1、生物化學大實驗第一部分 蛋白質提取、純化及分析技術 實驗一 多酚氧化酶（PPO）的分離提取一、原理與目的多酚氧化酶（有3類，兒茶酚酶、戚酶、甲苯酚酶），它是植物組織內廣泛存在的一種含銅氧化酶，位于質體、微體內，可參與植物生長、分化和種皮透性的調節，屬于末端氧化酶的一種。植物受到機械損傷和病菌侵染后，PPO催化酚與O2氧化形成為醌，使組織形成褐變，以便損傷恢復，防止或減少感染，提高抗病能力。多酚氧化酶的活性與植物抗病有一定聯系，植物免疫機理現在認為主要是產生對病源有害物質。已發現具有免疫作用的有害物質是多種多樣的，概括為兩種類型，其中的一種類型就是原有的有毒物質，植物本身含有的一些對病菌有抑制作

2、用，使病菌無法在寄主中生長。很早就發現酚類化合物與抗病有明顯的相關，例如原兒茶酸與兒茶酚對有色洋蔥磷莖炭疽病菌的抑制作用。多酚氧化酶也可與細胞內其他底物氧化相偶聯，起到末端氧化酶的作用： 氧化底物 NADHH+ 醌 H2O 底物 NAD+ 酚 1/2 O2 但是PPO的存在是水果、蔬菜褐變的主要原因之一，影響一些經濟植物產品的質量。因此，許多學者對此進行研究，并從一些植物組織中分離純化這種酶，研究酶的理化性質和生化特性。多酚氧化酶活性高低也是馬鈴薯解除休眠的指標之一。本實驗將采用馬鈴薯為主要材料，通過細胞組織破碎勻漿、過濾、離心、硫酸銨沉淀、透析等步驟獲得PPO的粗酶液。通過本項實驗，學習和了

3、解蛋白質的提取、分離的基本原理和方法，掌握相關儀器設備的操作使用，以及蛋白質的提取、分離的系統技術。二、材料與試劑（1）馬鈴薯（大約每小組150-200g）（2）試劑：0.03M磷酸緩沖液PH6.0(內含0.02m巰基乙醇，0.001m EDTA，5%甘油，1%的聚乙烯吡咯烷酮)配制時配×10倍的濃縮液1000ml；固體硫酸銨；0.03M磷酸緩沖液PH6.0（內含0.02m巰基乙醇，0.001m EDTA，0.005m MgCL2）配置時配。（3）實驗器械與儀器設備：試管與試管架；燒杯、玻璃攪棒；移液管、滴管等；試劑瓶；透析袋；過濾紗布；植物組織勻漿器；PH計和PH試紙；GL-20C

4、高速冷凍離心機；DL-7A大容量低速冷凍離心機三、操作步驟1粗酶提取： 馬鈴薯組織按1：1（W/V）比例與0.03m磷酸緩沖液PH6.0（內含0.02M巰基乙醇，0.001m EDTA，5%甘油，1%聚乙烯吡咯烷酮）混合，勻漿4層后紗布過濾，濾液以6000rpm離心10min，棄除沉淀獲得酶提取液。2鹽析分級沉淀： 在酶提取液中加入固體硫酸銨使其達到40%飽和度（邊加邊攪拌達到充分溶解），然后6000rpm離心20min棄除沉淀；離心上清液在加入固體硫酸銨達到70%飽和度（邊加邊攪拌達到充分溶解），再以6000rpm離心20min，棄除上清夜，收集粗酶沉淀。沉淀用0.03M磷酸緩沖液PH6.0

5、（內含0.02巰基乙醇，0.001M EDTA，0.005M MgCL2）溶解，裝入透析袋中用0.02N KCL溶液透析至無硫酸銨根離子，獲得粗酶液供上柱使用。四、實驗結果獲得PPO粗酶液供上柱使用。實驗二 胰酶分離提取一、原理與目的胰酶是醫藥、食品、飼料等工業上重要的酶制劑，胰酶的分離提取時普通生物化學實驗的最主要、最經典的實驗。胰蛋白酶結晶最初以牛的胰臟為材料而制備，現用羊、豬、馬、鼠等哺乳動物的胰臟亦可制備結晶。所不同的是，在提取制備的過程中所需的pH值、PI和結晶的構型上有區別。提取制備酶的經典方法，多采用硫酸銨分級沉淀，胰酶在75%飽和度硫酸銨中沉淀，其它雜蛋白一般在10%硫酸銨飽和

6、度下被沉淀而除去。經此多次提取，最后在PH8.0硼酸緩沖液中得到結晶。胰酶在PH3.0時最穩定，可在低溫下儲存較長的時間而不失活；低與此PH酶易變性；高于PH5時，酶易自溶而失活。因此提取制備胰酶的全部操作過程應在低溫和低PH下進行。胰酶以無活性的酶原形式存在于動物的胰臟中。胰蛋白酶原在正常生理條件下可被腸激酶和鈣離子所激活或自我環化成為有活性的酶。豬胰蛋白酶原分子量約2400025000，而豬胰酶分子量為23400。在酶原活化的過程中，酶原N端Lys與Ile之間的 一個肽鏈被斷裂，丟失一個6肽，分子構象發生改變，PI變成10.8。本實驗擬通過從豬胰臟中制備胰酶結晶實驗，掌握酶的制備、一般分離

7、、提取、純化和結晶的操作技術。同時為親和層析、免疫學實驗準備實驗樣品。 二、材料與試劑1儀器紫外光分光光度計、恒溫水浴、離心機、組織搗碎機、PH計、顯微鏡、秒表、剪刀、鑷子、搪瓷盆、乳缽、大玻璃漏斗、抽濾瓶，塑料小桶、紗布、PH試紙，濾紙、玻璃器皿等。2材料：新鮮豬胰臟3試劑及溶液配制pH2.5乙酸酸化水、2.5M H2SO4溶液、2M.NaOH溶液、5M NaOH溶液、01M HCL溶液、0.025M HCL溶液、0.01M HCL溶液、0.4M pH9.0硼酸緩沖液（母液為0.8M，用時稀釋一倍）、Tris、硫酸銨。0.8M pH9.0硼酸緩沖液：取20ml0.8M四硼酸鈉溶液，混合后用P

8、H計校正。三、操作步驟（1）新鮮豬胰臟一個，在冰浴下剝除脂肪和結締組織，低溫下用絞肉機絞碎，加入1-2倍體積預冷的pH2.5-3.0乙酸酸化水溶液（100ml）提取。用10%乙酸調節pH在3.0以下，冷室5提取20h。胰蛋白酶提取關鍵：控制低溫；控制pH低于3.0，維持胰蛋白酶提取過程中的穩定。操作過程中的問題：乙酸調節酸度不穩定。（2）過夜后粗提取物四層紗布過濾，濾液呈乳白色，濾渣再加入50ml乙酸溶液浸提殘渣，浸提2h。合并濾液。（3）浸提液離心，取上層黃綠色清液，加固體粉狀硫酸銨，至40飽和度， 鹽析1hr。（4）冷置后離心12000rpm 離心 10min，得胰蛋白酶粗制品。（5）上清

9、液加硫酸銨，至75飽和度 鹽析1hr；12000rpm 離心 10min； 沉淀 溶于10ml pH7.5, 0.1M Tris 透析過夜，4 保存。四、實驗結果獲得胰酶粗提液。實驗三 卵清蛋白分離提取一、原理與目的雞卵粘蛋白存在于雞蛋清中，對胰蛋白酶有強烈的抑制作用，高純度的雞卵粘蛋白抑制胰蛋白酶的分子比為1:1.雞卵粘蛋白是糖蛋白，分子量為28000，但糖成份上有差別。有四種不同的組份，PI的范圍為3.9-4.5,280nm的消光系數為A=4.13（1%，1cm）。雞卵粘蛋白在中性或酸性溶液中對熱和高濃度的脲都是相當穩定的，而在堿性溶液中較不穩定。由于雞卵粘蛋白對胰蛋白酶有強烈的抑制作用，

10、因此可以用雞卵粘蛋白作為親和配基制備純化胰酶的親和柱。二、材料與試劑：1材料：新鮮雞蛋2只2：儀器：抽濾瓶5001000ml、燒結漏斗、移液器、磁力攪拌器3：試劑：10TCA，用固體NaOH調調PH至1.051.10，需要50ml、5N HCL、5N NaOH、冷丙酮、胰蛋白酶液、BAEE-0.05M，PH8.0Tris-HCL緩沖液（每ml含0.34BAEE和2.22mgCaCL2），50ml ；pH8.0,0.1M Tris-HCL緩沖液三、操作步驟（1）新鮮雞蛋兩枚取蛋清50ml于燒杯中。25外用熱水浴中緩慢加入50ml三氯乙酸-丙酮（V/V1:2）, 再繼續攪拌30min。4靜置過夜操

11、作關鍵：要在熱水浴中緩慢加入有機溶劑，不可在熱水浴之前加入；取蛋清時注意不能混入蛋黃，否則引入雜蛋白。（2）粗提取物于50ml離心管10000g離心10min，取上清液50ml，加入4預冷的丙酮200 ml，4放置2h。（3）放置后取沉淀離心10000 rpm離心5 min，收集沉淀加沉淀溶于10 ml無離子水中，對無離子水（50倍）透析4 h，換水兩次。收集沉淀，再對碳酸鈉緩沖溶液透析過夜。（4）透析液離心4000g 10min ，取上層清液，加蒸餾水至35ml，用于親和柱層析。四、實驗結果得到卵清蛋白純化物。實驗四 離子交換層析和凝膠色譜層析純化PPO一、原理與目的柱層析技術是最常用的蛋白

12、質純化手段，在普通生化操作中通過離子交換層析和凝膠層析連用實現蛋白質的純化。離子交換劑是一種不溶性高分子化合物，分子中含有解離基團，在水中能與溶液中其他離子起交換作用。當一定量的溶液通過交換柱時，溶液中的離子不斷被交換而濃度逐漸減少，全部被吸附到樹脂上。交換反應都是平衡反應，在連續添加新的交換溶液下，平衡不斷按正方向進行，直至把離子交換劑上的原離子全部洗脫下來。以上兩種成分被交換著吸附在離子交換劑上，用洗脫劑洗脫時，被洗脫的能力則決定于各自洗脫反應的平衡常數。本實驗中用凝膠色譜技術分離純化PPO。其原理是通過分子篩效應，將樣品中某一固定大小的蛋白質分子分離出來。二、材料與試劑試劑：0.02M

13、Tris-HCL緩沖液Ph7.4(內含0.001M EDTA)配制時配×10倍濃縮液1000ml;NaCL;聚已二醇；葡聚糖凝膠Sephadex G-200等；實驗器械與儀器設備：試管與試管架、燒杯、玻璃攪棒、移液管、滴管等；試劑瓶、層析柱、pH計和pH試紙、恒流泵、梯度混合儀、核酸蛋白監測儀、GL-20C高速冷凍離心機、DL-7A大容量低速冷凍離心機三、操作步驟1葡聚糖凝膠的處理、裝柱及平衡（1）柱材處理稱取一定量的Sephadex G-200干粉，加無離子水或蒸餾水浸泡溶脹48h,去掉懸浮的細微顆粒，為防止凝膠顆粒中的空氣存在，影響層析效果，凝膠裝柱前一定要將凝膠液中的氣體除掉，

14、其辦法是將凝膠液放進抽濾瓶中，進行抽真空處理，直到凝膠液中沒有氣泡出現為止。（2）裝柱將層析柱清洗干凈垂直固定到層析架上，加1/3體積的無離子水，打開下出液口，水流暢通，即刻將小燒杯中裝有適宜濃度的凝膠液（凝膠的濃度過高會產生氣泡，影響蛋白質分離速度，濃度過低易產生凝膠分層，影響蛋白質的分離效果）輕輕倒入層析柱中，凝膠自然慢慢沉降在層析柱底部，凝膠沉積直到離層析柱上端1.5-2cm處，保持液面比膠面高1-2cm，停止裝柱，剪一與柱內徑相等的濾紙片覆蓋于凝膠上。層析柱上端進液口連接恒流泵，下出液口連接蛋白質監測儀，待層析柱的平衡。3）平衡在柱層析上樣前必須對層析柱進行平衡，所謂平衡就是將層析柱中

15、的溶液用層析過程的緩沖液（洗脫液）置換出來，使層析柱中的緩沖系統與柱層析過程中的系統一致。其方法是：利用層析柱上端的恒流泵將平衡緩沖液泵入到層析柱內，打開層析柱下端的出口，平衡液流速在0.5-1ml/min，當下出口流出液的PH值與平衡緩沖液的PH值一致時，層析柱達到了平衡。在本實驗中，用0.002M Tris-HCL緩沖液PH7.4(內含0.0001M EDTA)，平衡Sephadex G-200凝膠。2上樣：將粗酶液上柱。3洗脫：用0.02M Tris-HCL緩沖液Ph7.4（內含0.001M EDTA）洗脫，收集洗脫液進行酶活性、蛋白質濃度、聚丙烯酰胺凝膠電泳分子量的基本性質分析測定。4

16、測定酶活性和蛋白質濃度四、實驗結果 加考馬司亮蘭檢測蛋白，取含有蛋白的洗脫液，以供后續實驗檢測蛋白含量和酶活用。實驗五 酶含量及活性測定一、原理與目的蛋白質含量測定是生物化學實驗中一個重要的實驗技術。測定方法主要有：1，根據蛋白質中N含量基本恒定（16%）為基礎的凱氏定氮法；2，根據組成蛋白質的Phe、Trp、Tyr 3個帶苯環氨基酸在280nm具有吸收的特性為基礎的紫外吸收法；3，利用蛋白質的一些特殊理化反應，使蛋白質與一些專一性化學試劑反應產生顏色，其顏色深淺與蛋白質濃度相關為基礎的雙縮脲法和Lawry法、考馬斯亮藍G-250法等。雙縮脲法：蛋白質含有兩個以上的肽鍵，因此，有雙縮脲反應，在

17、堿性溶液中蛋白質與Cu2形成紫紅色絡合物，其顏色的深淺與蛋白質的濃度成正比，而與蛋白質的分子量和氨基酸成份無關。在一定的實驗條件下，未知樣品的溶液與標準蛋白質溶液同時反應，并于540560nm下比色，可以通過標準蛋白質的標準曲線，求出未知樣品的蛋白質濃度。考馬斯亮藍G-250測量蛋白質含量原理：考馬斯亮藍G250在酸性的溶液中游離狀態呈紅褐色，與蛋白質結合后呈藍色，其最大吸收波長由465nm轉變為595nm。在一定的蛋白質濃度范圍內，595nm處的光密度值與蛋白質濃度成反比，可用比色法進行蛋白質定量測定。二、儀器與試劑1材料：經硫酸銨沉淀獲得PPO粗酶液，Sephadex G-200分離純化的

18、酶液樣品。2儀器與器皿： 分光光度計，分析天平，容量瓶，移液管和試管等。3試劑：考馬斯亮藍G-100蛋白試劑：稱取100mg考馬斯亮藍G-100溶于50ml90的乙醇中，加入85（V/V）磷酸100ml，最后加入無離子水或蒸餾水定容到1000ml，此溶液可在常溫下放置一個月。三、操作步驟樣品中蛋白質濃度的測定：蛋白質含量測定（595nm）。96孔酶標板依次加入考馬斯亮蘭100微升，樣品20微升，原酶液20微升，對照為Tris-HCl緩沖液20微升。用DG5031型酶聯免疫檢測儀測定蛋白質含量。樣品中PPO活性的測定：酶標板依次加入磷酸-檸檬酸緩沖液20L底物鄰苯二酚20L樣品20L，原酶液20

19、L，對照為Tris-HCl緩沖液20L。四、實驗結果1.葡聚糖凝膠純化結果： 表1 葡聚糖凝膠柱處理后PPO蛋白含量和酶活性（OD值）洗脫體積CK1234567891011粗 酶酶 活000.050.570.600.670.20.30.210.120.070.070.77蛋白含量0000.430.370.440.180.430.120.070.050.040.51從上圖和上表中可得出如下結論：隨著洗脫體積的變化，純化后蛋白質含量和酶活性都出現峰值，從第2管開始蛋白質含量迅速增加，第5管時達到最大值（0.44）。酶活性在第5管時達到最大值，酶活曲線與蛋白質含量曲線走勢相似。比酶活在第5管時達到最

20、大。初酶蛋白含量很高，但酶活性卻很低，即比酶活較低，主要是因為其中非酶的雜蛋白含量較高。2.離子交換柱純化結果：表2 離子交換柱純化后PPO的酶活與蛋白質含量測定（OD值）管號CK12345678酶活000.040.090.130.130.150.160.20蛋白含量000.0350.0490.0560.0520.0740.080.10管號91011121314151617酶活0.230.230.180.150.140.120.090.100.10蛋白含量0.1020.1040.1040.0940.0860.0650.0580.060.088管號18192021222324粗酶一純酶活0.12

21、0.130.170.160.170.190.160.450.52蛋白含量0.0580.0670.0560.0980.0710.0670.0480.3150.430從上述圖表中可得離子交換層析法純化PPO后，在第9管和23管處，無論蛋白含量還是酶活均出現了兩個峰值，據此可得出，PPO存在至少兩種同工酶。兩次純化差異大，說明純化效果明顯。實驗六 親和層析純化胰酶一、原理與目的生物大分子化合物的重要特征之一是具有與某些相對應的分子通過次級鍵或共價鍵專一結合的能力即親和力。如酶與抑制劑之間，抗原與抗體之間，結合的雙方不僅是專一的，而且結合以后可以在不喪失生物活性的基礎上用物理或化學的方法進行解離。根據

22、這一特性，如果把具有親和力的一對分子的某一方連接于水不溶的固體載體上作為固定相，那么另一方隨著流動相流經該固定相的時候，雙方便親和結合為一個整體。然后只有改變某種物理條件或化學條件使結合的雙方解離，即能得到于固定相有特異親和力的某一特定物質。這種利用生物分子和相對應分子之間親和結合和解離性質而建立起來的層析方法稱之為親和層析。本實驗通過將胰蛋白酶抑制劑雞卵粘蛋白與Sephadex-G75偶聯及親和層析純化胰酶的操作，以了解親和層析的基本原理，掌握親和柱材活化偶聯及親和層析操作的基本過程和技術。 二、儀器與試劑1.雞卵粘蛋白制備2Sephadex-G75的活化和偶聯。25g干重的葡聚糖凝膠Sep

23、hadex-G75 、0.05M NaCL溶液 50ml、純化的雞卵粘蛋白87.5mg、 5% K2CO3、0.27gKBH4 （溶于20ml水）3親和層析0.1M Tris-HCL pH7.5(含0.5M KCL,0.05M CaCL2) 200ml、粗胰蛋白酶約50ml 、0.1N甲酸鉀、0.5M KCL pH2.5 100ml儀器器材：抽濾瓶500-1000ml、層析柱、紫外分光光度計、紫外蛋白檢測儀、燒杯漏斗、移液管、磁力攪拌器三、操作步驟1.雞卵粘蛋白的制備2.Sephadex-G75的活化及偶聯2.5g干重的葡聚糖凝膠Sephadex-G75溶脹洗滌數次，緩慢攪拌，加入0.05M

24、NaCL溶液50ml ,30min，蒸餾水洗滌數次，抽干備用，活化凝膠，純化的雞卵粘蛋白87.5mg 溶于35ml水，加入活化葡聚糖凝膠，75K2CO3，調pH7.5-9.0,緩慢攪拌3h。反應過程隨時加入5K2CO3,以維持pH的穩定。0.27gKBH4 溶于20ml水，緩慢攪拌加入上述體系反應5h，pH維持在6.5-7.5，洗滌。3胰蛋白酶的親和層析（1）親和層析將雞卵粘蛋白Sephadex-G75裝柱（1×10cm）,用pH7.5,0.1M含 0.5M KCL,0.05M CaCL2的緩沖液平衡，平衡約23倍的柱體積。將粗胰酶液上柱層析。用紫外蛋白監測儀280nm處檢測蛋白質吸

25、收峰，隨著上柱和流出的雜蛋白量的平衡，吸收峰達到穩定，一旦上柱的胰蛋白酶量超過柱的負荷時，則胰蛋白酶溢出，使吸收峰升高，此時應停止樣品上樣，改用pH7.5的平衡緩沖液沖洗出雜蛋白，待洗出液的吸收回到基線后，改用0.1N的甲酸鉀0.5M KCL,Ph2.5的洗脫液解析，柱的流速維持在1.5ml/min左右，收集洗脫下來的蛋白峰蛋白，測總蛋白量及比活性，并根據上柱樣品的總蛋白量和比活性計算經親和層析后胰蛋白酶比活性提高的倍數，總蛋白回收率，胰蛋白酶量。當胰蛋白酶峰洗出，待紫外吸收回到基線后，重新用緩沖液平衡，親和層析柱可以反復使用。（2）胰酶蛋白和活性測定四、實驗結果表3 親和層析處理過柱后酶活與

26、蛋白質含量（OD值）管號12345678910蛋白含量0.0430.1010.1210.0650.1710.1500.1320.0780.0730.098 管號11 121314151617181920粗酶蛋白含量0.0490.0470.0500.0480.0650.0380.0510.0470.0430.0450.433從圖表中可以看出，蛋白質含量曲線隨著洗脫體積的不同出現了兩個大的個峰值。第5管蛋白質含量達到最高。表明雜蛋白洗除的比較好。實驗七 SDS-PAGE測定蛋白質分子量及蛋白質的純度鑒定一、原理與目的聚丙烯酰胺凝膠電泳之所以能將不同的大分子化合物分開，是由于這些大分子化合物所帶電荷

27、的差異和分子大小不同之故，如果將電荷差異這一因素除去或減小到可以忽略不計的程度，這些化合物在凝膠上的遷移率則完全取決于相對分子質量。聚丙烯酰胺凝膠電泳之所以能將不同的大分子化合物分開，是由于這些大分子化合物所帶電荷的差異和分子大小不同之故，如果將電荷差異這一因素除去或減小到可以忽略不計的程度，這些化合物在凝膠上的遷移率則完全取決于相對分子質量。SDS是十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate）的簡稱，它是一種陰離子去污劑，它能按一定比例與蛋白質分子結合成帶負電荷的復合物，其負電荷遠遠超過了蛋白質原有的電荷，也就消除或降低了不同蛋白質之間原有的電荷差別，這樣就使電泳遷移率只取

28、決于分子大小這一因素，就可根據標準蛋白質的相對分子量的對數對遷移率所作的標準曲線求得未知蛋白質的相對分子質量。本實驗用目前常用的垂直平板電泳，樣品的起點一致，便于比較PAGE電泳中各種成分及其作用：過硫酸銨：凝膠聚合的催化劑（過量會使離子強度升高），四甲基乙二胺：加速劑。（堿性條件下容易聚合）丙烯酰胺與雙丙烯酰胺（P133)二者總濃度及相對比例決定凝膠的孔徑、交聯度，硬度及彈性。不連續性SDS-PAGE濃縮膠與分離膠的性質和作用濃縮膠：膠濃度低，交聯度低，pH=6.7，蛋白帶負電荷少，大孔膠。 pH=6.7時，電極緩沖液中甘氨酸負離子解離較少（慢離子），氯離子是快離子，蛋白遷移速率介于兩者中間

29、，局部電位梯度大，（快離子移動快，形成局部低電導區，產生高電位，使移動加快）從而產生濃縮效應。分離膠：膠濃度高，交聯度高， pH=8，蛋白帶負電荷多，小孔膠， pH=8.0時，電極緩沖液中甘氨酸負離子解離較多，與氯離子一樣，遷移速度加快，蛋白遷移速率最慢，部電位梯度小。二、儀器與試劑1材料： 硫酸銨鹽析沉淀的多酚氧化酶粗酶樣品、DEAE-纖維素DE52柱層析的樣品，Sephadex G-100柱層析的樣品。2試劑：（1）丙稀酰胺(Acr母液)：30Acr （Acr/Bis）（2）10的SDS溶液（3）10的過硫酸銨溶液（4）四甲基乙二胺（TEMED）（5）分離膠緩沖液：1.5M Tris,PH

30、8.8（6）濃縮膠緩沖液：1.0M Tris,PH6.8（7）電極緩沖液：10×30g Tris,125g 甘氨酸和5g SDS，加水溶解定容至1000ml,pH8.3（8）樣品緩沖液：0.2M Tris,PH6.8,1%SDS,30%甘油，巰基乙醇及溴酚蘭（9）染色液：0.15考馬斯亮藍R250，溶于脫色液（10）脫色液：50的甲醇，7的冰醋酸的水溶液（11）標準分子量蛋白。3儀器設備： 電泳儀，垂直電泳槽等。三、操作步驟1.凝膠制備：用兩塊電泳玻璃板制成垂直板槽（不能漏膠），垂直放置。將配制好的分離膠溶液，倒入，滴加入無離子水，待凝膠聚集后，倒出無離子水，用吸水紙吸干，倒入濃縮膠

31、，再插入梳子。分離膠和濃縮膠的配備分別是：分離膠(10%) 濃縮膠(3.5%)試劑 體積試劑 體積30%的膠母 12.5mL 膠母液 2.5 mLPH8.8Tris緩沖液 10 mL PH8.8Tris緩沖液 2.5 mL水 7.4 mL 水 14.5 mLSDS 800 uL SDS 400 uLAP 150uL AP 150uLTEMED 25uL TEMED 25uL2.上樣：分別取樣品若干ml于離心管中，按1/1-1/5比例加入5×樣品緩沖液，再沸水浴中加熱35min，取出待用。用微量注射器分別吸取不超過30ul不同濃度的標準蛋白樣品和試驗樣品注入樣品槽。點樣結束后，調節電泳

32、儀電流到10mA（23mA/em），保持電流穩定不變，當溴酚藍遷移到離分離膠底12cm時，即可停止電泳。3染色：電泳完畢后，取出凝膠板，浸入染色液中，在37溫箱中保溫過夜。倒掉染色液，24h后，即可看到清晰的蛋白質條帶。4.脫色。四、實驗結果 1 2 3 4 51，粗酶；2，葡聚糖凝膠柱層析純化酶；3，離子交換柱層析純化酶；4，粗胰酶；5，親和層析純化酶。圖4 PPO和胰酶提取純化效果SDS-PAGE電泳圖可見，純化過程中目的條帶逐漸明顯，即目的蛋白相對含量逐漸增加，雜條帶逐漸消失。但進一步提純后，條帶消失，可能在進一步的柱層析過程中，制作的柱材料有問題，目的蛋白沒有掛柱，隨緩沖液流走了，故未

33、得到目的蛋白。實驗八 Western-blotting一、原理Western雜交是將蛋白質電泳、印跡、免疫測定融為一體的特異性蛋白質的檢測方法。其原理是：生物中含有一定量的目的蛋白。先從生物細胞中提取總蛋白或目的蛋白，將蛋白質樣品溶解于含有去污劑和還原劑的溶液中，經SDS-PAGE電泳將蛋白質按分子量大小分離，再把分離的各蛋白質條帶原位轉移到固相膜（硝酸纖維素膜或尼龍膜）上，接著將膜浸泡在高濃度的蛋白質溶液中溫育，以封閉其非特異性位點。然后加入特異抗性體（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）與一抗結合后，再加入能與一抗專一性結合的帶標記的二抗（通常一抗用兔來源的抗體時，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗體）

34、，最后通過二抗上帶標記化合物（一般為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶）的特異性反應進行檢測。根據檢測結果，從而可得知被檢生物（植物）細胞內目的蛋白的表達與否、表達量及分子量等情況。 Western Blot編輯本段回目錄此項技術是一種蛋白質的固定和分析技術，是將已用聚丙烯酰胺凝膠或其它凝膠或電泳分離的蛋白質轉移到硝酸纖維濾膜上，固定在濾膜上的蛋白質成分仍保留抗原活性及與其它大分子特異性結合的能力，所以能與特異性抗體或核酸結合，其程序Sonthern Blot相似，故稱為Western Blot,第一抗體與膜上特異抗原結合后，再用標記的二抗(同位素或非同位素的酶)來檢測，此方法可檢測1ng抗原蛋白。W

35、estern雜交方法靈敏度高，通常可從植物總蛋白中檢測出50ng的特異性的目的蛋白。 二、儀器與試劑(1)轉移電泳緩沖液：20mmol/L Tris HCL pH8.0 150mmol/L 甘氨酸 加14.5g Tris粉 67.08g甘氨酸于4L水中，加入1200mL 甲醇，加水至6L (2)考馬斯亮藍溶液 三、操作步驟(1)用已制備好的SDS-PAGE分離的蛋白凝膠。 (2)用一張濾紙，剪成與膠同樣大小，在轉移電泳緩沖液中預濕，放在Scotch-Brit Pad上，在膠的陰性端放上濾紙，膠的表面用該緩沖液浸濕，排出所有氣泡。 (3)在膠的陽極面放置同樣大小浸濕的硝酸纖維素膜，排出氣泡，再在

36、濾膜的陽極端放置一張濾紙，排出氣泡，再放一個Scotch-Brit Pad。 (4)將以上“三明治”樣裝置放入一個塑料支撐物中間，將支撐物放入電轉移裝置中，加入電轉移緩沖液。 (5)接通電源：使膠上的蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，電壓為14V 4轉移4小時或過夜。 (6)將濾膜放入考馬斯亮藍S溶液中5分鐘，蛋白染色水中脫色2分鐘，照像，用印度墨水將分子量標準染色，在水中完全脫色。 (7)將濾膜放在塑料袋中，每3張加入5mL封閉緩沖液(1克速溶去脂奶粉溶于100ml PBS中)，封閉特異性抗體結合位點，室溫1h，搖動，倒出封閉緩沖液。 (8)在封閉緩沖液中稀釋第一抗體，加入后室溫放置1小時，將濾膜轉

37、到塑料盒中，用200mL PBS洗四次，搖動。 (9)在封閉緩沖液中稀釋辣根過氧化物酶標記的二抗，重復步驟8。 (10)將濾膜放在100mL新配制的DAB底物溶液中，大約23分鐘就可顯色，用水沖洗終止反應、照像。 四、結果分析目的條帶分析陽性(顯色)條帶的分子量大小，而且根據信號(顏色)強弱分析蛋白表達量。圖5 Western-blotting圖示表明，目的條帶清晰可見，無雜帶出現。二 核酸部分實驗九 染色體DNA的提取一、原理DNA是遺傳信息的載體，是最重要的生物信息分子，是分子生物學研究的主要對象，因此DNA的提取也應是分子生物學實驗技術中的最重要、最基本的操作，如不能有效的完成DNA提取

38、方面的工作，那就根本談不上進行分子生物學方面的實驗。本實驗通過裂解液裂解細胞，有機溶劑反復抽提，使DNA進入水相與蛋白質分開，在RNase的作用下，降解RNA以純化DNA。通過實驗學習和掌握提取基因組DNA的原理和方法。二、材料1材料： 培養菌體2儀器設備： 超凈工作臺、培養箱、搖床、高速冷凍離心機、超級恒溫器或恒溫水浴、臺式離心機、取液器一套、低溫冰箱或冰柜、冷凍真空干燥器、電泳儀、水平電泳槽、紫外觀測儀3試劑： 細胞裂解液 100m M Tris-HCL 5mM EDTA 5OOm M NaCL 1.25%SDS pH7.5飽和酚 氯仿/異戊醇 酚/氯仿/異戊醇 異丙醇 70無水乙醇 3M

39、 NaAC RNase 50×TAE緩沖液 電泳載樣緩沖液三、操作步驟：培養菌體；培養好的菌液1.5ml離心收集菌體 + 600ul細胞裂解液（65預熱）懸浮菌體，60ul酚混合（變性蛋白，操作應緩和，不可劇烈振蕩，以免DNA烈解）；65 30min(5-10min,混勻一次)；+600ul 氯仿，混勻，靜置4-5min；15000g離心，10min；取上清，等體積氯仿抽提一次。吸取上清，+1/10體積的乙酸鈉，2倍體積的乙醇，置于-70,20min；10000g 離心10min,復溶于40-100ul的無菌水中；70乙醇洗沉淀，離心10min,真空干燥；復溶于30-40ul的無菌水

40、中，電泳。四、實驗結果 目的條帶圖6 大腸桿菌基因組DNA電泳圖所提取的大腸桿菌基因組DNA由瓊脂糖凝膠電泳分析結果，泳道較清晰，有一條很亮的DNA條帶，其下方有三條亮帶，可能為未降解的RNA，獲得染色體DNA用于后續實驗。實驗十 質粒DNA的提取與純化一、實驗目的與原理細菌質粒為雙鏈、環狀、共價的DNA分子，其大小范圍從1Kb-200Kb不等。他們是獨立于細菌染色體之外進行復制和遺傳的輔助性遺傳單位。質粒的存在能賦予菌體一些特殊的表型，這些表型主要有針對抗生素的抗性、修飾酶等。有些質粒DNA分子量較小，特別是與自身遺傳相關的DNA分子極小，可攜帶外源基因量較大，且轉移性強、拷貝數高、還帶有選

41、擇性標記，因此質粒是進行分子生物學操作和進行遺傳改良物種等工作的主要DNA載體。質粒DNA的提取是分子生物學試驗中最重要、最基本的實驗之一。根據實驗目的的不同，質粒DNA的提取方法不同。但基本步驟為三步。第一，細菌的培養和質粒的擴增；第二，細菌菌體的破碎；第三，質粒DNA的純化。菌體裂解方法不同決定了質粒DNA提取方法的差異，目前菌體裂解方法主要有煮沸法，SDS法，堿解法，Triton-溶菌酶法等。質粒DNA純化主要有梯度離心法、柱層析法等。二、材料與方法1材料：大腸桿菌2儀器：超凈工作臺，培養箱，搖床，超級恒溫箱或恒溫水浴，臺式離心機，取液器一套，低溫水箱或冰柜，冷凍真空干燥器，電泳儀，水平

42、電泳槽，紫外觀測儀3試劑： Solution 50mM葡萄糖 25mM Tris-HCL(Ph 8.0) 10mM EDTA(pH 8.0) 高壓滅菌，4保存Solution 0.2M NaOH ,1%SDS,現配現用Solution 5N KAC pH4.8, 高壓滅菌，4保存3M NaAC Ph5.2 高壓滅菌，4保存，氨芐青霉素 25mg/ml,溶菌酶 8mg/ml,氯仿/酚，異丙醇，LB培養基，電泳試劑4操作步驟：含氨卞（100ug/ml）的LB培養基 培養菌體 37 200rpm 過夜 吸取1.5ml, 5000rpm,12min離心，取沉淀（菌體細胞），加入預冷的100ul Sol

43、ution,充分震蕩懸浮菌體；加入200ul Solution ,顛倒3-5次，冰浴3-5min ；加入150ul Solution ,顛倒3-5次，冰浴5min,離心 12000rpm 5min；取上清，加等體積氯仿，混勻靜置2-4min；離心 12000g 2-4min；取上清，加2倍體積乙醇，1/10 體積乙酸鈉，-80,5-10min；12000g 離心10min；取沉淀；冷凍干燥，在懸浮于30ul ddw中，1.2%Argose膠電泳鑒定。三、實驗結果開環線性超螺旋圖7 大腸桿菌質粒DNA電泳圖對提取的質粒DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，共得到三條帶，跑的最慢的是我們提取的開環的質粒DNA

44、分子，中間的條帶是操作過程中斷裂的線性DNA分子，跑在最前面的應該是超螺旋的質粒DNA分子。實驗十一 酶切技術一、目的與原理核酸限制性內切酶是一類能識別雙鏈DNA中特定堿基順序的核酸水解酶，這些酶都是從原核生物中發現，它們的功能猶似高等功物的免疫系統， 用于抗擊外來DNA的侵襲。限制性內切酶以內切方式水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵， 產生的DNA片段5端為，3端為OH。根據限制酶的識別切割特性， 催化條件及是否具有修飾酶活性可分為、型三大類。第一類（I型）限制性內切酶能識別專一的核苷酸順序，它們在識別位點很遠的地方任意切割DNA鏈，但是切割的核苷酸順序沒有專一性，是隨機的。這類限制性內切酶在DNA重

45、組技術或基因工程中用處不大，無法用于分析DNA結構或克隆基因。這類酶如EcoB、EcoK等。第三類（型）限制性內切酶就是通常指的限制性內切酶。它們能識別雙鏈的特異順序，并在這個順序內進行切割，產生特異的DNA片段； 型酶分子量較小，僅需Mg2+作為催化反應的輔助因子，識別順序一般為46個堿基對的反轉重復順序；型內切酶切割雙鏈產生3種不同的切口：5端突出；3端突出和平末端。 正是得益于限制性的內切酶的發現和應用， 才使得人們能在體外有目的地對遺傳物質進行改造，從而極大地推動了分子生物學的興旺和發展。二、材料與方法1材料： DNA2儀器：離心機，恒溫水浴，取液器，電泳儀，電泳槽，紫外觀測儀3試劑：

46、EcoRI及緩沖液，HindIII及緩沖液，DNA,TAE緩沖液4操作EcoRI、HindIII雙酶切， 取2只干凈、滅菌新Eppendorf管，分別如下加入（l） 試劑A管（gene）B 管（DNA）C管（plasmid）ddw101312樣品634Buffer222EcoRI111HindIII111總體積20202037保溫2小時。加入6l電泳加樣緩沖液。電泳分析。三、實驗結果雙酶切的結果表明DNA 已被切割成若干段，由maker可以得到帶相對的大小，帶的亮度表明了相對量的多少。實驗十二 DNA片段的連接技術一、目的與原理 酶切片段的聯接是兩DNA片段相鄰的5磷酸和3羥基間可有連接酶催化

47、形成磷酸二酯鍵，這個連接反應在體外一般都有大腸桿菌DNA連接酶和T4DNA連接酶催化，但是分子生物學試驗中主要采用T4DNA連接酶，因該酶在正常條件下，即能完成連接反應。本實驗擬通過T4DNA連接酶對酶切片斷的連接操作，掌握這一DNA片段的連接技術。二、材料和方法1儀器：離心機，恒溫設備，真空干燥機，取液器2試劑：T4DNA連接酶，10×T4DNA連接酶緩沖液、200mM Tris-HCl(pH7.6)、50mM MgCl2、50mM DTT、500g/ml牛血清白蛋白、5mM ATP、DNA、酚，TE緩沖液，電泳緩沖液、3M NaAC3操作：取干凈、滅菌新Eppendorf管，加入

48、各試液如下（l）試液體積ddw13.5T4DNA連接酶緩沖液1.5質粒載體(酶切后的)3DNA1T4連接酶1總體積154 保溫過夜，提取已連接好的DNA片段，電泳分析。三、實驗結果 1 2 31、基因組DNA；2，DNA；3，質粒DNA圖8 雙酶切電泳圖可見酶切后各片段大小。第一泳道，亮白色的一堆，可能是RNA殘留的。在3泳道中有2個酶切片段。 實驗十三 受體菌感受態細胞的制備一、目的與原理在自然條件下，很多質粒都可通過細菌接合作用轉移到新的宿主內，但在人工構建的質粒載體中，一般缺乏此種轉移所必需的mob基因，因此不能自行完成從一個細胞到另一個細胞的接合轉移。如需將質粒載體轉移進受體細菌，需誘

49、導受體細菌產生一種短暫的感受態以攝取外源DNA。目前常用的感受態細胞制備方法有CaCl2和RbCl(KCl) 法，RbCl(KCl)法制備的感受態細胞轉化效率較高，但CaCl2 法簡便易行，且其轉化效率完全可以滿足一般實驗的要求，制備出的感受態細胞暫時不用時，可加入占總體積15的無菌甘油于-70保存(半年)，因此 CaCl2法為使用更廣泛。二、材料與方法1.材料：大腸桿菌2.儀器：離心機，恒溫搖床，恒溫水浴，超凈工作臺，冰柜3.試劑：LB培養基，0.1M MgCl2，3mM氯化6氮合高鈷TFB：10Mm MES（Ph6.3）45Mm MnCl210Mm CaCl210Mm KCl三、操作大腸桿

50、菌在LB培養基平板上劃線培養12-16小時，挑取單菌落于LB培養基搖瓶培養大腸桿菌到對數期。取1ml培養物7000rpm，離心3min，收集菌體。再重復一次。冰浴放置。用預冷的氯化鎂懸浮菌體7000rpm離心3min。收集菌體，冰浴放置。用預冷的氯化鈣懸浮菌體，冰浴15min, 7000rpm離心3min。收集菌體，冰浴放置。加入200l預冷的氯化鈣（或TFB），放置于冰浴，即得感受態細胞，此細胞可現用，也可進行下步操作。將懸液分裝于無菌離心管中，投入液氮，然后儲于-70保存。四、實驗結果獲得感受態細胞用于實驗中的轉化受體。實驗十四 遺傳轉化一、目的與原理轉化(Transformation)是將外源DNA分子引入受體細胞，使之獲得新的遺傳性狀的一種手段，它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領域的基本實驗技術。轉化過程所用的受體細胞一般是限制修飾系統缺陷的變異株，即不含限制性內切酶和甲基化酶的突變體(R，M)，它可以容忍外