1、第七章 工業(yè)微生物誘變育種基本步驟基本步驟 原種（出發(fā)菌株）原種（出發(fā)菌株）純化純化斜面斜面同步培養(yǎng)同步培養(yǎng)離離心洗滌心洗滌振蕩打散振蕩打散過濾過濾菌懸液菌懸液誘變處理誘變處理平板平板分離分離斜面（活菌計數(shù)）斜面（活菌計數(shù)）（變異率）（變異率）（初篩）（初篩） 斜面斜面 斜面斜面性能鑒定性能鑒定（復篩）（復篩）（再復篩）（再復篩） 保藏及擴大試驗保藏及擴大試驗篩選菌種篩選菌種基因型改變基因型改變產(chǎn)量評估產(chǎn)量評估工業(yè)微生物中過程的工業(yè)微生物中過程的三個階段：三個階段：工業(yè)微生物誘變育種的意義：工業(yè)微生物誘變育種的意義：1 1、提高有效產(chǎn)物的產(chǎn)量；、提高有效產(chǎn)物的產(chǎn)量；2 2、改善菌種特性、提高產(chǎn)

2、品質量；、改善菌種特性、提高產(chǎn)品質量；3 3、簡化工藝條件；、簡化工藝條件；4 4、開發(fā)新品種。、開發(fā)新品種。第一節(jié)第一節(jié) 誘變育種的試驗設計和準備工作誘變育種的試驗設計和準備工作 誘變的結果是產(chǎn)生變異，誘變的結果是產(chǎn)生變異，負變負變機率高于正變。高機率高于正變。高產(chǎn)突變型是多基因決定，需要產(chǎn)突變型是多基因決定，需要多代誘發(fā)突變多代誘發(fā)突變逐漸積累。逐漸積累。 誘變育種工作包括：誘變育種工作包括：誘發(fā)突變、突變株的篩選和誘發(fā)突變、突變株的篩選和高產(chǎn)突變株最佳環(huán)境條件的調整高產(chǎn)突變株最佳環(huán)境條件的調整。 在誘變育種前，應該對大生產(chǎn)的在誘變育種前，應該對大生產(chǎn)的設備和工藝設備和工藝具有具有相當?shù)闹?/p>

3、識和全面的了解。相當?shù)闹R和全面的了解。 誘變的工作量大，周期長誘變的工作量大，周期長, ,事先要做好充分的準備。事先要做好充分的準備。 一、誘變前對出發(fā)菌株的了解一、誘變前對出發(fā)菌株的了解1. 1. 區(qū)分不同菌落類型區(qū)分不同菌落類型 土霉素產(chǎn)生菌的菌落土霉素產(chǎn)生菌的菌落土霉素產(chǎn)生菌不同菌落類型的形態(tài)及在不同培養(yǎng)基土霉素產(chǎn)生菌不同菌落類型的形態(tài)及在不同培養(yǎng)基中的效價中的效價2. 2. 出現(xiàn)不同菌落類型原因出現(xiàn)不同菌落類型原因 遺傳因素遺傳因素造成的菌落變化造成的菌落變化 非遺傳因素非遺傳因素造成的菌落變化：培養(yǎng)基組成；培養(yǎng)基造成的菌落變化：培養(yǎng)基組成；培養(yǎng)基來源與質量；平板厚度；菌落密度；菌的

4、不同的生長階來源與質量；平板厚度；菌落密度；菌的不同的生長階段。段。二、全面了解菌種特性及其與生產(chǎn)性能的關系二、全面了解菌種特性及其與生產(chǎn)性能的關系 考查生活史：考查生活史：如土霉素菌種原先要培養(yǎng)如土霉素菌種原先要培養(yǎng)12d12d其實是其實是包含了三代的生活周期。各代高產(chǎn)性能不同。包含了三代的生活周期。各代高產(chǎn)性能不同。 研究菌種的某些研究菌種的某些生物學特性生物學特性與與產(chǎn)量合成產(chǎn)量合成的相關性：的相關性：頂頭孢菌素頂頭孢菌素C C的產(chǎn)量，隨著其產(chǎn)生菌頂頭孢霉菌的節(jié)孢的產(chǎn)量，隨著其產(chǎn)生菌頂頭孢霉菌的節(jié)孢子體積增大或數(shù)量增加而提高。子體積增大或數(shù)量增加而提高。 考察考察菌落大小和顏色菌落大小和

5、顏色，如灰黃霉素產(chǎn)生菌，如灰黃霉素產(chǎn)生菌蕁麻青霉蕁麻青霉紫色素越深，灰黃霉素產(chǎn)率越低。紫色素越深，灰黃霉素產(chǎn)率越低。三、了解影響菌種生長發(fā)育的主要因素三、了解影響菌種生長發(fā)育的主要因素1 1、培養(yǎng)基的選擇、培養(yǎng)基的選擇2 2、培養(yǎng)基斜面制備技術、培養(yǎng)基斜面制備技術3 3、接種密度、接種密度4 4、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)溫度5 5、培養(yǎng)濕度、培養(yǎng)濕度6 6、試劑和原材料質量、試劑和原材料質量 如如刺孢小單孢菌刺孢小單孢菌產(chǎn)生的慶大霉素，其中的產(chǎn)生的慶大霉素，其中的C1是有效是有效的，的，C2是無效的，培養(yǎng)基中加入適量的磷和蛋白胨及加是無效的，培養(yǎng)基中加入適量的磷和蛋白胨及加大通風都有利于大通風都有利于C

6、1的合成，反之，的合成，反之，C2的比例就上升。的比例就上升。四、了解產(chǎn)物各組分與培養(yǎng)條件的關系四、了解產(chǎn)物各組分與培養(yǎng)條件的關系五、快速準確的檢測方法五、快速準確的檢測方法 建立一個適應于大規(guī)模篩選的有效檢測方法是減少建立一個適應于大規(guī)模篩選的有效檢測方法是減少誘變選育工作量的關鍵。誘變選育工作量的關鍵。分光光度法分光光度法液相色譜法液相色譜法氣相色譜法氣相色譜法薄層層析法薄層層析法化學滴定法化學滴定法六、最佳的菌種保藏方法六、最佳的菌種保藏方法 事先要建立一個最佳的培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件和適事先要建立一個最佳的培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件和適宜的保藏方法，否則將前功盡棄。宜的保藏方法，否則將前功盡棄。第二節(jié)

7、第二節(jié) 誘變育種的步驟與方法誘變育種的步驟與方法誘變育種的優(yōu)缺點誘變育種的優(yōu)缺點 優(yōu)點：優(yōu)點：方法簡單、投資少、收獲大；方法簡單、投資少、收獲大； 缺點：缺點：缺乏定向性。缺乏定向性。誘變育種的步驟和方法：誘變育種的步驟和方法： 出發(fā)菌株的選擇出發(fā)菌株的選擇單孢子菌懸液的制備單孢子菌懸液的制備誘變劑及誘變劑及誘變劑量的選擇誘變劑量的選擇誘變的處理方法誘變的處理方法純化分離等。純化分離等。一、出發(fā)菌株一、出發(fā)菌株1 1、對一般出發(fā)菌株的要求、對一般出發(fā)菌株的要求 用作出發(fā)菌株有用作出發(fā)菌株有：野生型菌株、生產(chǎn)菌株、具有利：野生型菌株、生產(chǎn)菌株、具有利性狀菌株、經(jīng)過誘變的菌株、增變菌株等。性狀菌株

8、、經(jīng)過誘變的菌株、增變菌株等。 一般要求生長快，營養(yǎng)要求粗放，產(chǎn)孢子多，對誘一般要求生長快，營養(yǎng)要求粗放，產(chǎn)孢子多，對誘變劑敏感性高，已能積累少量產(chǎn)品或前體物的菌株。變劑敏感性高，已能積累少量產(chǎn)品或前體物的菌株。2 2、選擇具有一定生產(chǎn)能力或某種特性的菌株、選擇具有一定生產(chǎn)能力或某種特性的菌株 選擇適于發(fā)酵設備條件的生產(chǎn)菌株便于推廣。選擇適于發(fā)酵設備條件的生產(chǎn)菌株便于推廣。3 3、選擇純種、選擇純種 單倍體、單核或少核。單倍體、單核或少核。4 4、菌株的穩(wěn)定性、菌株的穩(wěn)定性 挑選合成能力強，遺傳性狀穩(wěn)定的菌株。挑選合成能力強，遺傳性狀穩(wěn)定的菌株。5 5、連續(xù)誘變育種過程中出發(fā)菌株的選擇、連續(xù)誘

9、變育種過程中出發(fā)菌株的選擇 挑選每代誘變處理后具有一些表型改變的菌株。挑選每代誘變處理后具有一些表型改變的菌株。6 6、選擇出發(fā)菌株的其他因素、選擇出發(fā)菌株的其他因素 如孢子多、不產(chǎn)色素、生活能力強、生長速度快、糖氮利如孢子多、不產(chǎn)色素、生活能力強、生長速度快、糖氮利用快、耐消泡、粘度小等性狀的菌株。用快、耐消泡、粘度小等性狀的菌株。7 7、采用多出發(fā)菌株、采用多出發(fā)菌株 選擇選擇3-43-4株出發(fā)菌種同時誘變。株出發(fā)菌種同時誘變。8 8、了解菌種代謝特點、了解菌種代謝特點 了解菌種的代謝特點有助于選擇有效的出發(fā)菌株，如肌苷了解菌種的代謝特點有助于選擇有效的出發(fā)菌株，如肌苷酸產(chǎn)生菌。酸產(chǎn)生菌。

10、二、出發(fā)菌株的純化二、出發(fā)菌株的純化 菌種純化的方法：菌種純化的方法：1. 劃線分離法劃線分離法2. 稀釋分離法稀釋分離法3. 顯微鏡操縱器分離單孢子顯微鏡操縱器分離單孢子三、單孢子或單細胞懸液的制備三、單孢子或單細胞懸液的制備 制備菌懸液時要注意生理狀態(tài)、均一性、細胞制備菌懸液時要注意生理狀態(tài)、均一性、細胞濃度、菌懸液介質（生理鹽水或緩沖液）濃度、菌懸液介質（生理鹽水或緩沖液） 1 1、孢子或菌體要年輕、健壯、孢子或菌體要年輕、健壯 采用分散法制備，力求采用分散法制備，力求9090以上為單孢子。以上為單孢子。 菌懸液濃度用平板計數(shù)、血球計數(shù)器計數(shù)和光密菌懸液濃度用平板計數(shù)、血球計數(shù)器計數(shù)和光

11、密度法測定。菌懸液的濃度，要求霉菌孢子約為度法測定。菌懸液的濃度，要求霉菌孢子約為10106 6個個/mL/mL，放線菌的孢子濃度約為，放線菌的孢子濃度約為10106 6-10-107 7個個/mL/mL ，細菌的，細菌的細胞濃度為細胞濃度為10107 7- -10108 8個個/mL/mL。2 2、菌懸液制備方法、菌懸液制備方法 產(chǎn)孢子的菌類產(chǎn)孢子的菌類：放線菌，霉菌應處理：放線菌，霉菌應處理孢子孢子。放線。放線菌和霉菌的孢子要稍加萌發(fā)后使用。菌和霉菌的孢子要稍加萌發(fā)后使用。 細菌：細菌：生長指數(shù)期，最好在誘變處理前進行搖瓶生長指數(shù)期，最好在誘變處理前進行搖瓶振蕩預培養(yǎng)，盡可能獲得同步培養(yǎng)物

12、。振蕩預培養(yǎng)，盡可能獲得同步培養(yǎng)物。 某些不產(chǎn)孢子的真菌：某些不產(chǎn)孢子的真菌：菌絲體，最好采用年幼的菌絲體，最好采用年幼的菌絲體進行誘變處理。獲得的方法：菌絲體進行誘變處理。獲得的方法：菌絲尖端法、菌絲尖端法、處理單菌落周圍尖端菌絲法和混合處理法處理單菌落周圍尖端菌絲法和混合處理法。菌絲尖端法菌絲尖端法 枯草桿菌黑色變種芽孢菌懸液：枯草桿菌黑色變種芽孢菌懸液：試驗菌液用試驗菌液用2%2%蛋蛋白胨配成白胨配成3-43-410105 5個個/mL/mL濃度共濃度共50ml50ml。 金黃色葡萄球菌菌懸液：金黃色葡萄球菌菌懸液：為為2424小時普通瓊脂斜面小時普通瓊脂斜面培養(yǎng)物，用培養(yǎng)物，用5.5m

13、L5.5mL滅菌的滅菌的0.03M0.03M磷酸鹽緩沖液洗下來，磷酸鹽緩沖液洗下來，然后取然后取5mL5mL置于裝有置于裝有10mL10mL的的0.03M0.03M磷酸鹽緩沖液中，通磷酸鹽緩沖液中，通過比濁法將菌液用過比濁法將菌液用2%2%蛋白質配制成蛋白質配制成4-64-610105 5個個/mL/mL共共50ml50ml為試驗用。為試驗用。 3 3、制備原生質體作誘變劑、制備原生質體作誘變劑優(yōu)點：優(yōu)點：（1 1）異質體）異質體（絲狀真菌菌絲有不同分化程度）（絲狀真菌菌絲有不同分化程度）（2 2）無細胞壁的阻擋）無細胞壁的阻擋（細胞壁會吸收誘變因子能量，（細胞壁會吸收誘變因子能量，去壁菌對誘

14、變劑敏感）去壁菌對誘變劑敏感）（3 3）增強不產(chǎn)孢子的絲狀菌誘變效應）增強不產(chǎn)孢子的絲狀菌誘變效應四、誘變劑及誘變劑量四、誘變劑及誘變劑量（一）誘變劑種類的選擇（一）誘變劑種類的選擇 取決于誘變劑對基因作用的特異性和出發(fā)菌株的特性。取決于誘變劑對基因作用的特異性和出發(fā)菌株的特性。 產(chǎn)量由多基因決定，并且菌體自身也有產(chǎn)量由多基因決定，并且菌體自身也有修復能力修復能力。 因此，誘變劑的誘變作用，不僅取決于誘變劑的種類選因此，誘變劑的誘變作用，不僅取決于誘變劑的種類選擇，還取決于出發(fā)菌株的特性及其誘變史。擇，還取決于出發(fā)菌株的特性及其誘變史。1 1、誘變劑的選擇、誘變劑的選擇 作用機制、菌種特性。作

15、用機制、菌種特性。 紫外線（形成嘧啶二聚體），紫外線（形成嘧啶二聚體），5 5BUBU（在復制過（在復制過程中取代程中取代DNADNA分子上相同結構的堿基成分），亞硝酸分子上相同結構的堿基成分），亞硝酸（作用在嘌呤和嘧啶堿基上）（作用在嘌呤和嘧啶堿基上）2 2、根據(jù)菌種特性和遺傳穩(wěn)定性來選擇誘變劑、根據(jù)菌種特性和遺傳穩(wěn)定性來選擇誘變劑 遺傳穩(wěn)定的出發(fā)菌株：遺傳穩(wěn)定的出發(fā)菌株：強誘變劑強誘變劑 遺傳不穩(wěn)定的出發(fā)菌株：遺傳不穩(wěn)定的出發(fā)菌株：先純化，再用溫和誘變先純化，再用溫和誘變劑處理。劑處理。3 3、參考出發(fā)菌株原有的誘變系譜、參考出發(fā)菌株原有的誘變系譜敏感：敏感：有的菌株對某一種或某一組合誘變

16、因子敏感。有的菌株對某一種或某一組合誘變因子敏感。飽和現(xiàn)象：飽和現(xiàn)象：對誘變史很長的高產(chǎn)菌株來說，長期多對誘變史很長的高產(chǎn)菌株來說，長期多次用某一誘變因子會產(chǎn)生鈍化反應。次用某一誘變因子會產(chǎn)生鈍化反應。常規(guī)做法：常規(guī)做法：幾種誘變劑，各取不同劑量做一系列誘幾種誘變劑，各取不同劑量做一系列誘變實驗，篩菌，測定生產(chǎn)能力。變實驗，篩菌，測定生產(chǎn)能力。（二）最適誘變劑量的選擇（二）最適誘變劑量的選擇劑量：劑量：以以誘變劑濃度和處理時間誘變劑濃度和處理時間來表示。來表示。合適劑量：合適劑量：應該使所希望得到的突變株在存活群體中應該使所希望得到的突變株在存活群體中占有最大的比例。占有最大的比例。最適劑量：

17、最適劑量：能擴大變異幅度又能促使變異移向正向突能擴大變異幅度又能促使變異移向正向突變范圍的劑量。變范圍的劑量。0204060801001200102030405060Time of radiation (s)Lethal rate (%)紫外線致死率曲線紫外線致死率曲線急性效應：急性效應：高劑量率照射，短時間內達到較大劑高劑量率照射，短時間內達到較大劑量，效應迅速表現(xiàn)。量，效應迅速表現(xiàn)。慢性效應：慢性效應：低劑量率長期照射，隨著照射劑量增低劑量率長期照射，隨著照射劑量增加，效應逐漸積累，經(jīng)歷較長時間表加，效應逐漸積累，經(jīng)歷較長時間表現(xiàn)出來。現(xiàn)出來。劑量的大小常以致死率和變異率來確定。劑量的大小

18、常以致死率和變異率來確定。誘變劑對產(chǎn)量性狀的誘變作用趨勢：誘變劑對產(chǎn)量性狀的誘變作用趨勢： 處理劑量大，殺菌率高處理劑量大，殺菌率高，在單位存活細胞中負變菌，在單位存活細胞中負變菌株多，正變菌株少。株多，正變菌株少。 經(jīng)長期誘變的高產(chǎn)菌株，經(jīng)長期誘變的高產(chǎn)菌株，正突變率的高峰多出現(xiàn)正突變率的高峰多出現(xiàn)在低劑量區(qū)，負變率在高劑量時更高。在低劑量區(qū)，負變率在高劑量時更高。 誘變史短的低產(chǎn)菌株，誘變史短的低產(chǎn)菌株，正變株的高峰比負變株高正變株的高峰比負變株高得多，小劑量誘變處理時正突變株多。得多，小劑量誘變處理時正突變株多。誘變劑的劑量選擇經(jīng)驗誘變劑的劑量選擇經(jīng)驗u經(jīng)長期誘變的高產(chǎn)菌株：經(jīng)長期誘變的

19、高產(chǎn)菌株：低劑量處理。低劑量處理。u遺傳性狀不太穩(wěn)定的菌株：遺傳性狀不太穩(wěn)定的菌株：用較溫和的誘變劑和較用較溫和的誘變劑和較低的劑量處理。低的劑量處理。u要篩選具有特殊性狀或較大幅度提高產(chǎn)量的菌株：要篩選具有特殊性狀或較大幅度提高產(chǎn)量的菌株：可以用強誘變劑和高劑量處理。可以用強誘變劑和高劑量處理。u誘變史較短的野生低產(chǎn)菌株：誘變史較短的野生低產(chǎn)菌株：開始宜采用較高劑量，開始宜采用較高劑量，而后逐步用溫和誘變劑低劑量處理。而后逐步用溫和誘變劑低劑量處理。u多核細胞菌株：多核細胞菌株：較高劑量處理。較高劑量處理。誘變劑量的控制誘變劑量的控制1. 化學誘變劑：化學誘變劑：調節(jié)誘變劑的濃度、處理時間和

20、處理條調節(jié)誘變劑的濃度、處理時間和處理條件（溫度、件（溫度、pH值等）；值等）；2. 物理誘變劑：物理誘變劑：控制照射的距離、時間和照射過程中的控制照射的距離、時間和照射過程中的條件（氧氣、水分等）。條件（氧氣、水分等）。五、誘變劑的處理方式五、誘變劑的處理方式1. 1. 單因子處理單因子處理 使篩選工作簡單化，但突變率低，突變類型少。使篩選工作簡單化，但突變率低，突變類型少。2. 2. 復合因子處理復合因子處理 能導致較大的突變，適合遺傳性穩(wěn)定的純種及生活能導致較大的突變，適合遺傳性穩(wěn)定的純種及生活能力強的菌株處理。能力強的菌株處理。復合因子誘變的處理方式：復合因子誘變的處理方式：（1 1）

21、兩個以上因子同時處理；）兩個以上因子同時處理；（2 2）不同誘變劑交替處理；）不同誘變劑交替處理；（3 3）同一種誘變劑連續(xù)重復使用；）同一種誘變劑連續(xù)重復使用；（4 4）紫外線光復活交替處理。）紫外線光復活交替處理。3. 誘變處理的方式誘變處理的方式（1）菌體直接處理：）菌體直接處理：菌體有誘變劑接觸后再進行平板分菌體有誘變劑接觸后再進行平板分離。離。（2）平板處理：）平板處理：誘變劑加入到培養(yǎng)基中。誘變劑加入到培養(yǎng)基中。（3）搖瓶振蕩培養(yǎng)處理：）搖瓶振蕩培養(yǎng)處理：誘變劑加入到搖瓶培養(yǎng)基中。誘變劑加入到搖瓶培養(yǎng)基中。六、影響突變率的因素六、影響突變率的因素（一）菌種遺傳特性不同（一）菌種遺傳

22、特性不同 5-BU5-BU對靜止或休眠細胞不起作用；紫外線、電離對靜止或休眠細胞不起作用；紫外線、電離輻射、烷化基、亞硝酸等對分裂細胞和靜止孢子都有輻射、烷化基、亞硝酸等對分裂細胞和靜止孢子都有效。效。（二）細胞壁結構（二）細胞壁結構 絲狀菌孢子壁較厚，表面蠟質也會阻礙誘變劑滲入。絲狀菌孢子壁較厚，表面蠟質也會阻礙誘變劑滲入。或需用洗衣粉、脂肪酶、表面活性劑等處理去除蠟質。或需用洗衣粉、脂肪酶、表面活性劑等處理去除蠟質。（三）環(huán)境條件的影響（三）環(huán)境條件的影響1 1、誘變前預培養(yǎng)和誘變后培養(yǎng)、誘變前預培養(yǎng)和誘變后培養(yǎng)預培養(yǎng)：預培養(yǎng)：培養(yǎng)基中加入咖啡因、蛋白胨、酵母膏、培養(yǎng)基中加入咖啡因、蛋白胨

23、、酵母膏、吖啶黃、吖啶黃、b b重氮尿嘧啶、嘌呤等物質能提高突變率重氮尿嘧啶、嘌呤等物質能提高突變率。后培養(yǎng)：后培養(yǎng)：誘變后的菌懸液不直接分離于平板，而是誘變后的菌懸液不直接分離于平板，而是立即轉移到營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中培養(yǎng)數(shù)代。作用是立即轉移到營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中培養(yǎng)數(shù)代。作用是讓突變體重新調節(jié)代謝平衡，避免突變體讓突變體重新調節(jié)代謝平衡，避免突變體表型延遲表型延遲現(xiàn)象現(xiàn)象。2 2、溫度、溫度、pHpH、氧氣等外界條件對誘變效應的影響、氧氣等外界條件對誘變效應的影響 化學誘變因子化學誘變因子: T: T，速度，速度。 最適最適pHpH：避免誘變劑分解而失去誘變效應。：避免誘變劑分解而失去誘變效應

24、。 輻射因子、紫外線：輻射因子、紫外線：氧氣充足有利于突變發(fā)生。氧氣充足有利于突變發(fā)生。3 3、平皿密度效應、平皿密度效應 密度要適中，不能過密。密度要適中，不能過密。第三節(jié)第三節(jié) 突變株的分離與篩選突變株的分離與篩選隨機篩選：隨機篩選：過去采用，是盲目的選擇，效率低。過去采用，是盲目的選擇，效率低。定向篩選：定向篩選：現(xiàn)在，篩選效率高。現(xiàn)在，篩選效率高。 出發(fā)菌株出發(fā)菌株正突變型正突變型負突變型負突變型穩(wěn)定型穩(wěn)定型死亡死亡存活存活如何篩選？如何篩選？ 抗性突變株抗性突變株和和營養(yǎng)缺陷型突變株營養(yǎng)缺陷型突變株可用選擇性培養(yǎng)基篩可用選擇性培養(yǎng)基篩選，但選，但產(chǎn)量突變株產(chǎn)量突變株在表現(xiàn)上難以區(qū)分。

25、在表現(xiàn)上難以區(qū)分。 原因：原因：高產(chǎn)突變頻率低，產(chǎn)量提高幅度不大，高產(chǎn)突變頻率低，產(chǎn)量提高幅度不大，5% 15%，實驗誤差約有，實驗誤差約有10%左右。左右。 策略：策略：初篩（多）和復篩（精）初篩（多）和復篩（精）大多死亡大多死亡少數(shù)存活少數(shù)存活存活率存活率多數(shù)未變多數(shù)未變少數(shù)突變少數(shù)突變突變率突變率多數(shù)負變多數(shù)負變少數(shù)正變少數(shù)正變正變率正變率多數(shù)幅度小多數(shù)幅度小少數(shù)幅度大少數(shù)幅度大高產(chǎn)率高產(chǎn)率投產(chǎn)率投產(chǎn)率多數(shù)不宜投產(chǎn)多數(shù)不宜投產(chǎn)少數(shù)適宜投產(chǎn)少數(shù)適宜投產(chǎn)出發(fā)菌株出發(fā)菌株計算計算誘變誘變一、誘變育種的基本環(huán)節(jié)一、誘變育種的基本環(huán)節(jié)常規(guī)法：常規(guī)法：搖瓶搖瓶簡便法：簡便法：瓊脂塊法搖瓶瓊脂塊法搖瓶

26、二、篩選的程序二、篩選的程序第一輪：第一輪：一個出發(fā)菌株一個出發(fā)菌株選出選出200200個菌株個菌株選出選出5050株株選出選出3-53-5株株誘變處理誘變處理初篩初篩（每瓶一株）（每瓶一株）復篩復篩（每株（每株4 4瓶）瓶）第二輪：第二輪：4 4個出發(fā)菌株個出發(fā)菌株 選出選出5050株株 選出選出3-53-5株株100100株株100100株株100100株株100100株株誘變處理誘變處理初篩初篩復篩復篩（每瓶一株）（每瓶一株）（每株（每株4 4瓶）瓶）1. 常規(guī)篩選程序常規(guī)篩選程序2. 簡便篩選程序簡便篩選程序突變類型：突變類型：形態(tài)突變和生化突變形態(tài)突變和生化突變 高產(chǎn)突變株頻率低，實

27、驗誤差又在所難免，因而篩高產(chǎn)突變株頻率低，實驗誤差又在所難免，因而篩選工作常采用多級水平篩選，有利于獲得優(yōu)良菌株：選工作常采用多級水平篩選，有利于獲得優(yōu)良菌株：多級水平篩選：多級水平篩選： 平板篩選（平板篩選（5 51010，200200株）株） 搖瓶初篩（搖瓶初篩（25253030，5050株）株） 搖瓶復篩（搖瓶復篩（1 15 5，1 13 3株）株）三、分離與篩選的方法三、分離與篩選的方法（一）隨機篩選（一）隨機篩選 隨機挑選的平板菌落進行搖瓶隨機挑選的平板菌落進行搖瓶篩選。篩選。 優(yōu)點：優(yōu)點：與大生產(chǎn)條件相近。與大生產(chǎn)條件相近。 缺點：缺點：工作量大。工作量大。 如果突變頻率為如果突變

28、頻率為1%，那么要初，那么要初篩挑選的菌落起碼要篩挑選的菌落起碼要200個。個。（二）平板菌落預篩（二）平板菌落預篩 大量菌落經(jīng)過大量菌落經(jīng)過平板預篩平板預篩，可保留，可保留5 51010的初篩菌的初篩菌株，再進行搖瓶發(fā)酵復篩，復證被篩菌株的重演性。株，再進行搖瓶發(fā)酵復篩，復證被篩菌株的重演性。1 1、根據(jù)形態(tài)篩選突變株、根據(jù)形態(tài)篩選突變株 菌落形態(tài)變化菌落形態(tài)變化 紅霉素產(chǎn)生菌誘變后的突變株若帶紅霉素產(chǎn)生菌誘變后的突變株若帶色素色素則多為低產(chǎn)菌株；則多為低產(chǎn)菌株；產(chǎn)孢子菌株變異后產(chǎn)孢子菌株變異后不產(chǎn)孢子不產(chǎn)孢子也應棄選。也應棄選。 較高產(chǎn)量的出發(fā)菌株誘變后，較高產(chǎn)量的出發(fā)菌株誘變后，菌落形態(tài)

29、變化劇烈菌落形態(tài)變化劇烈的多是的多是負變株，高產(chǎn)突變株一般變化較小。負變株，高產(chǎn)突變株一般變化較小。2 2、根據(jù)平板菌落生化反應篩選變株、根據(jù)平板菌落生化反應篩選變株 通過瓊脂平板上的通過瓊脂平板上的透明圈、變色圈、抑菌圈透明圈、變色圈、抑菌圈生長生長圈等生化反應篩選。圈等生化反應篩選。3 3、采用冷敏感菌篩選抗生素變株、采用冷敏感菌篩選抗生素變株 低溫敏感菌變異株：低溫敏感菌變異株：冷敏菌在冷敏菌在2020不能生長，在不能生長，在3737最適，產(chǎn)抗生素放線菌可在最適，產(chǎn)抗生素放線菌可在2020生長。生長。 冷敏感菌和誘變菌孢子混合先冷敏感菌和誘變菌孢子混合先2020條件下培養(yǎng)，待條件下培養(yǎng)，

30、待產(chǎn)抗生素的放線菌長出后，轉移到產(chǎn)抗生素的放線菌長出后，轉移到3737的條件下培養(yǎng)，的條件下培養(yǎng)，冷敏菌迅速生長，抗生素產(chǎn)生菌菌落周圍因由抗生素而冷敏菌迅速生長，抗生素產(chǎn)生菌菌落周圍因由抗生素而不能生長，根據(jù)菌落直徑與抑菌圈直徑之比的有效值，不能生長，根據(jù)菌落直徑與抑菌圈直徑之比的有效值，可以直接篩選出抗生素的高產(chǎn)突變株。可以直接篩選出抗生素的高產(chǎn)突變株。4 4、濃度梯度法、濃度梯度法 合成抗生素的水平與其耐自身產(chǎn)物能力相關。合成抗生素的水平與其耐自身產(chǎn)物能力相關。5 5、應用復印技術快速篩選變株、應用復印技術快速篩選變株 產(chǎn)脂野生株、具有高脂含量的突變株。產(chǎn)脂野生株、具有高脂含量的突變株。

31、方法：方法：篩選培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)基 復印復印 蘇丹黑染色蘇丹黑染色洗去洗去多余染料多余染料酒精脫色酒精脫色干燥顯色干燥顯色選擇深藍色或紫選擇深藍色或紫色的菌落。色的菌落。6 6、瓊脂塊大通量篩選變株、瓊脂塊大通量篩選變株 適用對象：適用對象：抗生素、酶類產(chǎn)物。抗生素、酶類產(chǎn)物。 優(yōu)點：優(yōu)點：效率提高效率提高15-2015-20倍。倍。 缺點：缺點：產(chǎn)物濃度高時易漏篩，培養(yǎng)條件與發(fā)酵條件產(chǎn)物濃度高時易漏篩，培養(yǎng)條件與發(fā)酵條件差距大。差距大。 方法：瓊脂塊擴散圈方法：瓊脂塊擴散圈和和溶劑抽提法溶劑抽提法。 準確性：準確性：較直接分離在平皿上判斷活性法要準確。較直接分離在平皿上判斷活性法要準確。四、搖

32、瓶液體培養(yǎng)四、搖瓶液體培養(yǎng)優(yōu)點：優(yōu)點：通氣量足，溶氧好，培養(yǎng)條件接近于發(fā)酵罐。通氣量足，溶氧好，培養(yǎng)條件接近于發(fā)酵罐。缺點：缺點：工作量大，效率低，工作量大，效率低，方法：方法：初篩：一個菌株接種一個搖瓶；復篩：一個菌株接初篩：一個菌株接種一個搖瓶；復篩：一個菌株接種種3-53-5搖瓶。搖瓶。五、產(chǎn)物活性測定五、產(chǎn)物活性測定 常規(guī)檢測方法：常規(guī)檢測方法：如蛋白酶采用分光光度法；脂肪如蛋白酶采用分光光度法；脂肪酶采用酶采用NaOHNaOH滴定法，精確但繁瑣。滴定法，精確但繁瑣。 為了擴大篩選量，縮短每次處理的周期，提高篩為了擴大篩選量，縮短每次處理的周期，提高篩選速度提高，必須建立一個簡便、快速

33、、準確的測定選速度提高，必須建立一個簡便、快速、準確的測定方法。方法。1 1、瓊脂平板活性圈法、瓊脂平板活性圈法 活性圈的大小（瓊脂塊或抑菌圈水解圈）活性圈的大小（瓊脂塊或抑菌圈水解圈）2 2、紙片法、紙片法 發(fā)酵液濃度較高時，可將其置于濾紙片上，覆于發(fā)酵液濃度較高時，可將其置于濾紙片上，覆于含底物的平板上。含底物的平板上。3 3、瓊脂薄層紙片法、瓊脂薄層紙片法 孢子懸液與瓊脂混合傾倒至玻璃板制成薄層瓊脂孢子懸液與瓊脂混合傾倒至玻璃板制成薄層瓊脂板，待檢發(fā)酵液加到濾紙上覆于瓊脂薄板上，觀察孢板，待檢發(fā)酵液加到濾紙上覆于瓊脂薄板上，觀察孢子萌發(fā)情況。子萌發(fā)情況。 用于抗真菌抗生素、農業(yè)抗生素野生

34、菌。用于抗真菌抗生素、農業(yè)抗生素野生菌。六、搖瓶數(shù)據(jù)的調整和有關菌株特性的觀察分析六、搖瓶數(shù)據(jù)的調整和有關菌株特性的觀察分析 菌株產(chǎn)量檢測中的誤差來源：菌株產(chǎn)量檢測中的誤差來源：1. 搖瓶培養(yǎng)條件變化影響遺傳特性的表達。搖瓶培養(yǎng)條件變化影響遺傳特性的表達。2. 檢測過程中的誤差。檢測過程中的誤差。 對搖瓶發(fā)酵液測試數(shù)據(jù)要盡量應用生物統(tǒng)計方法來對搖瓶發(fā)酵液測試數(shù)據(jù)要盡量應用生物統(tǒng)計方法來處理，掌握數(shù)據(jù)的真實情況。處理，掌握數(shù)據(jù)的真實情況。 在分離篩選中，要始終密切觀察菌株的生長特性。在分離篩選中，要始終密切觀察菌株的生長特性。七、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的調整七、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的調整環(huán)境的選擇作用：環(huán)

35、境的選擇作用：表型表型= =環(huán)境環(huán)境+ +基因基因 當篩選到一個優(yōu)良的菌株時，要改變環(huán)境條件，當篩選到一個優(yōu)良的菌株時，要改變環(huán)境條件，即調整培養(yǎng)基的組成和培養(yǎng)條件，使突變株處于一個即調整培養(yǎng)基的組成和培養(yǎng)條件，使突變株處于一個適應的環(huán)境中得到充分表達的機會，使高產(chǎn)的性狀及適應的環(huán)境中得到充分表達的機會，使高產(chǎn)的性狀及其他優(yōu)良特性完全發(fā)揮出來。其他優(yōu)良特性完全發(fā)揮出來。八、變種的特性研究與鑒定八、變種的特性研究與鑒定考察菌株的生物學特性；考察菌株的生物學特性；考察菌株的發(fā)酵特性；考察菌株的發(fā)酵特性；考察菌株的產(chǎn)物的化學特性；考察菌株的產(chǎn)物的化學特性；4. 從分子水平上進一步考察其生理生化特性從

36、分子水平上進一步考察其生理生化特性5. 采用適宜的保藏方法，中試放大以及投產(chǎn)。采用適宜的保藏方法，中試放大以及投產(chǎn)。九、誘變育種實例九、誘變育種實例（一）堿性脂肪酶高產(chǎn)變株（一）堿性脂肪酶高產(chǎn)變株FS1884FS1884的選育的選育1.1.原生質體作為誘變材料原生質體作為誘變材料2.2.采用定向控制的理性篩選抗阻遏和解除反饋抑制篩采用定向控制的理性篩選抗阻遏和解除反饋抑制篩選模型選模型3.3.初篩采用大通量的瓊脂塊法初篩采用大通量的瓊脂塊法4.4.結合飾變育種結合飾變育種（二）灰黃霉素耐前體變株（二）灰黃霉素耐前體變株D-756D-756的育種的育種（1 1）培養(yǎng)基：用大米代替乳糖和玉米粉）培

37、養(yǎng)基：用大米代替乳糖和玉米粉（2 2）誘變劑篩選：紫外線氯化鋰）誘變劑篩選：紫外線氯化鋰（3 3）挑菌標準：淺色菌絲）挑菌標準：淺色菌絲第四節(jié)第四節(jié) 營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選營養(yǎng)缺陷型菌株的篩選u野生型菌株：野生型菌株：從自然界分離到的未經(jīng)誘變的原始菌株。從自然界分離到的未經(jīng)誘變的原始菌株。u營養(yǎng)缺陷型：營養(yǎng)缺陷型：野生型菌株經(jīng)過人工誘變或自然突變失去野生型菌株經(jīng)過人工誘變或自然突變失去合成某種營養(yǎng)（氨基酸、維生素、核酸等）的能力，只合成某種營養(yǎng)（氨基酸、維生素、核酸等）的能力，只有在基本培養(yǎng)基中補充所缺乏的營養(yǎng)因子才能生長。有在基本培養(yǎng)基中補充所缺乏的營養(yǎng)因子才能生長。u原養(yǎng)型：原養(yǎng)型：營養(yǎng)缺陷

38、型菌株經(jīng)回復突變或重組變異后產(chǎn)生營養(yǎng)缺陷型菌株經(jīng)回復突變或重組變異后產(chǎn)生的菌株，其營養(yǎng)要求在表型上與野生型相同。的菌株，其營養(yǎng)要求在表型上與野生型相同。相關培養(yǎng)基相關培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基(MM) -(MM) -完全培養(yǎng)基完全培養(yǎng)基(CM) +(CM) +補充培養(yǎng)基補充培養(yǎng)基(SM) A(SM) A、BB三類遺傳型三類遺傳型野生型野生型 AA+ +B B+ + 營養(yǎng)缺陷型型營養(yǎng)缺陷型型 AA+ +B B- - 原養(yǎng)型原養(yǎng)型 AA+ +B B+ + 一、營養(yǎng)缺陷型菌株的分離和篩選一、營養(yǎng)缺陷型菌株的分離和篩選 一般包括一般包括誘發(fā)突變、淘汰野生型菌株、檢出缺陷型、誘發(fā)突變、淘汰野生型菌株、檢

39、出缺陷型、鑒別缺陷種類鑒別缺陷種類。（一）營養(yǎng)缺陷型的誘發(fā)（一）營養(yǎng)缺陷型的誘發(fā) 突變類型：突變類型：單一基因突變單一基因突變 誘變劑：誘變劑：亞硝基胍、紫外線、亞硝酸亞硝基胍、紫外線、亞硝酸（二）淘汰野生型菌株（二）淘汰野生型菌株抗生素法：抗生素法：菌絲過濾法菌絲過濾法3. 高溫殺菌法：高溫殺菌法：1. 抗生素富集法抗生素富集法完全培養(yǎng)基后培養(yǎng)完全培養(yǎng)基后培養(yǎng)基本培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)基本培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)基本培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基+抗生素抗生素培養(yǎng)培養(yǎng)平板分離平板分離2. 菌絲過濾法菌絲過濾法 真菌和放線菌的野生孢子在基本培養(yǎng)基中能萌發(fā)生真菌和放線菌的野生孢子在基本培養(yǎng)基中能萌發(fā)生長成菌絲，而營養(yǎng)缺陷型的孢

40、子不能萌發(fā)，經(jīng)過過濾，長成菌絲，而營養(yǎng)缺陷型的孢子不能萌發(fā)，經(jīng)過過濾，除去野生型。除去野生型。3. 高溫殺菌法高溫殺菌法 利用芽孢菌類的芽孢和營養(yǎng)細胞對熱敏感性的差異，利用芽孢菌類的芽孢和營養(yǎng)細胞對熱敏感性的差異，讓誘變后的細菌形成芽孢，然后把處在芽孢階段的細菌讓誘變后的細菌形成芽孢，然后把處在芽孢階段的細菌轉移到基本培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后野生型芽孢萌發(fā)，而營養(yǎng)轉移到基本培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后野生型芽孢萌發(fā)，而營養(yǎng)缺陷型芽孢不萌發(fā)。缺陷型芽孢不萌發(fā)。（三）營養(yǎng)缺陷型的檢出（三）營養(yǎng)缺陷型的檢出 1. 1. 點植對照法點植對照法 2. 2. 影印法影印法 3. 3. 夾層法夾層法 4. 4. 限量補充培養(yǎng)法

41、限量補充培養(yǎng)法1. 點植對照法點植對照法2. 影印法影印法MM CM3. 夾層法夾層法4. 4. 限量補充培養(yǎng)法限量補充培養(yǎng)法 就是在分離平板培養(yǎng)基就是在分離平板培養(yǎng)基中限量添加缺陷型菌株所中限量添加缺陷型菌株所需要的營養(yǎng)物質，菌落生需要的營養(yǎng)物質，菌落生長后，野生型菌落大，而長后，野生型菌落大，而缺陷型的菌落小。如培養(yǎng)缺陷型的菌落小。如培養(yǎng)基中添加基中添加0.01%的蛋白胨的蛋白胨或其他某種單一的氨基酸、或其他某種單一的氨基酸、維生素或堿基等。維生素或堿基等。（四）營養(yǎng)缺陷型的鑒定（四）營養(yǎng)缺陷型的鑒定 確定菌株屬于哪一類營養(yǎng)缺陷型或缺哪一種營養(yǎng)因子確定菌株屬于哪一類營養(yǎng)缺陷型或缺哪一種營養(yǎng)

42、因子. .1 1、鑒定方法、鑒定方法 （1 1）一種營養(yǎng)因子，多株菌；）一種營養(yǎng)因子，多株菌； （2 2）一個菌株，多種營養(yǎng)因子（生長譜法）。）一個菌株，多種營養(yǎng)因子（生長譜法）。2 2、鑒定步驟、鑒定步驟 測定缺陷型菌株所需生長因子的測定缺陷型菌株所需生長因子的類別類別 具體測缺陷具體測缺陷該類別物質中的該類別物質中的哪種因子哪種因子 用單一生長因子用單一生長因子復證復證試驗試驗（1 1）缺陷型類別的測定）缺陷型類別的測定 氨基酸混合物、酪素水解物或蛋白胨氨基酸混合物、酪素水解物或蛋白胨：氨基酸：氨基酸； 酵母浸出液：酵母浸出液：氨基酸、維生素、堿基混合物氨基酸、維生素、堿基混合物； 維生素

43、混合物維生素混合物：維生素：維生素； 核酸堿基混合液或酵母核酸水解物核酸堿基混合液或酵母核酸水解物：堿基：堿基。營養(yǎng)缺陷型類別測定營養(yǎng)缺陷型類別測定氨基酸氨基酸+維生素缺陷型維生素缺陷型氨基酸缺陷型氨基酸缺陷型嘌呤嘧啶缺陷型嘌呤嘧啶缺陷型 酪素水解物；酪素水解物； 酵母浸出液；酵母浸出液； 維生素混合物；維生素混合物； 核酸堿基混合液或酵母核酸水解物。核酸堿基混合液或酵母核酸水解物。（2 2）缺陷型所需生長因子的測定）缺陷型所需生長因子的測定 分組測定法，提高測定效率。分組測定法，提高測定效率。二、營養(yǎng)缺陷型突變株的應用二、營養(yǎng)缺陷型突變株的應用1. 工業(yè)育種：工業(yè)育種：協(xié)助解除代謝反饋調控機

44、制，從而達到大協(xié)助解除代謝反饋調控機制，從而達到大量累積產(chǎn)物的目的，如氨基酸的發(fā)酵。量累積產(chǎn)物的目的，如氨基酸的發(fā)酵。2. 遺傳標記遺傳標記：菌種雜交、重組育種時作為遺傳標記。：菌種雜交、重組育種時作為遺傳標記。第五節(jié)第五節(jié) 溫敏突變株的篩選溫敏突變株的篩選一、特性一、特性 TSTS突變株：突變株：對溫度敏感的條件致死突變。對溫度敏感的條件致死突變。 突變類型：突變類型：錯義突變：錯義突變： 生化特性：生化特性：酶活力受溫度控制，酶活力受溫度控制，二、溫敏突變株的篩選方法二、溫敏突變株的篩選方法（一）溫敏突變株的誘發(fā)（一）溫敏突變株的誘發(fā) 誘變劑：誘變劑：亞硝基類、磺酸酯類、亞硝酸、紫外線等，

45、亞硝基類、磺酸酯類、亞硝酸、紫外線等，誘變處理的方法同常規(guī)育種基本相同。誘變處理的方法同常規(guī)育種基本相同。 突變頻率僅有突變頻率僅有0.01%左右。左右。（二）富集（二）富集1 1、抗生素法：、抗生素法：非許可溫度下，抗生素殺死野生菌。非許可溫度下，抗生素殺死野生菌。2 2、物理方法、物理方法：過濾或離心法。：過濾或離心法。3 3、H3(H3(氚氚)-)-前體法：前體法： 例如篩選例如篩選RNARNA合成缺損的合成缺損的TSTS突變株，在誘變后用突變株，在誘變后用菌體在非許可的溫度下培養(yǎng)，并且加入放射性同位素菌體在非許可的溫度下培養(yǎng)，并且加入放射性同位素H3H3，TSTS菌株不生長，野生型菌株

46、生長并吸收菌株不生長，野生型菌株生長并吸收H3H3而死亡。而死亡。（三）分離篩選（三）分離篩選1 1、常規(guī)法：、常規(guī)法：影印到影印到CMCM和和MMMM，適溫和非許可溫，適溫和非許可溫度下培養(yǎng)度下培養(yǎng)2. 特殊分離篩選方法特殊分離篩選方法 根據(jù)發(fā)酵產(chǎn)品需要，靈活地設計富集方法和平板培養(yǎng)根據(jù)發(fā)酵產(chǎn)品需要，靈活地設計富集方法和平板培養(yǎng)基組成，可以獲得具有特定性能的基組成，可以獲得具有特定性能的TS突變株。突變株。三、溫敏突變株在發(fā)酵工業(yè)中的應用三、溫敏突變株在發(fā)酵工業(yè)中的應用1 1、在谷氨酸的發(fā)酵中的應用、在谷氨酸的發(fā)酵中的應用 篩選細胞膜結構或功能缺損的篩選細胞膜結構或功能缺損的TSTS菌株，通

47、過調節(jié)溫度菌株，通過調節(jié)溫度來控制細胞膜透性。來控制細胞膜透性。2 2、在絲氨酸的發(fā)酵中的應用、在絲氨酸的發(fā)酵中的應用 甲醇代謝缺損兼溫敏株，在許可溫度下絲氨酸酶具有甲醇代謝缺損兼溫敏株，在許可溫度下絲氨酸酶具有正常的降解活力，能利用甲醇生長，非許可溫度下，絲氨正常的降解活力，能利用甲醇生長，非許可溫度下，絲氨酸酶失去降解作用，因而細胞大量分泌絲氨酸。酸酶失去降解作用，因而細胞大量分泌絲氨酸。3 3、微生物單細胞蛋白的生產(chǎn)、微生物單細胞蛋白的生產(chǎn) 篩選溫敏突變株，可在非許可溫度下沉降或自溶。篩選溫敏突變株，可在非許可溫度下沉降或自溶。第六節(jié)第六節(jié) 抗噬菌體菌株的選育抗噬菌體菌株的選育噬菌體噬菌

48、體一、烈性噬菌體及其效價的測定一、烈性噬菌體及其效價的測定1 1、重層瓊脂法：、重層瓊脂法：彌補平皿底面不平，使噬菌斑較大。彌補平皿底面不平，使噬菌斑較大。2 2、單層平板法：、單層平板法：只求驗證是否存在噬菌體，不求計數(shù)。只求驗證是否存在噬菌體，不求計數(shù)。3 3、快速測定法：、快速測定法：低濃度瓊脂，借助放大設備，適合工業(yè)低濃度瓊脂，借助放大設備，適合工業(yè)發(fā)酵中早期檢測。發(fā)酵中早期檢測。4 4、斑點試驗法：、斑點試驗法：將宿主菌涂布平板，不同稀釋度待測試將宿主菌涂布平板，不同稀釋度待測試樣點于平板，培養(yǎng)后，根據(jù)噬菌斑形成與否判斷噬菌樣點于平板，培養(yǎng)后，根據(jù)噬菌斑形成與否判斷噬菌體效價。體效價

49、。二、溫和性噬菌體及溶源菌二、溫和性噬菌體及溶源菌溫和性噬菌體：溫和性噬菌體：能導致溶源性反應噬菌體。能導致溶源性反應噬菌體。狀態(tài)狀態(tài)：a、胞外游離的病毒粒子。、胞外游離的病毒粒子。 b、原噬菌體（、原噬菌體（prophage)： 即整合在宿主即整合在宿主DNA上的或附著在宿主上的或附著在宿主 細胞內的細胞內的pDNA。 c、營養(yǎng)期的噬菌體，可產(chǎn)生噬菌體、營養(yǎng)期的噬菌體，可產(chǎn)生噬菌體DNA 和蛋白質。和蛋白質。三、抗噬菌體菌株的選育三、抗噬菌體菌株的選育1 1、專一性噬菌體獲得和純化、專一性噬菌體獲得和純化2 2、高效價噬菌體原液的制備、高效價噬菌體原液的制備3 3、噬菌體原液效價測定、噬菌體

50、原液效價測定4 4、菌株誘發(fā)突變和分離、菌株誘發(fā)突變和分離5 5、液體搖瓶振蕩培養(yǎng)、液體搖瓶振蕩培養(yǎng)6 6、抗性菌株對周圍環(huán)境中存在的各種噬菌體的抗性、抗性菌株對周圍環(huán)境中存在的各種噬菌體的抗性四、抗性菌株的特性研究四、抗性菌株的特性研究1 1、抗性菌株穩(wěn)定性試驗、抗性菌株穩(wěn)定性試驗2 2、抗性菌株的產(chǎn)量性能、抗性菌株的產(chǎn)量性能五、抗噬菌體菌株選育的實例五、抗噬菌體菌株選育的實例1 1、菌種、菌種2 2、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)基成分3 3、噬菌體的分離純化和原液制備、噬菌體的分離純化和原液制備4 4、噬菌體菌株的選育、噬菌體菌株的選育5 5、菌株抗噬菌體性能的檢驗、菌株抗噬菌體性能的檢驗6 6、搖瓶

51、發(fā)酵試驗、搖瓶發(fā)酵試驗7 7、發(fā)酵罐發(fā)酵試驗、發(fā)酵罐發(fā)酵試驗第七章第七章 微生物發(fā)酵過程優(yōu)化的方法微生物發(fā)酵過程優(yōu)化的方法選育或構建一株優(yōu)良菌株僅僅是一個開始，要使優(yōu)良菌株的選育或構建一株優(yōu)良菌株僅僅是一個開始，要使優(yōu)良菌株的潛力充分發(fā)揮出來，還必須優(yōu)化其發(fā)酵過程，以獲得較高的產(chǎn)潛力充分發(fā)揮出來，還必須優(yōu)化其發(fā)酵過程，以獲得較高的產(chǎn)物濃度物濃度(便于下游處理便于下游處理)、較高的底物轉化率、較高的底物轉化率(降低原料成本降低原料成本)和較和較高的生產(chǎn)強度高的生產(chǎn)強度(縮短發(fā)酵周期縮短發(fā)酵周期) 。發(fā)酵過程優(yōu)化的目標發(fā)酵過程優(yōu)化的目標使細胞生理調節(jié)、細胞環(huán)境、反應器特性、工藝操作條件與使細胞生理

52、調節(jié)、細胞環(huán)境、反應器特性、工藝操作條件與反應器控制之間這種復雜的相互作用盡可能地簡化，并對這些反應器控制之間這種復雜的相互作用盡可能地簡化，并對這些條件和相互關系進行優(yōu)化，使之最適于特定發(fā)酵過程的進行。條件和相互關系進行優(yōu)化，使之最適于特定發(fā)酵過程的進行。一、單因素實驗一、單因素實驗1、定義、定義 實驗中只有一個影響因素，或雖有多個影響因素，在安實驗中只有一個影響因素，或雖有多個影響因素，在安排實驗時，只考慮一個對指標影響最大的因素，其它因素盡排實驗時，只考慮一個對指標影響最大的因素，其它因素盡量保持不變的實驗，即為量保持不變的實驗，即為單因素實驗單因素實驗。2、步驟、步驟 1）確定試驗因素

53、的取值范圍）確定試驗因素的取值范圍 x：實驗點：實驗點 axb 2）確定指標）確定指標 3）根據(jù)實際情況及實驗要求，選擇實驗方法，科學安排）根據(jù)實際情況及實驗要求，選擇實驗方法，科學安排實驗點實驗點單因素實驗的缺陷單因素實驗的缺陷單因素試驗法是以因素間沒有交互作用為前提，對單因素試驗法是以因素間沒有交互作用為前提，對于大多數(shù)培養(yǎng)基組成而言，這種假設往往不成立，采用于大多數(shù)培養(yǎng)基組成而言，這種假設往往不成立，采用該法可能導致錯誤的結論。如果考查多因素的影響，按該法可能導致錯誤的結論。如果考查多因素的影響，按單因素去進行實驗，就需要很長的時間和大量的勞動，單因素去進行實驗，就需要很長的時間和大量的

54、勞動，本課程介紹本課程介紹2種實驗設計方法。種實驗設計方法。 二、正交試驗二、正交試驗 在生產(chǎn)實踐中，試制新產(chǎn)品、改革工藝、尋求好的在生產(chǎn)實踐中，試制新產(chǎn)品、改革工藝、尋求好的生產(chǎn)條件等，這些都需要做試驗，而試驗總是要花費時生產(chǎn)條件等，這些都需要做試驗，而試驗總是要花費時間，消耗人力、物力。因此，試驗的次數(shù)應盡可能少。間，消耗人力、物力。因此，試驗的次數(shù)應盡可能少。 全面試驗：全面試驗： 如如 4 個個 3 水平的因素，要做水平的因素，要做 3481 次試驗；次試驗； 6個個5 水平的因素，要做水平的因素，要做 5615625次試驗。非常困難。次試驗。非常困難。 能否減少試驗次數(shù)，而又不影響試

55、驗效果呢？能否減少試驗次數(shù)，而又不影響試驗效果呢？因素與水平表因素與水平表 因素因素水平水平因素因素1因素因素2因素因素3因素因素41-1-1-1-1200003+1+1+1+1 正交表記為正交表記為 Ln（mk），），m是各因素的水平，是各因素的水平，k （列數(shù)）是因素列數(shù)）是因素的個數(shù)，的個數(shù)，n 是安排試驗的次數(shù)（行數(shù)）。是安排試驗的次數(shù)（行數(shù)）。 L9（34）4因素因素3水平正交試驗，共做水平正交試驗，共做9次試驗，而全面試驗要次試驗，而全面試驗要做做 34=81 次，減少了次，減少了72次。次。 L25（56） 6因素因素5水平正交試驗，共做水平正交試驗，共做25次試驗，而全面試驗次

56、試驗，而全面試驗要做要做 56=15625 次，減少了次，減少了15600次。次。1. 正交表及其用法正交表及其用法 正交表的記號：正交表的記號：L9（34）表示表示 4 個因素，每個因素取個因素，每個因素取 3 個個水平的正交表。水平的正交表。L9（34）正交表）正交表 因素因素水平水平因素因素1因素因素2因素因素3因素因素4123 列號列號試驗號試驗號1234111112122231333421235223162312731328321393321L9（34）正交試驗方案）正交試驗方案2. 正交試驗的設計方案正交試驗的設計方案（1）確定試驗的因素和各因素的水平）確定試驗的因素和各因素的水平

57、 因素因素水平水平木糖（）木糖（）KNO3（）（）ATC（）（）初始初始pH10.50.30.46.5210.40.57.0320.50.67.53. 實施試驗方案實施試驗方案4. 結果分析結果分析三、響應面設計三、響應面設計 響應面方法（響應面方法（Response Surface Analysis，簡，簡稱稱RSA）是利用合理的試驗設計并通過實驗得到的一）是利用合理的試驗設計并通過實驗得到的一定數(shù)據(jù)，采用定數(shù)據(jù)，采用多元二次回歸方程多元二次回歸方程來擬合因素與響應值來擬合因素與響應值之間的函數(shù)關系，通過對回歸方程的分析來尋求最優(yōu)之間的函數(shù)關系，通過對回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多

58、變量問題的一種統(tǒng)計方法。工藝參數(shù)，解決多變量問題的一種統(tǒng)計方法。 Y=C1+C2X1+C3X2+C4X3-C5X12-C6X1X2+C7X1X3-C8X22+C9X2X3-C10X32 響應面方法響應面方法它可用在以下它可用在以下3個方面：個方面： 描述單個試驗變量對響應值的影響；描述單個試驗變量對響應值的影響； 確定試驗變量之間的相關關系；確定試驗變量之間的相關關系； 描述所有試驗變量對響應值的綜合影響。描述所有試驗變量對響應值的綜合影響。1. RSA的步驟的步驟 (1) 確定因素確定因素 ：就是研究范圍內主要影響加工過程和就是研究范圍內主要影響加工過程和產(chǎn)品質量的重要因素。當然假設實驗者已經(jīng)知道這產(chǎn)品質量的重要因素。當然假設實驗者已經(jīng)知道這些因素是什么。些因素是什么。 (2