1、液相色譜基礎(chǔ)液相色譜基礎(chǔ)本章內(nèi)容：本章內(nèi)容： 液相色譜發(fā)展史液相色譜發(fā)展史 液相色譜的基本概念液相色譜的基本概念 影響峰形擴(kuò)展的因素影響峰形擴(kuò)展的因素歷史回顧歷史回顧1906 - Mikhail Semenovich Tswett (1872-1919)碳酸鈣吸附劑石油醚1940s - 分配色譜和紙色譜1950s - 氣相, 薄層，凝膠過濾色譜 梯度洗脫色譜1960s - 商業(yè)高效液相色譜.0NNNNMgCHCH23CH3CH3H C30CH3CH3CH30CH300高效液相色譜 (HPLC)進(jìn)樣口檢測器色譜圖色譜柱溶劑泵混合器HPLC 結(jié)構(gòu)框圖HPLC 結(jié)構(gòu)框圖液相色譜類型液相色譜類型Typ

2、es of CompoundsSeparatedNeutralsWeak AcidsWeak BasesIonics, Bases, AcidsCompounds Insoluble inWater, Organic IsomersIonicsInorganic IonsHigh MW CompoundsPolymersModeReversed-PhaseIo子n-PairNormal-PhaseIon ExchangeSize ExclusionStationary PhaseC-18, C-8,C-18, C-8Silica, Amino, CyanoDiolAnion or Cation

3、 Exchange PolystyreneMobile PhaseWater/OrganicModifiersWater/OrganicIon-Pair ReagentOrganicsAqueous/BufferCounter IonGel Filtration-AqueousGel Permeation-OrganicSilicaResinC-4, C-2化合物類型化合物類型模式模式固定相固定相流動(dòng)相流動(dòng)相中性弱酸弱堿反相C18, C8, C4氰基, 氨基水/有機(jī)改性劑離子、堿性、酸性離對(duì)C-18, C-8水/有機(jī)的離子對(duì)試劑不溶于水的化合物正相硅膠、氨基、腈基、二醇有機(jī)物離子型無機(jī)離子離子

4、交換陰離子或陽離子交換樹脂水/緩沖溶液對(duì)離子高分子量化合物聚合物體積排阻聚苯乙烯硅膠凝膠過濾 - 水性的 凝膠滲透 - 有機(jī)的色譜參數(shù)色譜參數(shù)Detector ResponseTimeABWWABInjectt0tR(A)tR(B)t = 保留時(shí)間 t = 死時(shí)間R W = 峰底寬度0 定性和定量定性和定量tR(B) - tR(A)WA + WBR = 2tR(B) - tR(A)W1/2A + W1/2B = 1.176K=tR-t0t0不同R值的峰重疊R=1.5可以得到基線分離0.40.50.60.70.81.001.25影響影響R值的因素值的因素tW=R =1/4Nx- 1xk1 + k

5、容量因子選擇性柱效容量因子容量因子各組份的容量因子（K）隨溶劑洗脫強(qiáng)度的變化增大或縮小增加流動(dòng)相的洗脫強(qiáng)度，降低了洗脫物的容量因子對(duì)于反相色譜，增加10的有機(jī)組成等于降低每個(gè)色譜峰的K值的1/2 到2/3。溶劑洗脫強(qiáng)度弱溶劑洗脫強(qiáng)度強(qiáng)246810110070030010060% AcetonitrileTime (min.)mAU20001600600080% AcetonitrileTime (min.)mAU100040% Water20% Water246810分離選擇性分離選擇性改用不同的流動(dòng)相改變流動(dòng)相的組成改變流動(dòng)相pH值改變柱溫應(yīng)用特殊的化學(xué)效應(yīng)改變固定相()改變分離選擇性改變分

6、離選擇性的方法的方法t 0 = 1 =kkBAAB23AB12AB12=1.641.58=1.04=1.150.85=1.35=0.950.63=1.50kkBA溫度對(duì)分離選擇性溫度對(duì)分離選擇性的影響的影響40 601005Time in Minutes柱效柱效Detector ResponseInjectTime高柱效低柱效擴(kuò)散h = A + C uBu.HETP BuC.uA線速度A = 渦流擴(kuò)散B = 自由分子擴(kuò)散C = 傳質(zhì)阻力范德姆特方程 The Van Deemter Equation+AA = 渦流擴(kuò)散多徑擴(kuò)散仔細(xì)填充柱子使用均一的載體線 速 度HETP擴(kuò)散擴(kuò)散初始帶寬最終帶寬擴(kuò)

7、散擴(kuò)散BB = 自由分子擴(kuò)散縱向擴(kuò)散在液相中影響小在低流速中影響大線速度HETP擴(kuò)散擴(kuò)散C.uC = 傳質(zhì)阻力在低流速下可以降低傳質(zhì)阻力使用小顆粒載體可以降低傳質(zhì)阻力HETP線速度滯流的流動(dòng)相流動(dòng)相固定相柱外效應(yīng)柱外效應(yīng)樣品體積 I.連接管路的體積色譜柱進(jìn)口設(shè)計(jì)色譜柱出口設(shè)計(jì)檢測池體積 ( 10 L )II.III.IV.V.降低輸出回路響應(yīng)時(shí)間VI.如何提高分離度如何提高分離度通過下述方法增加保留時(shí)間:選擇合適的分離參數(shù)增加色譜柱長度增加固定相濃度通過下述方法降低譜帶寬度:使用均一的載體仔細(xì)填充柱子選擇粒度小的載體優(yōu)化流速減小進(jìn)樣量降低系統(tǒng)死體積降低輸出回路響應(yīng)時(shí)間HPLC 儀器簡介儀器簡介

8、本章內(nèi)容：本章內(nèi)容：流動(dòng)相及貯液罐流動(dòng)相及貯液罐 高壓輸液泵及梯度洗脫裝置高壓輸液泵及梯度洗脫裝置進(jìn)樣裝置進(jìn)樣裝置色譜柱色譜柱檢測器檢測器色譜數(shù)據(jù)處理裝置色譜數(shù)據(jù)處理裝置l優(yōu)化流路減小死體積l流路自上而下堆積配置堆積配置手持控制器手持控制器檢測器檢測器 柱溫箱柱溫箱自動(dòng)進(jìn)樣器自動(dòng)進(jìn)樣器泵泵脫氣機(jī)脫氣機(jī) 溶劑柜溶劑柜HP-IB外設(shè)(x4)l每個(gè)部分有獨(dú)立的電源l1100各部件均由CAN線連接l檢測器與化學(xué)工作站之間用 LAN線連接 (或用HP-IB連接)l脫氣機(jī)與泵之間用遙控線連接 (錯(cuò)誤信號(hào)輸出)lBCD板用于外設(shè)和讀取樣品瓶數(shù)量連線連線指示燈狀態(tài)指示燈狀態(tài)Off (power off)Rea

9、dy (power on)Not ReadyRunErrorResidentBlink儀器LED狀態(tài)顯示電源開關(guān)顯示BlackBlackYellowGreenRedYellow blinking6種LED儀器狀態(tài)：Agilent 1100 泵和在線脫氣機(jī)泵和在線脫氣機(jī)Agilent 1100系列泵系列泵,G1310A, G1311A, G1312A, G1354A和和Agilent 1100 系列在線真空脫氣裝系列在線真空脫氣裝 置置(G1322A)Agilent 1100系列真空脫氣機(jī)系列真空脫氣機(jī)建議建議 .l低壓混合進(jìn)行梯度洗脫，提高泵的可靠性能。l提高泵在低流速下的操作性能l用于需要脫

10、氧的檢測器性能性能 /用途用途l與He脫氣相比，更方便，更節(jié)省費(fèi)用。l高性能脫氣，避免了煩瑣的操作，提高儀器穩(wěn)定性。 l內(nèi)部延遲體積小，便于快速進(jìn)行溶劑切換。l4通路系統(tǒng)，操作靈活。l與1100其它組件堆積在一起，用遙控線連接，用于傳輸錯(cuò)誤信號(hào)。在線真空脫氣機(jī)工作原理1 mlSolenoid valveHP 1100 Series On-line Degasser: Influence on Detector Baselineno degassinghelium degassingHP on-line degassingAbsorbency123456789Time (min)Solvent:

11、 methanol; UV signal: 210 nm溶劑傳輸系統(tǒng)往復(fù)活塞泵(單向閥)Gold SealSapphireInsertRuby BallSpringInsert泵頭泵頭 - 單元單元/四元泵四元泵Lock ScrewPump head screwsAgilent 1100系列四元泵系列四元泵G1354A; 真空脫氣機(jī)為標(biāo)準(zhǔn)配置真空脫氣機(jī)為標(biāo)準(zhǔn)配置!建議建議 .l使用2，4，8mm內(nèi)徑的柱子l流量范圍從 0.2 到 10 ml/minl應(yīng)用于研究和常規(guī)分析特征特征/優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)l四通路/低壓混合能靈活地進(jìn)行恒梯度或梯度洗脫。l無需消耗昂貴的He而能進(jìn)行高性能真空脫氣。l自動(dòng)沖程調(diào)節(jié)，

12、混合非常均勻，降低基線噪音。l對(duì)于高鹽流動(dòng)相，可選擇Seal Wash清洗密封墊。Agilent 1100系列四元泵系列四元泵G1354A包括真空脫氣機(jī)包括真空脫氣機(jī)溶劑柜溶劑柜真空脫氣機(jī)真空脫氣機(jī) G1322A四元泵四元泵 G1311A四元泵工作原理Authoring Division Name File NameSecurity Notice (if required) Vacuum ChamberMCGVAIVOBVDamperPurge ValveWasteto injection devicefrom solventbottlesMCGV 比例閥AIV 主動(dòng)閥OBV 單向閥Autho

13、ring Division Name File NameSecurity Notice (if required) Vacuum ChamberMCGVAIVOBVDamperWastefrom solventbottlesToWasteSample Loop(Fixed Volume)FromToColumnSampleSyringeLoadInjectToColumnPumpFrom PumpTo Waste手動(dòng)進(jìn)樣器六通閥六通閥之扎針123456泵色譜柱定量環(huán)廢液排空INJECT六通閥之裝樣123456泵色譜柱定量環(huán)廢液排空INJECTLOAD123456泵色譜柱定量環(huán)廢液排空六通閥之進(jìn)

14、樣INJECTLOAD123456泵色譜柱定量環(huán)廢液排空六通閥之小刻度進(jìn)樣一INJECTLOAD手動(dòng)閥流路連接樣品回路廢液排空管樣品回路到色譜柱來自泵出口手動(dòng)進(jìn)樣器前視圖后視圖樣品定量管樣品定量管固定相結(jié)構(gòu)固定相結(jié)構(gòu)本章內(nèi)容：本章內(nèi)容：固定相載體結(jié)構(gòu)正相色譜固定相鍵合相色譜固定相Typical ColumnSiSiSiSiSiPacking SupportsChemically ModifiedSilica GelOHSiOSiOHOOSiOHOSiOOSiOHPoresSilica GelSurface3CHCH3Si - O - Si - (CH2)17CH3正相 HPLC極性固定相有機(jī)流

15、動(dòng)相傳統(tǒng)目前硅膠氧化鋁氰基二醇基氨基吸附色譜鍵合相適用于:同分異構(gòu)體的分離.在有機(jī)/水流動(dòng)相中不溶化合物的分離.適用于中等極性化合物分離.硅膠柱和氧化鋁柱的缺點(diǎn)容易脫尾樣品被催化分解不易梯度洗脫含水量要控制正相色譜鍵合相OSiCH3CyanoOSiCH2()nNH2CH2DiolAmineCNSiCHOHCHCHOOH22CH3(CH )2nSiCH3CH3SiSiCH3CH3Particles of ColumnPackings50mLarge PorousParticles30mPellicularBeads3-10mMicroparticulates2m Active Surface鍵合

16、相柱優(yōu)點(diǎn)固定相不易被流動(dòng)相洗脫無需飽和色譜柱非常容易進(jìn)行梯度洗脫柱子平衡非常快使用極性范圍寬選擇性唯一柱容量大溶質(zhì)不易污染柱子Agilent 1100 柱溫箱柱溫箱TCC柱溫箱的特征及優(yōu)點(diǎn)柱溫箱的特征及優(yōu)點(diǎn)推薦推薦 .l溫度控制范圍： 低于室溫1080l保留時(shí)間的再現(xiàn)性需要穩(wěn)定 的溫度l如果需要在高于或低于室溫 進(jìn)行分離操作時(shí)，需要使用 柱溫箱特征特征/優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)l大空間，可以容納三根30cm長色譜柱l更換柱子非常方便l降溫非常方便l安裝柱識(shí)別可以記錄進(jìn)樣次數(shù)l使用切換閥可以進(jìn)行柱切換(可選)l兩個(gè)單獨(dú)的加熱區(qū)可以分別控制溫度l可以進(jìn)行程序升溫l內(nèi)部死體積小(左側(cè)3L，右側(cè)6L)Agilent

17、1100 二極管陣列檢測器二極管陣列檢測器推薦推薦 .l 研究及方法開發(fā) l 多波長檢測l 峰純度檢查l 峰確認(rèn)（定性） 性能性能/優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn).l靈敏度高 (1x10-5AU)。l 兩個(gè)燈，波長檢測范圍寬（190950 nm）。l1024個(gè)二極管 和 1 nm 狹縫 。l可變狹縫。l根據(jù)不同需要選擇流動(dòng)池。l可以進(jìn)行自動(dòng)峰檢索 。l利用紫外譜圖進(jìn)行峰確認(rèn)Front Elements - DAD 進(jìn)口管可以直接連接到色譜柱出口進(jìn)口管可以直接連接到色譜柱出口氘燈流通池室 鎢燈DAD光路鎢燈鎢燈耦合透鏡耦合透鏡氘燈氘燈光源透鏡光源透鏡(消色差透鏡消色差透鏡)氧化鈥濾光片氧化鈥濾光片支撐透鏡支撐透鏡Fl

18、ow cell光譜透鏡光譜透鏡光柵光柵陣列陣列狹縫狹縫檢測器使用統(tǒng)計(jì)檢測器使用統(tǒng)計(jì)43.0%22.0%10.0%8.0%7.0%5.0%1.0%4.0%UV-VISDADFluorescenceRefractive IndexElectrochemicalConductivityMass specOthers定性分析定性分析-探索三維立體影像探索三維立體影像 Spectral Acquisition ModeslAll spectralEvery 2nd spectrumlAll in peaklApex+Slopes+BaselineslApex+BaselineslNoneAbsorban

19、ceTime Wavelength DAD測試功能及診斷測試功能及診斷l(xiāng)DAD自檢l暗電流測試l燈強(qiáng)度測試l鈥玻璃測試l流通池測試l濾光片測試l波長校正l模擬信號(hào)輸出測試色譜數(shù)據(jù)處理裝置1.計(jì)算機(jī)2.色譜工作站溶劑準(zhǔn)備：過濾使用HPLC純?nèi)軇┻^濾裝置真空使用小于 0.5m過濾膜.有機(jī)物 - Teflon 水 - Nylon 66防止固體顆粒損傷儀器或柱頭日常維護(hù)日常維護(hù)溶劑準(zhǔn)備溶劑準(zhǔn)備 不干凈的溶劑或在溶劑瓶中長菌的溶劑會(huì)阻塞溶劑過濾器，降低泵的操作性能。 遵從下列建議可以提高性能，延長溶劑過濾器的壽命：l使用無菌溶劑瓶避免溶劑長菌。l用濾膜過濾溶劑去除微生物。l每兩天更換或過濾溶劑。l避免溶劑瓶直接日照。溶劑脫氣溶劑脫氣v目的v排除溶解在流動(dòng)相中的氧氣和氮?dú)鈜脫氣方法vHe脫氣v真空脫氣v回流加熱脫氣v超聲脫氣溶劑信息溶劑信息避免使用下列對(duì)不銹鋼有腐蝕性的溶劑：避免使用下列對(duì)不銹鋼有腐蝕性的溶劑：l鹵化物堿金屬溶液和相應(yīng)的酸溶液。l高濃度的無機(jī)酸例如：硝酸和硫酸