1、病毒滴度的測定病毒滴度的測定原理原理( (重點重點) )：適當稀釋的病毒懸液與長成單適當稀釋的病毒懸液與長成單層的宿主細胞混合，在細胞上覆以營養瓊脂培層的宿主細胞混合，在細胞上覆以營養瓊脂培養基等固體或半固體介質，由于瓊脂的限制，養基等固體或半固體介質，由于瓊脂的限制，病毒只能感染并破壞臨近的細胞，造成細胞溶病毒只能感染并破壞臨近的細胞，造成細胞溶解而形成空斑，每個空斑由一個病毒顆粒造成，解而形成空斑，每個空斑由一個病毒顆粒造成，計算空斑數量再乘以稀釋倍數即可得知原來的計算空斑數量再乘以稀釋倍數即可得知原來的病毒感染單位的濃度。病毒感染單位的濃度。空斑形成單位空斑形成單位法測定病毒滴度法測定病

2、毒滴度 空斑形成單位空斑形成單位（Plaque Forming Units, Plaque Forming Units, PFUsPFUs) )空斑顯現原理空斑顯現原理(掌握掌握)：空斑形成空斑形成后，經中性紅后，經中性紅活細胞染色，活細胞顯示紅色，而空斑區細胞活細胞染色，活細胞顯示紅色，而空斑區細胞不著色，形成不染色區域。不著色，形成不染色區域。空斑形成單位空斑形成單位法測定病毒滴度法測定病毒滴度適用條件適用條件(熟悉熟悉)：凡是能在細胞中產生細胞病：凡是能在細胞中產生細胞病變效應變效應(CPE)的病毒都可以采用空斑形成法測的病毒都可以采用空斑形成法測定病毒滴度。定病毒滴度。空斑形成單位空斑

3、形成單位法測定病毒滴度法測定病毒滴度中性紅中性紅(掌握)(熟悉)(了解)(了解)空斑形成單位試驗技術舉例空斑形成單位試驗技術舉例 p51-52防止瓊脂凝固；防止瓊脂凝固；Hanks液？液？雙抗？雙抗？5% CO2空斑空斑形成單位的計算形成單位的計算 (重點重點)(掌握)(熟悉)CCID50ID50LD50(重點)(熟悉)5% CO2培養箱培養箱(熟悉)CCID50TCID50(熟悉)病毒液病毒液 CPE孔數孔數 無無CPE 累累 計計 出現出現CPE孔孔稀釋度稀釋度 孔數孔數 CPE孔數孔數 無無CPE孔數孔數 所占的所占的% 10-1 8 0 27 0 100（27/27） 10 -2 8

4、0 19 0 100（19/19） 10 -3 7 1 11 1 91.6 （11/12） 10 -4 3 5 4 6 40（4/10） 10 -5 1 7 1 13 0.7（1/14） 10 -6 0 8 0 21 0（0/21） Reed-Reed-MuenchMuench法計算法計算CCIDCCID5050CPE(陽性)孔累計數由下向上累積無CPE(陰性)孔累計數由上向下累積(難點、重點)CCID50(難點、重點) Use of Reed & Muench method (if 50 ul of virus dilution is added to each well)Karber法計算

5、法計算CCID50 病毒液稀釋度病毒液稀釋度 出現出現CPECPE孔的比率孔的比率10-1 8/8=1 10-2 8/8=110-3 7/8=0.87510-4 3/8=0.37510-5 1/8=0.125 10-6 0/8=0(難點、重點)lgCCIDlgCCID5050=L+d(s-0.5)=L+d(s-0.5)L: L: 病毒的最低稀釋倍數的對數病毒的最低稀釋倍數的對數 L=lg10L=lg10-1 -1 = -1= -1d d：稀釋系數，即組距：稀釋系數，即組距 d=lg10d=lg10-1 -1 = -1= -1S S：CPE(CPE(陽性陽性) )孔比率總和孔比率總和lgCCID

6、lgCCID5050=(-1) + (-1)=(-1) + (-1)(3.375-0.5)(3.375-0.5) =-3.875 =-3.875 CCID CCID5050=10=10-3.875-3.875/0.1ml /0.1ml IDID50 50 和和 LDLD50 50 的計算與的計算與CCIDCCID5050完全相同完全相同( (掌握掌握) )lgCCIDlgCCID5050=L+d(s-0.5)=L+d(s-0.5)uIDID50 50 計算，計算，S S：感染比率總和；：感染比率總和；uLDLD50 50 計算，計算，S S：死亡比率總和；：死亡比率總和；(掌握掌握)血凝試驗的基本原理血凝試驗的基本原理(掌握掌握)紅細胞凝集現象紅細胞凝集現象( (血凝現象血凝現象) )紅細胞凝集抑制紅細胞凝集抑制 (紅細胞與抗體結合，失去血凝)血凝滴度血凝滴度/ /血凝單位血凝單位血凝試驗測定病毒滴度血凝試驗測定病毒滴度干擾滴定測定病毒滴度干擾滴定測定病毒滴度小結小結主要介紹空斑形成單位法、主要介紹空斑形成單位法、50%終點法、血凝試終點法、血凝試驗和干擾滴定法測定病毒滴度的原理及其方法；驗和干擾滴定法測定病毒滴度的原理及其方法；重點要掌握空斑形成單位法、重點要掌握空斑形成單位法、50%終點法測定病終點法