豐富、工藝簡單、本錢低廉的目的材料或組織。這是指別離、純化、制備某種物質(zhì)而言的，具體中醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)有具體要求 2細(xì)胞破碎。常用的技術(shù)有：勻漿器研磨、高速組織搗碎器、反復(fù)凍融、超聲波破碎、自溶、酶消化、外表活性劑處理法等。不同型號的超聲波破碎儀3亞細(xì)胞器的別離。一般采用不同密度梯度介質(zhì)，經(jīng)差速離心法制備。4提取。提取過程，首先要使生物大分子與其他物質(zhì)別離開來，使大分子物質(zhì)充分釋放出來，在此過程中，特別要考慮溶劑性質(zhì)、pH值、離子強(qiáng)度、介電常數(shù)、抽提溫度等多種影響溶解度的因素，然后可結(jié)合經(jīng)驗(yàn)并根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)條件靈活地選取某一試劑進(jìn)行提取。5

4、別離純化。剛提取得到的大分子物質(zhì)，往往是粗制品，含有許多雜質(zhì)，必須進(jìn)一步別離純化。別離提純各種生物大分子，主要根據(jù)各種物質(zhì)的分子大小、溶解度、帶電性、親和力大小等差異，選用有機(jī)溶劑沉淀、等電點(diǎn)沉淀、鹽析、層析、電泳、超離心、吸附、結(jié)晶等方法。以下會詳細(xì)介紹。左圖 真空冷凝枯燥儀右圖 超低溫冰箱6濃縮、枯燥及保存。二離心技術(shù)離心技術(shù)是利用物體高速旋轉(zhuǎn)時(shí)產(chǎn)生強(qiáng)大的離心力，使置于旋轉(zhuǎn)體中的懸浮顆粒指懸浮狀態(tài)的細(xì)胞、細(xì)胞器、病毒和生物大分子等發(fā)生沉降或漂浮，從而使某些顆粒到達(dá)濃縮或與其他顆粒別離之目的。離心機(jī)轉(zhuǎn)子高速旋轉(zhuǎn)時(shí)，當(dāng)懸浮顆粒密度大于周圍介質(zhì)密度時(shí)，顆粒離開軸心方向移動，發(fā)生沉降；如果顆粒密度

5、低于周圍介質(zhì)的密度時(shí)，那么顆粒朝向軸心方向移動而發(fā)生漂浮。常用的離心機(jī)分類：“低速離心機(jī)最高轉(zhuǎn)速不超過6000rpm.“高速離心機(jī)在25000rpm以下.“超速離心機(jī)達(dá)30000rpm以上。冷凍離心機(jī)構(gòu)造圖左上：普通臺式離心機(jī)。 左下：冷凍臺式離心機(jī)。右：超速離心機(jī)。左圖：不同離心機(jī)的不同轉(zhuǎn)頭右圖：超速離心機(jī)的不同轉(zhuǎn)頭離心方法主要有三大類型：差速離心、密度梯度離心、沉降平衡離心。1差速離心法。通過逐步增加相對離心力，使一個(gè)非均相混合液內(nèi)形狀不同的大小顆粒分步沉淀。2密度梯度離心法。離心前，離心管內(nèi)先裝入別離介質(zhì)如蔗糖、甘油等，使形成連續(xù)的或不連續(xù)的密度梯度介質(zhì)，然后參加樣品進(jìn)行離心，具體又可分

6、為：1速度區(qū)帶離心法。離心前，離心管內(nèi)先裝入蔗糖、甘油、CsCl、Percoll等密度梯度介質(zhì)，待別離樣品鋪在梯度液的頂部，離心管底部或梯度層中間，同梯度液一起離心，利用各顆粒在梯度液中沉降速度或漂浮速度的不同，使具有不同沉降速度的顆粒處于不同密度的梯度層內(nèi)，到達(dá)彼此別離的目的。本法可別離各種細(xì)胞、病毒、染色體、脂蛋白、DNA和RNA等生物樣品。2預(yù)制梯度等密度離心法。要求在離心前預(yù)先配制管底濃而管頂稀的密度梯度介質(zhì)，常用介質(zhì)有蔗糖、CsCl、Cs2SO4等，待別離樣品一般鋪在梯度液頂上，如需挾在梯度液中間或管底部，那么需調(diào)節(jié)樣品液密度。離心后，不同密度的樣品顆粒到達(dá)與自身密度相等的梯度層，即

7、到達(dá)等密度的位置而獲得別離。3自成梯度等密度離心法。某些密度介質(zhì)經(jīng)過離心后會自成梯度，例Percoll，可迅速形成梯度，CsCl、Cs2SO4和三碘甲酰葡萄糖胺經(jīng)長時(shí)間離心后也可產(chǎn)生穩(wěn)定的梯度。需要離心別離的樣品可和梯度介質(zhì)先均勻混合，離心開始后，梯度介質(zhì)由于離心力的作用逐漸形成管底濃而管頂稀的密度梯度，與此同時(shí)，可以帶動原來混合的樣品顆粒也發(fā)生重新分布，到達(dá)與其自身密度相等的梯度層里，即到達(dá)等密度的位置而獲得別離。 3沉降平衡離心法。根據(jù)被別離物質(zhì)的浮力密度差異進(jìn)行別離，所用的介質(zhì)起始密度約等于被別離物質(zhì)的密度，介質(zhì)在離心過程中形成密度梯度，被別離物質(zhì)沉降或上浮到達(dá)與之密度相等的介質(zhì)區(qū)域中停

8、留并形成區(qū)帶。三層析技術(shù)層析法又稱色譜法，是目前廣泛應(yīng)用的一類別離分析技術(shù)。層析法利用混合物各組分理化性質(zhì)上的差異，例如吸附力、溶解度、分配系數(shù)、帶電性、分子大小、親和力等，使各組分以不同程度分布在二個(gè)相中，其中一個(gè)為固定相，另一個(gè)為流動相，當(dāng)混合物隨流動相通過固定相時(shí)，由于各組分受固定相的阻力和流動相的推力不同，而使各組分移動速度各異，以到達(dá)別離的目的。1根據(jù)別離的原理劃分1吸附層析。是利用混合物隨流動相通過由吸附劑組成的固定相時(shí)，因吸附劑對各組分的吸附能力的不同，而使各組分流動速度不同，將各組分別離。吸附層析根據(jù)支持物裝填方式的不同有柱層析和薄層層析類，前者常用于別離非極性或極性較小的有機(jī)

9、物，后者用于別離氨基酸、類固醇激素等。2分配層析。利用混合物隨流動相非極性溶劑通過含極性溶劑的載體組成的固定相時(shí)，由于各組分在二相中的分配系數(shù)的不同，而使混合物各組分在兩相間發(fā)生不同的分配現(xiàn)象而逐漸分開。分配層析應(yīng)用最廣泛的是紙層析。3離子交換層析。離子交換層析是利用離子交換劑作為固定相，離子交換劑是一類具有酸性或堿性基團(tuán)，能與溶液中的陽離子或陰離子發(fā)生交換的不溶性物質(zhì)，流動相通常是具有一定pH值和一定離子強(qiáng)度的電解質(zhì)溶液。將混合溶液參加離子交換柱，由于離子交換劑對混合液中各種離子具有不同的親和力而產(chǎn)生不同的吸附作用，當(dāng)流動相流經(jīng)離子交換柱時(shí)，可以降低離子交換劑對吸附離子的親和力而被交換洗脫下

10、來，從而到達(dá)別離的目的。4凝膠層析。以多孔性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠或瓊脂糖凝膠等為固定相裝柱，將分子量大小不同的混合組分參加柱，用一種洗脫液作為流動相進(jìn)行洗脫。小分子物質(zhì)易進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部使流程延長，大分子物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)而被排阻在外，流程較短，經(jīng)過一定洗脫時(shí)間后，可將混合物按分子大小不同別離開來。 5親和層析。親和層析是根據(jù)生物大分子與其配基之間具有高度專一性的親和力而設(shè)計(jì)的一種層析技術(shù)。具有專一親和力的生物分子對主要有：酶與底物包括輔酶與輔基、激素與受體、抗原與抗體、DNA與RNA、凝集素與糖蛋白等，由于結(jié)合雙方是互配的，因此分子對任何一方均可作為配基，通過化學(xué)法連

11、接到載體上作為固定相裝柱，將欲別離的混合物分子對另一方參加柱，由于分子對雙方有高度親和力而被吸附結(jié)合在柱上，其它雜質(zhì)首先隨流動相被洗脫下來，然后改變流動相成分，將吸附結(jié)合在柱上的親合分子洗脫下來。2根據(jù)兩相物理狀態(tài)劃分1液相層析。流動相為液體的層析，如上述各種層析。低壓液相層析儀高效液相儀2氣相層析。流動相為氣體的層析。固定相有固體或液體，故又分作氣固層析或氣液層析。3根據(jù)支持物的裝填方式劃分柱層析將支持物裝在管子中成柱形，在柱中進(jìn)行層析，薄層層析支持物鋪在玻璃板上成一薄層，在薄層上進(jìn)行層析，紙層析用紙做支持物的層析。四電泳技術(shù)原理：帶電顆粒在電埸作用下，向著其電性相反方向移動的現(xiàn)象稱為電泳。

12、由于被別離物質(zhì)各自的帶電性、帶電量、分子顆粒大小和形狀等的不同，在同一電埸下它們的移動速度各異，經(jīng)過一定時(shí)間電泳后可被別離開來。影響電泳的因素：在電泳過程中，帶電顆粒的遷移率在一定條件下與其所帶電量、顆粒半徑和溶液的粘度相關(guān)。此外還有以下因素可以影響物質(zhì)的電泳遷移率：電場強(qiáng)度、溶液的pH值、溶液的離子強(qiáng)度、電滲作用等。 不同型號的毛細(xì)管電泳儀及其工作原理 電泳的分類：顯微電泳毛細(xì)管電泳、自由界面電泳和區(qū)帶電泳三大類。以上區(qū)帶電泳應(yīng)用較為廣泛，其特點(diǎn)是在電埸作用下，被別離的各組分在支持物上相互別離為不同的區(qū)帶。分類如下：1按支持物的物理性狀不同可分為：1濾紙及其他纖維紙電泳，2粉末電泳，3凝膠電

13、泳、4緣線電泳。2按支持物的裝置形式不同可分為：1平板式電泳，2垂直板式電泳，3垂直柱式電泳，4連續(xù)液動電泳。3按pH的連續(xù)性不同可分為：1連續(xù)pH電泳，2非連續(xù)pH電泳。左上：電泳結(jié)果左下：垂直電泳架右：雙向電泳結(jié)果凝膠成像系統(tǒng)五光譜技術(shù)光譜技術(shù)是利用各種化學(xué)物質(zhì)所具有的發(fā)射、吸收或散射輔射能的特性，對物質(zhì)進(jìn)行定性或定量的一類分析技術(shù)。它具有靈敏度高，測定簡便、快速，試樣不被破壞等優(yōu)點(diǎn)，是一類最常用的生化測定技術(shù)。1比色分析法。比色法是利用有色物質(zhì)對一定波長的光的吸收特性來進(jìn)行定量的一種分析方法。在一定濃度范圍內(nèi)，溶液中有色物質(zhì)的濃度與溶液顏色的深度成正比，用可見光400-760nm作光源，

14、比較溶液的顏色深淺度以測定所含有色物質(zhì)濃度的方法，叫做比色法。常用的有：1標(biāo)準(zhǔn)對照法。將樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液在相同條件下分別測定它們的吸光度，計(jì)算出試樣溶液的濃度。2標(biāo)準(zhǔn)曲線法。配制一系列濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按一定操作方法顯色，在選定波長條件下分別測定它們的吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，作一條標(biāo)準(zhǔn)曲線或工作曲線。以后只需在相同條件下實(shí)驗(yàn)，測定未知樣品溶液的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得相對應(yīng)的濃度值，即為未知樣品液的濃度，一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，如測定條件不變，可供屢次使用，否那么應(yīng)重新繪制。 2分光光度法。分光光度是根據(jù)被測物質(zhì)對各種波長光的吸收能力吸光度或光密度，繪制吸收光譜曲線，不同

15、的物質(zhì)，分子結(jié)構(gòu)不同，其吸收曲線各有特殊形式，根據(jù)曲線的特征，用于物質(zhì)的定性定量。分光光度法波長范圍較大200-1000nm，因此，既可用于可見光，也可用于紫外光和紅外光的分光測定，故測定物質(zhì)既可是有色物，也可是無色物，擴(kuò)大了應(yīng)用范圍。由于分光光法采用單色光器棱鏡，得到單色光，其波長范圍比濾光片波長更狹窄，提高了分析的靈敏度、準(zhǔn)確度和選擇性。所用的儀器721分光光度計(jì)、752紫外分光光度計(jì)等。比色試驗(yàn)和不同的可見光和紫外分析儀 3熒光光度法。某些物質(zhì)經(jīng)紫外光照射能發(fā)出比原激發(fā)光的頻率低，波長長的可見光，這種光稱為熒光。各種物質(zhì)經(jīng)紫外光激發(fā)后能發(fā)出的熒光特性與物質(zhì)的化學(xué)性有關(guān)。在激發(fā)光強(qiáng)度和所通

16、過的溶液厚度不變時(shí)，在一定濃度范圍內(nèi)該物質(zhì)所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與其濃度成正比。因此，可以用濃度的標(biāo)準(zhǔn)與待測樣品同樣操作，通過測定熒光強(qiáng)度F，按前述的標(biāo)準(zhǔn)曲線法和標(biāo)準(zhǔn)對照法，求得待測物質(zhì)的濃度。所用的儀器如國產(chǎn)930型、910型等熒光光度計(jì)。4比濁法。比濁法是利用混懸溶液中顆粒對光線產(chǎn)生散射特性進(jìn)行測定。其測定的理論、方法和計(jì)算等類似于比色分析法，因此根本上任何一種光電比色計(jì)或分光光度計(jì)都能用于比濁測定。以上這些技術(shù)，被稱為生化的四大技術(shù)，很傳統(tǒng)的。大體可以滿足靜態(tài)生化、動態(tài)生化的檢測，而機(jī)能生化那么首先有賴于對化學(xué)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)認(rèn)識，這樣的研究目前十分熱門，自然雜志專門有關(guān)于蛋白質(zhì)三級機(jī)構(gòu)圖的專刊，目

17、前積累迅速。而研究那么是一條長鏈，有許多環(huán)節(jié)構(gòu)成，投入本錢高。全自動生化檢測儀六分子雜交技術(shù)詳見有關(guān)章節(jié)二、用生物化學(xué)方法研究中醫(yī)的現(xiàn)狀該章節(jié)引用了大量的國內(nèi)研究進(jìn)展資料，值得仔細(xì)閱讀。一物質(zhì)代謝介紹了：陰虛、陽虛、心氣虛、肝氣虛、脾虛、肺虛、腎虛、體質(zhì)學(xué)說與物質(zhì)代謝其中：毛良、顧文聰我校教師1陰虛、陽虛與物質(zhì)代謝毛良是我校的生化專業(yè)的老教師。2心氣虛與物質(zhì)代謝心氣虛證患者紅細(xì)胞SOD活性明顯下降、血清LPO含量顯著升高，推測由于紅細(xì)胞SOD活性下降不能保護(hù)心肌免受超氧自由基的攻擊，以致產(chǎn)生心氣虛的臨床病癥。心氣虛患者血漿核酸總量及DNA、RNA含量均低于正常對照組，提示心氣虛患者蛋白質(zhì)合成功

18、能有一定的障礙。3肝氣虛證與物質(zhì)代謝4脾虛與物質(zhì)代謝脾虛患者：檸檬酸刺激后唾液淀粉酶活性下降。血清胃泌素和胰淀粉酶活性低下，胃腸蠕動紊亂，小腸吸收功能低下。說明脾虛患者的胃腸功能確有紊亂。木糖排泄率較正常人顯著降低，而且食少、腹脹滿、大便不調(diào)、神疲氣短等脾虛四大主癥與木糖排泄率下降有一致性的規(guī)律。血清淀粉酶及其同功酶和胰脂肪酶均顯著下降，且食欲減退、食后腹脹與大便溏泄等脾氣虛的三個(gè)主癥與之呈正相關(guān)，說明胰腺外分泌功能的降低可視為脾氣虛證的特異性診斷指標(biāo)之一，且淀粉酶總活性的降低取決于胰淀粉酶同功酶的下降，而與唾液淀粉酶無關(guān)，為脾氣虛證診斷提供了一個(gè)更準(zhǔn)確有效的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)。5肺虛與物質(zhì)代謝6腎虛與

19、物質(zhì)代謝7體質(zhì)學(xué)說與物質(zhì)代謝二能量代謝介紹了：心氣虛、肝血虛、脾虛證、體質(zhì)學(xué)說與能量代謝其中匡調(diào)元為我校教師1心氣虛證與能量代謝2肝血虛證與能量代謝3脾虛證與能量代謝脾氣虛患者肌纖維的肌酸磷酸激酶CPK、琥珀酸脫氫酶、輔酶1-四氮唑復(fù)原酶NADH-TR活性、肌球蛋白腺苷三磷酸酶M-ATPase活性，以及肌糖原含量均減少，線粒體發(fā)生改變，骨骼肌有氧氧化效率降低，糖酵解供能途徑障礙，能量代謝受阻；實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)CPK和肌型肌酸磷酸激酶CPK-MM活性的降低與脾氣虛的輕重程度有量的相關(guān)性。脾氣虛大鼠骨骼肌細(xì)胞ATP含量和能荷值顯著減小，與無氧酵解相關(guān)的乳酸脫氫酶LDH以及有氧氧化相關(guān)的琥珀酸脫氫酶SDH

20、活性顯著升高，提示能量代謝異常，與之相關(guān)的微量元素鋅和鐵含量也相應(yīng)升高，而與肌肉收縮有關(guān)的元素銅、砷、鈉減少而鈣增多。紅細(xì)胞膜Na+-K+-ATPase活性也顯著低于正常組。4體質(zhì)學(xué)說與能量代謝三神經(jīng)內(nèi)分泌介紹了：陰虛、陽虛、心氣虛、肝、脾虛、肺虛、腎虛、與神經(jīng)內(nèi)分泌其中趙偉康、金國琴、為我校教師，沈自尹、王文健華山醫(yī)院藏象研究室，在腎虛證研究方面全國領(lǐng)先 1陰虛陽虛與神經(jīng)內(nèi)分泌2心氣虛與神經(jīng)內(nèi)分泌3肝與神經(jīng)內(nèi)分泌4脾虛證與神經(jīng)內(nèi)分泌5肺虛證與神經(jīng)內(nèi)分泌6腎虛證與神經(jīng)內(nèi)分泌沈自尹等從1959年，在“腎本質(zhì)的研究中，得到腎陽虛證具有下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸功能紊亂的結(jié)論，這一結(jié)論經(jīng)歷了全國七個(gè)

21、省市和日本京都病院的重復(fù)驗(yàn)證。他們從1979年起，通過選擇符合典型腎陽虛證患者與正常組、同病無特殊見證組下丘腦-垂體及其所屬三個(gè)靶腺軸功能的全套測定的比照研究，結(jié)果顯示腎陽虛證不僅表現(xiàn)為腎上腺皮質(zhì)軸功能紊亂，而且在不同的靶腺軸、不同環(huán)節(jié)、不同程度上呈現(xiàn)隱潛性變化。采用了溫補(bǔ)腎陽法治療后，靶腺功能明顯恢復(fù)。由于累及三個(gè)靶腺軸，由此可以推論腎陽虛證主要發(fā)病環(huán)節(jié)是下丘腦或更高中樞的調(diào)節(jié)紊亂。1下丘腦-垂體-性腺軸與腎虛2下丘腦-垂體-腎上腺軸與腎虛沈自尹等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，35例腎陽虛證患者尿17羥均值治療后顯著高于治療前，24例腎陽虛證患者ACTH滴注試驗(yàn)呈延遲反響，治療后復(fù)查其值均恢復(fù)至正常；6例腎陽虛證患者血漿ACTH濃度治療后顯著高于治療前；7例腎陽虛者血皮質(zhì)醇晝夜節(jié)律呈異常曲線者，有4例治療后得以恢復(fù)。趙偉康等經(jīng)動物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎益精方藥固真方能明顯提高老年大鼠腎虛衰老海馬細(xì)胞降低的糖皮質(zhì)激素受體GCR數(shù)，提高低丘腦降低的NE、DA和5-HT含量，降低老年大鼠異常升高的血漿皮質(zhì)酮，使之趨于正常青年對照組。3下丘腦-垂體-甲狀腺軸與腎虛沈自尹等觀察了8例腎陽虛者血清總T3含量，與治療前相比較，發(fā)現(xiàn)治療后血清總T3含量顯著增高，4例腎陽虛者TRH興奮試驗(yàn)呈延遲反響，經(jīng)治療后有2例得以恢復(fù)。李曉玲等觀察了27例腎虛型惡性腫瘤患者的甲狀腺功能，其腎陰虛、腎陽虛兩組的