1、 第四章第四章 食品毒理學實驗基礎食品毒理學實驗基礎Chapter 4 Experimental Basis for Food Toxicology本章內容本章內容l4.1 常用實驗動物選擇和處理常用實驗動物選擇和處理l4.1.1 常用實驗動物特征常用實驗動物特征l4.1.2 實驗動物的選擇和處理實驗動物的選擇和處理l4.1.3 實驗動物的染毒和處置實驗動物的染毒和處置l4.2 食品毒理學試驗的設計原則食品毒理學試驗的設計原則l4.2.1 體外試驗涉及體外試驗涉及l4.2.2 體內毒理學試驗涉及體內毒理學試驗涉及l4.3 毒理學試驗結果處理和分析毒理學試驗結果處理和分析l4.3.1 毒理學試驗

2、的數據處理和統計方法毒理學試驗的數據處理和統計方法l4.3.2 統計學意義和生物學意義統計學意義和生物學意義本章學習目的與要求本章學習目的與要求l掌握實驗動物的掌握實驗動物的選擇原則和方法選擇原則和方法；l熟悉實驗動物的熟悉實驗動物的常規處置常規處置、染毒方式染毒方式、采樣采樣和和處死方法處死方法；l了解常用實驗動物外貌、生活習性、生長發育了解常用實驗動物外貌、生活習性、生長發育和解剖生理特征。和解剖生理特征。l掌握食品毒理學掌握食品毒理學實驗設計基本原則實驗設計基本原則；l熟悉毒理學熟悉毒理學試驗結果處理和分析方法試驗結果處理和分析方法。4.1 常用實驗動物選擇和處理常用實驗動物選擇和處理l

3、4.1.1 常用實驗動物特征常用實驗動物特征l實驗動物實驗動物(laboratory animals)：經人工飼育，對：經人工飼育，對其攜帶的微生物實行控制，遺傳背景明確或者來其攜帶的微生物實行控制，遺傳背景明確或者來源清楚的，用于科學研究、教學、生產、檢驗以源清楚的，用于科學研究、教學、生產、檢驗以及其他科學實驗的動物。或者簡單說及其他科學實驗的動物。或者簡單說以科學研究以科學研究為目的而進行科學飼養繁殖的動物稱為實驗動物為目的而進行科學飼養繁殖的動物稱為實驗動物。 l實驗動物種類實驗動物種類：常用的實驗動物物種為：常用的實驗動物物種為大鼠大鼠、小小鼠鼠、豚鼠、兔、狗。其他可能用到的實驗動物

4、有、豚鼠、兔、狗。其他可能用到的實驗動物有地鼠、獼猴、小型豬、雞、青蛙等。地鼠、獼猴、小型豬、雞、青蛙等。4.1.1 常用實驗動物特征常用實驗動物特征常用實驗動物生物學和生理學參數表常用實驗動物生物學和生理學參數表 4.1.1 常用實驗動物特征常用實驗動物特征常用實驗動物生物學和生理學參數表（續）常用實驗動物生物學和生理學參數表（續）4.1.2 實驗動物的選擇和處理實驗動物的選擇和處理4.1.2.1 實驗動物的選擇實驗動物的選擇l毒理學的動物實驗是以實驗動物作為研究對象，為獲得毒理學的動物實驗是以實驗動物作為研究對象，為獲得可靠的研究結果，可靠的研究結果，先決條件先決條件是正確地選用實驗動物。

5、是正確地選用實驗動物。 l實驗動物選擇實驗動物選擇原因原因：l外源化學物的固有毒性往往在人和不同物種實驗動物外源化學物的固有毒性往往在人和不同物種實驗動物之間表現不同，之間表現不同，物種差別物種差別可以表現在可以表現在量方面量方面，引起毒，引起毒性的劑量差別，即毒性大小的差別，如有報道，人對性的劑量差別，即毒性大小的差別，如有報道，人對138種化學物的敏感性為大鼠的種化學物的敏感性為大鼠的1.8-10.5倍。倍。l物種差別也可以表現在物種差別也可以表現在質方面質方面( (毒性效應的差別毒性效應的差別) )，如，如除草劑百草枯除草劑百草枯對人引起肺損傷，而對狗則未見到。對人引起肺損傷，而對狗則未

6、見到。 4.1.2.1 實驗動物的選擇實驗動物的選擇選擇原則選擇原則l相似性原則相似性原則：選擇結構、功能、代謝、群體分布、疾：選擇結構、功能、代謝、群體分布、疾病狀態方面與人類相似的物種。病狀態方面與人類相似的物種。l差異性原則差異性原則：研究過程要求以差異為指標或特殊條件：研究過程要求以差異為指標或特殊條件時，選用不同種系實驗動物的某些特殊反應，更適合時，選用不同種系實驗動物的某些特殊反應，更適合于不同研究目的的要求。于不同研究目的的要求。例如人類利用不同種屬動物例如人類利用不同種屬動物對病原微生物的易感性差異來生產弱毒疫苗對病原微生物的易感性差異來生產弱毒疫苗。l易化性原則易化性原則：進

7、化程度高、結構功能復雜的動物有時：進化程度高、結構功能復雜的動物有時會給實驗條件控制或實驗結果分析帶來困難，則應從會給實驗條件控制或實驗結果分析帶來困難，則應從易化角度入手，選擇既能滿足實驗要求，結構功能又易化角度入手，選擇既能滿足實驗要求，結構功能又簡單，便于實驗分析的動物。如反射弧的研究選擇簡單，便于實驗分析的動物。如反射弧的研究選擇兩兩棲動物棲動物；遺傳學研究選擇；遺傳學研究選擇果蠅果蠅。4.1.2.1 實驗動物的選擇實驗動物的選擇選擇原則選擇原則l相容或相匹配原則相容或相匹配原則：設計動物實驗時，選用的動物：設計動物實驗時，選用的動物質量等級要與實驗設計、實驗條件、實驗者技術、質量等級

8、要與實驗設計、實驗條件、實驗者技術、方法、試劑性能相匹配。方法、試劑性能相匹配。l可獲得性原則可獲得性原則：在不影響實驗質量的前提下，選擇：在不影響實驗質量的前提下，選擇最易獲得、最經濟、易飼養管理的動物。最易獲得、最經濟、易飼養管理的動物。l重復性和均一性原則重復性和均一性原則：選用標準化的實驗動物。杜：選用標準化的實驗動物。杜絕使用隨意交配而來的雜種動物和未經任何微生物絕使用隨意交配而來的雜種動物和未經任何微生物控制的非標準化動物。控制的非標準化動物。4.1.2.1 實驗動物的選擇實驗動物的選擇選擇方法選擇方法l物種選擇物種選擇l物種選擇的物種選擇的基本原則基本原則l選擇對受試物在代謝、生

9、物化學和毒理學特征與人選擇對受試物在代謝、生物化學和毒理學特征與人最接近的物種；最接近的物種；l自然壽命不太長的物種；自然壽命不太長的物種；l易于飼養和實驗操作的物種；易于飼養和實驗操作的物種；l經濟并易于獲得的物種。經濟并易于獲得的物種。l目前常規選擇物種的方式是利用兩個物種，一種是目前常規選擇物種的方式是利用兩個物種，一種是嚙齒類嚙齒類，另一種是，另一種是非嚙齒類非嚙齒類。4.1.2.1 實驗動物的選擇實驗動物的選擇選擇方法選擇方法l系統毒性研究最常用的嚙齒類是系統毒性研究最常用的嚙齒類是大鼠和小鼠大鼠和小鼠，非嚙，非嚙齒類是狗；齒類是狗；l豚鼠豚鼠常用于皮膚刺激試驗和常用于皮膚刺激試驗和

10、致敏致敏試驗；試驗；l兔兔常用于皮膚刺激試驗和眼刺激試驗；常用于皮膚刺激試驗和眼刺激試驗；l遺傳毒理學試驗多用遺傳毒理學試驗多用小鼠小鼠；l致癌試驗常用大鼠和小鼠；致癌試驗常用大鼠和小鼠；l致畸試驗常用大鼠、小鼠和兔；致畸試驗常用大鼠、小鼠和兔；l遲發性神經毒性試驗常用遲發性神經毒性試驗常用母雞母雞。 l4.1.2.1 實驗動物的選擇選擇方法品系選擇品系選擇品系品系是實驗動物學的專用名詞，指用計劃交配的是實驗動物學的專用名詞，指用計劃交配的方法，獲得起源于共同祖先的一群動物。方法，獲得起源于共同祖先的一群動物。 實驗動物按遺傳學控制分類可分為：實驗動物按遺傳學控制分類可分為：近交系近交系：指同

11、胞兄妹或親子之間連續交配：指同胞兄妹或親子之間連續交配20代以上代以上而而培育的純品系動物。群體基因才能達到純合和基本穩定。培育的純品系動物。群體基因才能達到純合和基本穩定。雜交群動物雜交群動物( (雜交雜交1代代) )，指兩個不同的近交系之間有目，指兩個不同的近交系之間有目的進行交配，所產生的第一代動物。的進行交配，所產生的第一代動物。封閉群封閉群：一個種群在五年以上不從外部引進新血緣，：一個種群在五年以上不從外部引進新血緣，僅由同一品系的動物在固定場所隨機交配繁殖的動物群。僅由同一品系的動物在固定場所隨機交配繁殖的動物群。 根據實驗動物遺傳的均一性排序，近交系最高、根據實驗動物遺傳的均一性

12、排序，近交系最高、雜交群次之、封閉群較低。雜交群次之、封閉群較低。 4.1.2.1 實驗動物的選擇實驗動物的選擇選擇方法選擇方法l實驗動物微生物控制的選擇實驗動物微生物控制的選擇 對于毒性試驗及毒理學研究應盡可能使用對于毒性試驗及毒理學研究應盡可能使用級級( (或或級以級以上上) )的動物，以保證實驗結果的可靠性。的動物，以保證實驗結果的可靠性。4.1.2.1 實驗動物的選擇實驗動物的選擇選擇方法選擇方法 實驗動物對外來化學物的毒性反應還存在個體差異，應實驗動物對外來化學物的毒性反應還存在個體差異，應注意實驗動物的個體選擇。重點是動物的注意實驗動物的個體選擇。重點是動物的性別、年齡、體性別、年

13、齡、體重、生理狀態和健康狀況重、生理狀態和健康狀況。l對于初次試驗的受試物，應該采用兩種性別。對于初次試驗的受試物，應該采用兩種性別。l毒理學試驗選用實驗動物的年齡取決于試驗的類型。毒理學試驗選用實驗動物的年齡取決于試驗的類型。l急性試驗一般選用成年動物；急性試驗一般選用成年動物；l慢性試驗因實驗周期長，應選用較年幼的或初斷乳的慢性試驗因實驗周期長，應選用較年幼的或初斷乳的動物，以使實驗周期能復蓋成年期。動物，以使實驗周期能復蓋成年期。l實際工作中常以動物的體重粗略地判斷動物的年齡。實際工作中常以動物的體重粗略地判斷動物的年齡。l性激素對外源化學物代謝轉化有影響，故應選用未產未孕性激素對外源化

14、學物代謝轉化有影響，故應選用未產未孕的雌性動物。但在某些試驗如顯性致死試驗、致畸試驗及的雌性動物。但在某些試驗如顯性致死試驗、致畸試驗及繁殖試驗等，則需有計劃地合籠交配。繁殖試驗等，則需有計劃地合籠交配。 l為確保選擇健康動物，一般在實驗前觀察為確保選擇健康動物，一般在實驗前觀察5-7天。天。 4.1.2.1 實驗動物的選擇實驗動物的選擇選擇方法選擇方法大、小鼠大、小鼠根據形態根據形態鑒定日齡鑒定日齡（大、小（大、小情況基本情況基本一樣）一樣）4.1.2.2 實驗動物的處理實驗動物的處理l1.健康檢疫健康檢疫l實驗動物在購進之后，應雌雄分開飼養。一般應進行實驗動物在購進之后，應雌雄分開飼養。一

15、般應進行5-7天天的檢疫，在此期間應多次觀察動物，及時剔除不健康的動的檢疫，在此期間應多次觀察動物，及時剔除不健康的動物。物。 l2.實驗動物的抓取和固定方法實驗動物的抓取和固定方法l3.性別鑒定性別鑒定l4.實驗動物的編號和標記方法實驗動物的編號和標記方法l實驗動物的標記方法對嚙齒動物常用染色法，可用苦味酸實驗動物的標記方法對嚙齒動物常用染色法，可用苦味酸( (黃色黃色) )、品紅、品紅( (紅色紅色) )的酒精飽和溶液在動物被毛上染色。的酒精飽和溶液在動物被毛上染色。l對嚙齒動物還可用剪耳法標記。對嚙齒動物還可用剪耳法標記。l對狗等大動物一般用掛牌法。對狗等大動物一般用掛牌法。 l5.實驗

16、動物被毛去除方法實驗動物被毛去除方法l剪毛、拔毛、剃毛、脫毛（如硫化鈉或硫化鋇）剪毛、拔毛、剃毛、脫毛（如硫化鈉或硫化鋇）l6.實驗動物的麻醉實驗動物的麻醉4.1.2.2 實驗動物的處理實驗動物的處理 2. 實驗動物的抓取和固定方法實驗動物的抓取和固定方法小鼠小鼠用右手提起小鼠尾部，放在實驗用右手提起小鼠尾部，放在實驗臺上，當其向前爬行時，左手抓臺上，當其向前爬行時，左手抓住兩耳及頭頸部皮膚，再置小鼠住兩耳及頭頸部皮膚，再置小鼠于左手心，拉直四肢并用手指夾于左手心，拉直四肢并用手指夾住肢體固定。右手可行注射或其住肢體固定。右手可行注射或其它操作。它操作。 大鼠大鼠右手輕輕抓住大鼠尾部向后輕拉，

17、左手右手輕輕抓住大鼠尾部向后輕拉，左手抓緊鼠兩耳及頭頸部皮膚，并將其固定抓緊鼠兩耳及頭頸部皮膚，并將其固定在左手中，右手可行注射或其它操作。在左手中，右手可行注射或其它操作。4.1.2.2 實驗動物的處理實驗動物的處理 2. 實驗動物的抓取和固定方法實驗動物的抓取和固定方法兔兔1 1、可傷兩腎；、可傷兩腎；2 2、可造成皮下出血；、可造成皮下出血；3 3、可傷兩耳；、可傷兩耳；4 4、頸部皮膚厚可抓；、頸部皮膚厚可抓；5 5、用手拖住身體。用手拖住身體。4 4和和5 5為正確的方法。為正確的方法。豚鼠豚鼠先用手掌以穩準的手法迅速扣住豚鼠背先用手掌以穩準的手法迅速扣住豚鼠背部，抓住其肩胛上方，將

18、手張開，用手部，抓住其肩胛上方，將手張開，用手指握住頸部，或握住身體的四周，再拿指握住頸部，或握住身體的四周，再拿起來。懷孕或體重較大的豚鼠，應以另起來。懷孕或體重較大的豚鼠，應以另手托其臀部。手托其臀部。4.1.2.2 實驗動物的處理實驗動物的處理 4. 實驗動物的編號和標記方法實驗動物的編號和標記方法染染色色法法4.1.2.2 實驗動物的處理實驗動物的處理 4. 實驗動物的編號和標記方法實驗動物的編號和標記方法耳朵標記方法耳朵標記方法4.1.3 實驗動物的染毒和處置實驗動物的染毒和處置l4.1.3.1 實驗動物染毒實驗動物染毒l毒理學試驗中染毒途徑的選擇，應盡可能毒理學試驗中染毒途徑的選擇

19、，應盡可能模擬人模擬人在在接觸該受試物的方式。接觸該受試物的方式。l最常用的染毒途徑為經最常用的染毒途徑為經口口、經、經呼吸道呼吸道、經、經皮皮及及注射注射途徑。途徑。l不同途徑的吸收速率，一般是：靜脈注射吸入不同途徑的吸收速率，一般是：靜脈注射吸入肌肉注射腹腔注射皮下注射經口皮內注射肌肉注射腹腔注射皮下注射經口皮內注射其他途徑其他途徑( (如經皮等如經皮等) )。 4.1.3.1 實驗動物染毒實驗動物染毒1. 經口經口( (胃腸道胃腸道) )染毒染毒l常用有常用有喂飼喂飼、灌胃灌胃和和吞咽膠囊吞咽膠囊等方式。等方式。 (1) 喂飼：將受試物摻入動物飼料或飲水中供實驗動物喂飼：將受試物摻入動物

20、飼料或飲水中供實驗動物自行攝入。自行攝入。l優點：簡單易行，符合人類接觸受試物的實際情況。優點：簡單易行，符合人類接觸受試物的實際情況。l缺點：如適口性差的受試物，動物拒食，攝入量達不缺點：如適口性差的受試物，動物拒食，攝入量達不到設計劑量；易揮發或易水解的受試物不適用。到設計劑量；易揮發或易水解的受試物不適用。l實驗動物應單籠喂飼，以食物消耗量計算其實際染毒實驗動物應單籠喂飼，以食物消耗量計算其實際染毒劑量。劑量。 4.1.3.1 實驗動物染毒實驗動物染毒經口經口( (胃腸道胃腸道) )染染毒毒(2) 灌胃灌胃：將受試物配制成溶液或混懸液，以注射器經：將受試物配制成溶液或混懸液，以注射器經導

21、管注入胃內。導管注入胃內。l大鼠隔夜禁食，小鼠可禁食大鼠隔夜禁食，小鼠可禁食4小時小時( (因小鼠消化吸收和代謝因小鼠消化吸收和代謝速度較快速度較快) )，均不停飲水。灌胃后，均不停飲水。灌胃后24小時提供飼料。小時提供飼料。l經口多次染毒，一般不禁食，但應每日定時染毒。經口多次染毒，一般不禁食，但應每日定時染毒。l灌胃法優點是劑量準確，缺點是工作量大，并有傷及食道灌胃法優點是劑量準確，缺點是工作量大，并有傷及食道或誤入氣管的可能。或誤入氣管的可能。 (3) 吞咽膠囊吞咽膠囊：將一定劑量的受試物裝入膠囊中，放至：將一定劑量的受試物裝入膠囊中，放至動物的舌后部，迫使動物咽下，此法劑量準確，適動物

22、的舌后部，迫使動物咽下，此法劑量準確，適用于易揮發、易水解和有異味的受試物。缺點是動用于易揮發、易水解和有異味的受試物。缺點是動物有咬傷人的危險。物有咬傷人的危險。4.1.3.1 實驗動物染毒實驗動物染毒2. 經呼吸道染毒經呼吸道染毒經呼吸道染毒可分為吸入經呼吸道染毒可分為吸入染毒染毒和和氣管內注入氣管內注入。 (1) 靜式吸入染毒：將一定數量的嚙齒類動物放在密靜式吸入染毒：將一定數量的嚙齒類動物放在密閉的染毒柜中，加入易揮發的液態受試物或氣態受閉的染毒柜中，加入易揮發的液態受試物或氣態受試物使成一定濃度。試物使成一定濃度。l染毒簡易；染毒簡易；l但缺點較多，主要是隨試驗進行氧分壓降低但缺點較

23、多，主要是隨試驗進行氧分壓降低( (因此，實驗因此，實驗動物數量有限制動物數量有限制) )，柜內受試物濃度也逐漸下降，柜內受試物濃度也逐漸下降( (由于動物由于動物吸入消耗、為被毛及染毒柜壁吸附所致吸入消耗、為被毛及染毒柜壁吸附所致) )，而且實驗動物，而且實驗動物有經皮吸收的可能。有經皮吸收的可能。4.1.3.1 實驗動物染毒實驗動物染毒經呼吸道染毒經呼吸道染毒(2) 動式吸入染毒：由染毒柜、機械通風系統和配氣動式吸入染毒：由染毒柜、機械通風系統和配氣系統三部分構成。系統三部分構成。l優點是在染毒過程中染毒柜內氧分壓及受試物濃度較優點是在染毒過程中染毒柜內氧分壓及受試物濃度較穩定；穩定；l缺

24、點是消耗受試物的量大，并易于污染環境。缺點是消耗受試物的量大，并易于污染環境。l動式吸入染毒又分為整體接觸和口鼻接觸兩種。動式吸入染毒又分為整體接觸和口鼻接觸兩種。l動式吸入染毒柜中受試物的濃度應實際監測。動式吸入染毒柜中受試物的濃度應實際監測。(3) 氣管內注入：實驗動物在麻醉后，將受試物注入氣管內注入：實驗動物在麻醉后，將受試物注入氣管，使之分布至兩肺。此法用于建立急性中毒模氣管，使之分布至兩肺。此法用于建立急性中毒模型及塵肺研究。型及塵肺研究。4.1.3.1 實驗動物染毒實驗動物染毒3. 經皮膚染毒經皮膚染毒l將受試動物皮膚表面涂抹一定量的受試物，再用紗將受試動物皮膚表面涂抹一定量的受試

25、物，再用紗布和塑料薄膜蓋上，用膠布固定，接觸規定的時間。布和塑料薄膜蓋上，用膠布固定，接觸規定的時間。l經皮膚染毒的目的有兩種經皮膚染毒的目的有兩種： 一種是一種是經皮染毒毒性試驗經皮染毒毒性試驗，如經，如經皮皮LD50測定常用大測定常用大鼠，鼠，皮膚致癌試驗常用小鼠皮膚致癌試驗常用小鼠。 另一種是另一種是皮膚刺激和致敏試驗皮膚刺激和致敏試驗，皮膚刺激試驗常用，皮膚刺激試驗常用兔和豚鼠，皮膚致敏試驗用豚鼠。兔和豚鼠，皮膚致敏試驗用豚鼠。 4.1.3.1 實驗動物染毒實驗動物染毒4. 注射染毒注射染毒l分為皮內注射、皮下注射、腹腔注射、肌內注射和靜脈分為皮內注射、皮下注射、腹腔注射、肌內注射和靜

26、脈注射。對注射。對大小鼠可用靜脈注射大小鼠可用靜脈注射，非嚙齒類可模擬臨床用，非嚙齒類可模擬臨床用藥途徑，如狗可用后肢隱靜脈注射，而嚙齒類的尾靜脈藥途徑，如狗可用后肢隱靜脈注射，而嚙齒類的尾靜脈和肌肉注射難以多次染毒，必要時可改為和肌肉注射難以多次染毒，必要時可改為皮下注射皮下注射。l靜脈注射應控制速度，大鼠尾靜脈注射最好控制在靜脈注射應控制速度，大鼠尾靜脈注射最好控制在10秒秒以上。以上。l注射染毒應調整受試物的注射染毒應調整受試物的pH及滲透壓，及滲透壓，pH應應5-8，最好，最好是等滲溶液，是等滲溶液，動物對高滲的耐受力比低滲強動物對高滲的耐受力比低滲強。l腹腔注射腹腔注射在遺傳毒理學實

27、驗中有時也用，但在致畸試驗、在遺傳毒理學實驗中有時也用，但在致畸試驗、肝肝UDS研究不應該用腹腔注射，以避免可能的損傷和局研究不應該用腹腔注射，以避免可能的損傷和局部高濃度對靶器官的影響。部高濃度對靶器官的影響。4.1.3.2 實驗動物處置實驗動物處置(1)生物標本采集生物標本采集l在實驗過程中常需要對生物樣品如在實驗過程中常需要對生物樣品如血液、尿液、膽血液、尿液、膽汁、糞便汁、糞便等進行檢測或檢查，它們是反映受試物的等進行檢測或檢查，它們是反映受試物的生物學效應和物質在體內代謝情況的最重要途徑。生物學效應和物質在體內代謝情況的最重要途徑。l血液采集血液采集l大小鼠如需血量小可用大小鼠如需血

28、量小可用鼠尾采血鼠尾采血，如需血量較多可，如需血量較多可用用眼眶靜脈叢采血眼眶靜脈叢采血或處死時或處死時股動脈放血采血股動脈放血采血。l狗可用狗可用后肢隱靜脈抽血后肢隱靜脈抽血。l不影響動物生理功能的最大取血量為其總血量不影響動物生理功能的最大取血量為其總血量( (50ml/kg體重體重) )的的10。 4.1.3.2 實驗動物處置實驗動物處置(1)生物標本采集生物標本采集 l尿液采集尿液采集 l對大小鼠可用對大小鼠可用代謝籠法代謝籠法，下部有糞尿分離器。，下部有糞尿分離器。l對狗可用對狗可用接尿法接尿法或或導尿法導尿法。 l膽汁采集膽汁采集l直接插管至膽總管采集直接插管至膽總管采集l糞便采集

29、糞便采集l對大小鼠可用對大小鼠可用代謝籠法代謝籠法，下部有糞尿分離器，分析，下部有糞尿分離器，分析前剔去表層。前剔去表層。4.1.3.2 實驗動物處置實驗動物處置(2) 安死術及其操作方法安死術及其操作方法l安死術是指用公眾認可的、以人道主義的方法處死動物安死術是指用公眾認可的、以人道主義的方法處死動物的過程，即達到沒有驚恐或焦慮而安靜地、無痛苦地死的過程，即達到沒有驚恐或焦慮而安靜地、無痛苦地死亡。安死方法最重要的標準是應具有保證動物中樞神經亡。安死方法最重要的標準是應具有保證動物中樞神經系統立即大道失去痛覺的早期抑制作用。應盡量采用適系統立即大道失去痛覺的早期抑制作用。應盡量采用適當的處死

30、方法，減少實驗動物的痛苦。當的處死方法，減少實驗動物的痛苦。 l大小鼠可用頸椎脫臼法（脊髓與腦髓拉斷），然后股動大小鼠可用頸椎脫臼法（脊髓與腦髓拉斷），然后股動脈放血，動物立即死亡。脈放血，動物立即死亡。l兔、豚鼠、狗等一般用兔、豚鼠、狗等一般用股動脈放血處死股動脈放血處死，或向，或向靜脈內注靜脈內注射一定量的空氣射一定量的空氣使之發生嚴重的血液循環障礙的空氣栓使之發生嚴重的血液循環障礙的空氣栓塞法。塞法。l化學藥物致死法均適合。化學藥物致死法均適合。4.1.3.2 實驗動物處置實驗動物處置(3) 病理解剖和標本留取病理解剖和標本留取l毒性病理學檢查包括大體解剖和組織病理學檢查毒性病理學檢查包

31、括大體解剖和組織病理學檢查兩部分。兩部分。急性毒性試驗中在試驗期中死亡或試驗急性毒性試驗中在試驗期中死亡或試驗結束處死的動物都應進行尸體解剖結束處死的動物都應進行尸體解剖，因為急性毒，因為急性毒性試驗的目的是得到有關可能的性試驗的目的是得到有關可能的靶器官信息靶器官信息以及以及進行重復染毒試驗劑量設計的信息。進行重復染毒試驗劑量設計的信息。4.2 食品毒理學試驗的設計原則食品毒理學試驗的設計原則l試驗設計試驗設計(experimental design)是指為試驗研究制定出一個通是指為試驗研究制定出一個通盤的、周密的、安排合理的、科學性強的設計方案，將試驗盤的、周密的、安排合理的、科學性強的設

32、計方案，將試驗對象隨機分配到兩個或多個組中，對試驗對象施加某種干預對象隨機分配到兩個或多個組中，對試驗對象施加某種干預或處理因素，觀察比較不同處理的效應。或處理因素，觀察比較不同處理的效應。l食品毒理學試驗包括食品毒理學試驗包括體內試驗和體外試驗兩種體內試驗和體外試驗兩種。l體內試驗是以實驗動物為模型，通過外源化學物對實驗動物的毒性反體內試驗是以實驗動物為模型，通過外源化學物對實驗動物的毒性反應，向人（原型）外推，以期評估外源化學物對人的危害及危險性。應，向人（原型）外推，以期評估外源化學物對人的危害及危險性。l體外試驗則主要用于篩選和預測急性毒性和機制研究。體外試驗則主要用于篩選和預測急性毒

33、性和機制研究。l毒理學實驗能否獲得預期結果，試驗前的試驗設計至關重要。毒理學實驗能否獲得預期結果，試驗前的試驗設計至關重要。l科研設計遵循的三原則：科研設計遵循的三原則：隨機、重復、對照隨機、重復、對照。4.2.1 體外試驗設計體外試驗設計l1 溶劑溶劑/ /賦形劑賦形劑l所用溶劑所用溶劑/ /賦形劑不應與受試物發生化學反應。推薦使用賦形劑不應與受試物發生化學反應。推薦使用溶劑溶劑/ /賦形劑。賦形劑。l2 受試物受試物l了解受試物各方面性質，測定受試物在試驗介質中的溶解了解受試物各方面性質，測定受試物在試驗介質中的溶解性。溶解性限度就是出現沉淀的最低濃度。性。溶解性限度就是出現沉淀的最低濃度

34、。l3 受試對象受試對象l4 劑量設置劑量設置l5 代謝活化代謝活化l代謝活化系統的選擇和條件依賴于受試物的類別。代謝活化系統的選擇和條件依賴于受試物的類別。l6 對照對照l未處理（空白）對照、陽性對照、陰性對照未處理（空白）對照、陽性對照、陰性對照l7 重復重復l由質控良好的實驗得到明確的陰性結果和陽性結果，不強由質控良好的實驗得到明確的陰性結果和陽性結果，不強調要求重復。可疑結果則應重復實驗。調要求重復。可疑結果則應重復實驗。 4.2.2 體內毒理學試驗設計體內毒理學試驗設計l1 實驗動物實驗動物l動物選擇，首選實驗動物是其對受試物的代謝過程、動物選擇，首選實驗動物是其對受試物的代謝過程、

35、生理反應和生化特性基本上與人接近的。生理反應和生化特性基本上與人接近的。l動物數量，各組各組動物數的設計應考慮到統計學動物數量，各組各組動物數的設計應考慮到統計學的要求。的要求。l2 受試物受試物l資料、處置、給予方式資料、處置、給予方式4.2.2 體內毒理學試驗設計體內毒理學試驗設計l3 對照對照l對照條件對照條件l對照類型對照類型未處理（空白）對照（必要時設）未處理（空白）對照（必要時設）：對照組不施加任何處理：對照組不施加任何處理因素，不給受試物也不給以相應的操作。因素，不給受試物也不給以相應的操作。 l陽性對照（必須設）陽性對照（必須設）：用已知的陽性物：用已知的陽性物( (如致突變物

36、如致突變物) )檢測檢測試驗體系的有效性。如在遺傳毒理學試驗、致畸試驗和致試驗體系的有效性。如在遺傳毒理學試驗、致畸試驗和致癌試驗中用已知的致突變物、致畸物或致癌物染毒，應該癌試驗中用已知的致突變物、致畸物或致癌物染毒，應該得到肯定的陽性結果得到肯定的陽性結果( (即致突變性、致畸性或致癌性即致突變性、致畸性或致癌性) )。 l陰性對照（盡可能設）陰性對照（盡可能設）：不給處理因素但給以必須的實驗：不給處理因素但給以必須的實驗因素因素( (溶劑賦形劑溶劑賦形劑) )，以排除此實驗因素，以排除此實驗因素( (溶劑賦形劑溶劑賦形劑) )的影響。沒有陰性對照組就不能說明受試物染毒與有害作的影響。沒有

37、陰性對照組就不能說明受試物染毒與有害作用之間的關系。用之間的關系。 l歷史性對照歷史性對照：由本實驗室過去多次實驗的對照組數據組成。：由本實驗室過去多次實驗的對照組數據組成。4.2.2 體內毒理學試驗設計體內毒理學試驗設計l4 劑量分組劑量分組l一般至少要設一般至少要設3個劑量組個劑量組( (即高劑量組、中劑量組、即高劑量組、中劑量組、低劑量組低劑量組) )。l一般要求，一般要求，高劑量組應出現明確的有害作用高劑量組應出現明確的有害作用，或者，或者高劑量組劑量已達到染毒的極限劑量高劑量組劑量已達到染毒的極限劑量( (如大鼠或小鼠如大鼠或小鼠灌胃或注射的最大容量灌胃或注射的最大容量) )。l低劑

38、量組應不出現任何可觀察到的有害作用低劑量組應不出現任何可觀察到的有害作用( (即相當即相當于于NOAEL) )，但低劑量組劑量應當高于人可能的接，但低劑量組劑量應當高于人可能的接觸劑量，至少等于人可能的接觸劑量。觸劑量，至少等于人可能的接觸劑量。l中劑量組的劑量介于高劑量組和低劑量組之間中劑量組的劑量介于高劑量組和低劑量組之間，應，應出現輕微的毒性效應出現輕微的毒性效應( (即相當于即相當于LOAEL) )。 l5 觀察指標觀察指標l指標的有效性、客觀性、準確度和精密度、靈敏度、指標的有效性、客觀性、準確度和精密度、靈敏度、特異性、選擇指標的數目、指標的標準化特異性、選擇指標的數目、指標的標準

39、化4.2.2 體內毒理學試驗設計體內毒理學試驗設計l6 試驗期限試驗期限l某些試驗某些試驗( (如致畸試驗和多代生殖試驗如致畸試驗和多代生殖試驗) )的試驗期限是由的試驗期限是由受試實驗動物物種或品系而決定的。而其他毒性試驗的受試實驗動物物種或品系而決定的。而其他毒性試驗的期限在某種程度上由定義所決定。期限在某種程度上由定義所決定。l7 試驗設計常用方法試驗設計常用方法l完全隨機設計完全隨機設計l配對設計配對設計l隨機區組設計隨機區組設計l析因設計析因設計l拉丁方設計拉丁方設計4.3 毒理學實驗結果處理和分析毒理學實驗結果處理和分析l在評價毒理學試驗的結果時，應綜合考慮生物在評價毒理學試驗的結

40、果時，應綜合考慮生物學意義和統計學意義。學意義和統計學意義。統計檢驗統計檢驗的假設是關于的假設是關于總體特征的假設，檢驗方法是以統計量的抽樣總體特征的假設，檢驗方法是以統計量的抽樣分布為根據的，得到的結論是概率性的，不是分布為根據的，得到的結論是概率性的，不是絕對的肯定或否定，不等同于有或無生物學意絕對的肯定或否定，不等同于有或無生物學意義。對實驗結果作出科學的判斷和解釋，應該義。對實驗結果作出科學的判斷和解釋，應該根據統計學分析的結果、生物學知識和經驗。根據統計學分析的結果、生物學知識和經驗。 4.3.1 毒理學試驗的數據處理和統計方法毒理學試驗的數據處理和統計方法4.3.1.1 毒理學研究

41、的數據類型毒理學研究的數據類型l計量資料計量資料l通過對觀察單位用定量的辦法測量某項指標數量大通過對觀察單位用定量的辦法測量某項指標數量大小所得到的資料。如動物身長、體重、血紅蛋白量、小所得到的資料。如動物身長、體重、血紅蛋白量、進食量等。進食量等。l分類資料分類資料l將觀察單位按某物種性別或類別分組，然后慶典各將觀察單位按某物種性別或類別分組，然后慶典各組的觀察單位數目所得到的資料，如實驗動物的性組的觀察單位數目所得到的資料，如實驗動物的性別分雌雄，實驗結果分陽性、陰性等別分雌雄，實驗結果分陽性、陰性等。4.3.1 毒理學試驗的數據處理和統計方法毒理學試驗的數據處理和統計方法4.3.1.1

42、毒理學研究的數據類型毒理學研究的數據類型l等級資料等級資料l將觀察單位按某種屬性的不同程度分組，統計各組將觀察單位按某種屬性的不同程度分組，統計各組的觀察單位數目所得到的資料。如效果判定為顯效、的觀察單位數目所得到的資料。如效果判定為顯效、有效、無效；程度分輕、中、重；實驗室檢測結果有效、無效；程度分輕、中、重；實驗室檢測結果分、分、 、 等。等。l數據類型轉換數據類型轉換l如將血紅蛋白按正常與異常分組，資料便轉換為計如將血紅蛋白按正常與異常分組，資料便轉換為計數資料。數資料。l數據轉換數據轉換l穩定方差、直線化、使分布正態化或接近正態。穩定方差、直線化、使分布正態化或接近正態。4.3.1 毒

43、理學試驗的數據處理和統計方法毒理學試驗的數據處理和統計方法4.3.1.2 假設檢驗的一般考慮假設檢驗的一般考慮l實驗和觀察的單位實驗和觀察的單位l處理組間進行比較的形式處理組間進行比較的形式l假設檢驗和概率值假設檢驗和概率值4.3.1.3 數據處理和統計方法數據處理和統計方法l(1) 處理組與陰性對照組比較處理組與陰性對照組比較l(2) 劑量劑量- -效應關系和劑量效應關系和劑量- -反應關系反應關系l(3) IPCS推薦的統計學分析方法推薦的統計學分析方法l(4) 常規毒理學試驗資料推薦的統計學方法常規毒理學試驗資料推薦的統計學方法4.3.2 統計學意義和生物學意義統計學意義和生物學意義l在

44、評價毒理學試驗結果時，要綜合評價實驗結果在評價毒理學試驗結果時，要綜合評價實驗結果的統計學意義和生物學意義。的統計學意義和生物學意義。l一般來說，具有統計學意義是具有生物學意義的一般來說，具有統計學意義是具有生物學意義的必要條件之一。正確地利用統計學假設檢驗的結必要條件之一。正確地利用統計學假設檢驗的結果有助于確定實驗結果的生物學關聯。正確地利果有助于確定實驗結果的生物學關聯。正確地利用統計學假設檢驗的結果有助于確定實驗結果的用統計學假設檢驗的結果有助于確定實驗結果的生物學關聯。生物學關聯。4.3.2 統計學意義和生物學意義統計學意義和生物學意義4.3.2.1 處理相關反應的確定處理相關反應的

45、確定l劑量相關趨勢劑量相關趨勢l反應重現性反應重現性l相關發現相關發現l組間差異的大小與類型組間差異的大小與類型l性別差異性別差異l差異出現的時間性差異出現的時間性4.3.2.2 參考范圍參考范圍l識別異常的陰性對照值識別異常的陰性對照值l可以更好地理解低發生率的發現可以更好地理解低發生率的發現l可以更好地理解高發生率的發現可以更好地理解高發生率的發現4.3.2 統計學意義和生物學意義統計學意義和生物學意義4.3.2.3 生物學意義（即生物學重要性）的判斷生物學意義（即生物學重要性）的判斷l在判斷生物學意義在判斷生物學意義( (即生物學重要性即生物學重要性) )時，可考慮以下步驟。時，可考慮以下步驟。l(1) 縱向比較：此參數的改變有無劑量縱向比較：此參數的改變有無劑量-