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文檔簡介

1、溫州醫(yī)學院學科科研項目申請書項目名稱:申請者:蔣淑麗所在學校申請日期:項目名稱研究類別研究項目申請金額50000密級機密秘密內部般姓名蔣淑麗性別女出生年月1989.7政治面貌預黨民族漢職稱學歷本科學位學士部門部門電話手150885509E-Mai家庭電話機92lm申請人溫州醫(yī)學院學科科研項目申請書簡表研究性質胡基礎研究應用研究實驗發(fā)展起止年月2011-6-15至2014-6-1隨著分子生物學的發(fā)展,腫瘤基因治療實驗研究和臨床應用都有了很大進步,而對膀胱癌的研究有助于其他部位癌癥研究的發(fā)展。從其理論基礎和相關實驗研究進展進行了分析,并就腫瘤基因治療的新途徑、取得的主要成就、存在的問題及展望進行了

2、綜述。關鍵詞色素上皮衍生因子膀胱癌色素上皮衍生因子(PEDF在膀胱癌中的表達及其對膀胱癌治療作用的研究立論依據(jù)一、趨勢判斷和需求分析國內外現(xiàn)狀、水平和發(fā)展趨勢(含知識產權狀況和技術標準狀況);經(jīng)濟建設和社會發(fā)展需求;科學技術價值、特色和創(chuàng)新點。膀胱癌是危及人類健康的重大疾病,全世界范圍內統(tǒng)計其發(fā)病率占全身腫瘤的第8位,在男性其標準發(fā)病率9.9/10萬;在女性,其標準發(fā)病率為2.3/10萬,占第25位。死亡率在男性為4.2/10萬,占全身腫瘤死亡率的第9位,在女性為1.1/10萬,占第16位。在我國,膀胱癌也是泌尿外科的最常見惡性腫瘤,占全身惡性腫瘤的3.2%,1995年,北京市城區(qū)膀胱癌發(fā)病率

3、大約為7/10萬人,上海市城區(qū)發(fā)病率為8.6/10萬人1,且今后發(fā)病率仍有上升趨勢。作為危害人類健康的常見惡性腫瘤,膀胱癌發(fā)病機制和治療方面的研究始終是臨床基礎研究的重點之一。目前膀胱癌的治療仍以手術切除為主,輔以膀胱灌注化療和免疫治療、全身化療、放療和生物治療等措施,但這些治療方法效果都不滿意,主要是治療后易復發(fā),復發(fā)率高達80%其中大約16%-25臨發(fā)的腫瘤其惡性程度增加,有10%發(fā)展為浸潤性或轉移性癌,因此,尋找一種新的、更有效的生物治療方法,是當前臨床迫切需要解決的問題。在膀胱癌的這些輔助性治療方法中,無論是化療還是免疫治療,主要機制是通過直接殺死腫瘤細胞、阻斷腫瘤細胞分裂或誘導細胞調

4、亡的方式來抑制腫瘤生長。做為一種實體性腫瘤生長,腫瘤細胞的增殖固然重要,而新生血管的形成在腫瘤的生長和復發(fā)、轉移過程中也發(fā)揮非常重要作用。在正常狀態(tài)下,人體內的脈管系統(tǒng)在血管生長因子和抑制因子網(wǎng)絡式的相互作用下處于平衡狀態(tài);病理狀態(tài)下,尤其是發(fā)生惡性腫瘤時,這種平衡向血管生成的方向發(fā)展。當腫瘤生長達到腫瘤組織超過2mm時就會有新生血管形成,如果沒有新生血管生成,腫瘤生長明顯受到抑制,甚至停止2,3。抗血管生成療法是不同于目前常規(guī)療法的新的腫瘤治療策略,具有高效低毒和不易產生耐藥性的特點4。有關血管生長因子和血管生長抑制因子在腫瘤中所起作用,以及通過抗血管生成治療腫瘤已經(jīng)成為當前腫瘤研究的一個熱

5、點。近來研究發(fā)現(xiàn),色素上皮衍生因子(pigmentepitheliumderivedfactor,PEDF)是一種對腫瘤有抑制作用的細胞因子。這種細胞因子是Tombran-Tink等在實驗中發(fā)現(xiàn)的,由人視網(wǎng)膜色素上皮細胞分泌的一種蛋白質,分子量為50KD5,屬于serpin卵白蛋白/PAT-2亞群,其基因全長16kb,位于染色體17p13.1-pter。多項研究表明,PEDF是一種天然的高效的新生血管抑制劑7,并通過誘導腫瘤細胞分化起到抑制腫瘤生長的作用。Tombran-Tink等將PEDF基因定位于染色體17p13.1,腫瘤發(fā)生與該區(qū)域關系密切,提示該基因可能是抑癌基因或腫瘤相關基因5。對腫

6、瘤細胞進行編碼PEDF的腺病毒轉染,在血管內皮生長因子(Vascularendothelialgrowthfactor,VEGF存在的情況下,PEDF明顯阻止了血管內皮細胞管腔形成和遷移。對患有CNV/AMD患者的體外實驗也發(fā)現(xiàn),PEDF大量減少的情況下,內皮細胞有明顯遷移;而對照組含有正常水平PEDF則抑制了內皮細胞的遷移6。Crawford等發(fā)現(xiàn)PEDF在神經(jīng)母細胞瘤中是腫瘤細胞分化調控的主要的抗血管生成的抑制劑7。肝癌患者血管增生和腫瘤發(fā)展中,PEDF作為VEGF的拮抗因子,起到了抑制作用。對裸小鼠的在體實驗以及鼠的肺癌模型也同樣證明了PEDF寸腫瘤的抑制作用。其機制乃因PEDF減少腫瘤

7、微血管的密度,因而可被用于抑制腫瘤新生血管形成,從而抑制腫瘤的生長,在腫瘤的治療前景上非常樂觀8。我們最近對PEDF在膀胱癌中表達情況的初步研究發(fā)現(xiàn),PEDF在膀胱癌組織中表達明顯低于正常膀胱組織,而且PEDF表達情況與膀胱癌的惡性程度以及癌組織中微血管密度呈負相關,提示PEDF在膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展中具有一定的作用,PEDF的正常表達可能抑制膀胱癌細胞的生長、增殖,PEDF有可能成為膀胱癌生物學治療的一種有效的新方法。目前國內、外尚未見此項研究的相關報道。因此我們設想,擴大樣本量,應用分子生物學技術檢測膀胱癌組織及非癌膀胱組織中PEDF的表達水平,進一步研究PEDF在膀胱癌中的表達情況,并結合

8、臨床資料分析PEDF表達與膀胱癌分期、分級、轉移及預后的關系;通過研究膀胱癌組織中PEDF與VEGF表達的相關性,PEDF與血小板反應素-1表達的相關性,探討膀癌組織中PEDF表達與腫瘤血管形成的相關性及可能的作用機制;通過研究PEDF表達與金屬蛋白酶-9(MMP-9的相關性,探討PEDF表達與膀胱癌浸潤的相關性;通過研究PEDF表達與已知的對腫瘤生長有明確調節(jié)作用的腫瘤壞死因子a(TNF-a)、白細胞介素1a(IL-1a)、血栓調節(jié)蛋白(thrombomodulin)和白介素8(IL-8)等細胞因子表達的相關性,探討PEDF表達對膀癌細胞調節(jié)的可能機制,從而探討PEDF在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展過程

9、中的可能作用機制;在此基礎上,以連接有PEDF編碼基因的腺病毒載體轉染膀胱癌細胞株、以PEDF蛋白治療裸鼠膀胱癌模型,進一步探討PEDF表達對膀胱癌細胞生長的抑制作用以及對膀胱癌的治療效果,為膀胱癌的生物學治療探索一種有效的新方法。參考文獻吳階平,吳階平泌尿外科學,山東科學技術出版社,2004.5:898-917二、研究內容和技術關鍵研究的總體目標:(1) 研究PEDF表達與膀胱癌的發(fā)生、分期、分級、轉移及預后的關系,探討PEDF表達在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展及轉移過程中可能的作用機制。(2) 研究PEDF寸膀胱癌細胞的治療效果,為臨床治療膀胱癌的生物治療探索一種新的有效方法研究的創(chuàng)新點:本課題研究的

10、內容和思路不同于以往的其他研究,應用分子生物學方法從研究PEDF表達與膀胱癌的發(fā)生、分期、分級、轉移及預后的關系入手,探討PEDF表達在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展和轉移中可能的作用機制。在此基礎上,以連接有PEDF編碼基因的腺病毒載體轉染膀胱癌細胞株、以PEDF蛋白治療裸鼠膀胱癌模型,探討PEDF寸膀胱癌的治療作用。目前,本項研究國內、外尚未見報道。本研究的順利完成,將為膀胱癌的生物學行為的研究開辟了新的途徑,也將為膀胱癌的生物學治療探索一種新的有效方法。研究的主要內容:(1) 膀胱癌組織和非癌膀胱組織中PEDF和相關細胞因子表達的檢測及相關性研究:應用分子生物學技術研究膀胱癌組織和非癌膀胱組織中PED

11、F表達狀況,并檢測VEGFTSP-1、MMP-9TNF-a、IL-1a、血栓調節(jié)蛋白(thrombomodulin)和IL-8的表達狀況;采用免疫組化技術檢測膀胱癌組織和非癌膀胱組織中的微血管密度(microvasculardensity,MVD,分析PEDF與VEGFTSP-1、MMP-9TNF-a、IL-1a、血栓調節(jié)蛋白和IL-8表達的相關性,PEDF與MVD勺相關性;并結合臨床資料分析研究PEDF表達與膀胱癌患者5年生存率之間的關系;闡明PEDF表達與膀胱癌的發(fā)生、分期、分級、轉移及預后的關系,探討PEDF表達在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展中的可能機制。以連接有PEDF編碼基因的腺病毒載體轉染膀胱

12、癌細胞株,以空載轉染膀胱癌細胞株作為對照,觀察檢測VEGFTNF-a的表達情況及膀胱癌細胞的凋亡、增殖情況。(3) PEDF對裸鼠膀胱癌模型的治療:以人膀胱癌細胞種植于裸鼠皮下,建立裸鼠膀胱癌模型。以PEDF蛋白(購自吉泰生物科技有限公司)直接注射于裸鼠皮下腫瘤組織內作為治療組,以未注射PEDF組為陰性對照組。觀察各組的MVDVEGF及腫瘤增殖情況,探討PEDF表達在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機制,評估PEDF對膀胱癌的治療效果,為進一步過度到臨床應用提供依據(jù)。需要解決的技術關鍵:(1)連接有PEDF編碼基因的腺病毒載體轉染膀胱癌細胞株的轉染成功率。(2)PEDF定量檢測:我們已有對前列腺癌、腎

13、癌、膀胱癌等組織標本的PEDF定量分析的基礎,已形成較成熟技術條件、設備和研究經(jīng)驗。(3)膀胱癌裸鼠模型的構建。我們已有成功構建裸鼠膀胱癌和前列腺癌模型的經(jīng)驗。研究方法:方法(1)膀胱癌組織和非癌膀胱組織中PEDF和相關細胞因子表達的檢測及相關性研究:實驗組對照組膀胱癌組織非癌膀胱組織標本A期B期C期D期癌旁膀胱組織正常膀胱組織炎性膀胱組織例數(shù)30303030120120120.應用SYBRGreenI實時定量聚合酶鏈反應(real-timePCR技術,對膀胱癌、非癌膀胱組織中PEDF進行定量測定。.Westernblot法檢測VEGFTSP-1、MMP-9.ELISA法檢測TNF-a、IL-

14、1a、血栓調節(jié)蛋白、IL-8濃度。.免疫組化方法檢測標本MVD.整理臨床資料:膀胱癌患者性別、年齡、組織病理、分期、分級、是否轉移、5年生存率。.數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析(使用SPSS統(tǒng)計分析軟件):PEDF與VEGF表達的相關性。PEDF與TSP-1表達的相關性PEDF與MMP-9表達的相關性IL-8濃度的相關性。PEDF與TNF-a、IL-1a、血栓調節(jié)蛋白、PEDF與組織MVD相關性。PEDF與膀胱癌分期的相關性。PEDF與膀胱癌惡性程度(分級)的相關性。PEDF與膀胱癌轉移的相關性。PEDF與膀胱癌5年生存率的相關性。方法(2)PEDFX寸膀胱癌細胞株的治療:以連接有PEDF編碼基因的腺病毒載體轉

15、染膀胱癌細胞,以空載轉染膀胱癌細胞作為對照,檢測VEGFTNF-a濃度,觀察細胞的增殖、凋亡情況,分析相關性。 .以RT-PCR法擴增PEDF基因。 .將擴增后的PEDF基因連接入腺病毒載體,轉染膀胱癌細胞。并以空載轉染為對照。 .Westernblot法檢測VEGFTSP-1、MMP-9表達。 .觀察膀胱癌細胞增殖、侵襲、凋亡情況。 .統(tǒng)計分析。方法(3)PEDF對裸鼠膀胱癌模型的治療:以人膀胱癌細胞種植于裸鼠皮下,建立裸鼠膀胱癌模型。以PEDF蛋白直接注射于裸鼠皮下腫瘤內作為治療組,以未注射PEDF為陰性對照組。觀察兩組膀胱癌組織MVDVEGF表達情況、腫瘤增殖情況,評價PEDF對膀胱癌的

16、治療效果。 .以人膀胱癌細胞種植于裸鼠皮下構建膀胱癌裸鼠模型。 .將PEDF蛋白注射于裸鼠瘤體內。 .應用免疫組化方法檢測MVD應用Westernblot法檢測VEGFTSP-1、MMP-9觀察腫瘤增殖、凋亡情況。分析PEDF與VEGF的相互作用關系及其對腫瘤生長的作用機制。技術路線:(1)膀胱癌組織和非癌膀胱組織中PEDF及相關細胞因子表達的檢測及相關性研究:膀胱癌標本120例癌旁膀胱組織標本120例正常膀胱組織標本120例炎性膀胱組織標本120例RT-PCR檢測PEDFmRNA表達Westernblot法檢測VEGFTSP-1、MMP-9ELISA法檢測TNF-a、IL-1a、血栓調節(jié)蛋白

17、、IL-8濃度免疫組化方法檢測標本微血管密度(MVD結合臨床資料,數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析(2) PEDF對膀胱癌細胞株的治療:將PEDF轉染膀胱癌細胞株,檢測VEGFTSP-1、MMP-9TNF-a濃度,觀察腫瘤細胞的增殖、凋亡RTPCR法擴增PEDF基因空載體連接入腺病毒載體轉染膀胱癌細胞株a情況。結果分析PEDF對裸鼠膀胱癌模型的治療:觀察PEDF與VEGFMVD相關性及其對膀胱癌細胞的抑制作用構建膀胱癌裸鼠模型品胃栩DWE劉P一HESTER注、了雖礎研究(包括分子生物學研照和臨床研究,如:裸鼠膀胱癌模型的建立、CD44基因、端粒酶、鼠膀胱癌模型的建立、CD44基因、端粒酶、53和Ras基因等表達與

18、膀胱癌的關系、VEGF表達與膀胱癌的關系等,熟練掌握了泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤分子生物學和細胞學研究的技術方法,如RT-PCRsouthernnorthern雜交、northern雜交、兒口?NW有,擁有ivdpc的泌尿外定H病理、R擴增儀、酶標儀、各種獨立電泳分子Hl況細胞槽、凝膠成像設備、學實驗室,實驗室設備細胞房及各種基礎實驗累了較豐富的研究經(jīng)驗。結果分析最近我們開展了對膀胱癌、前列腺癌組織的初步研究,掌握了對腫瘤組織包括膀胱癌組織中PDEF表達的檢測方法,對本課題的順利進行提供了便利條件。例如:已完成對膀胱腫瘤與正常膀胱組織PEDF表達情況的對照性研究,初步結果顯示如下:(1)定量PCR產物瓊

19、脂糖凝膠電泳結果可見:PEDF在正常膀胱組織中高表達,而在膀胱癌組織中表達明顯降低(見圖1)。進度安排5002012T0DPEDPEDF2011完成.GAPDH在膀胱;-圖2)。注:N1,N2,N3:正常膀胱組織細胞因子表達的檢測及相關性研膀胱癌組織GAPDH:內參照M:為標記分子量2013-3至2014-6圖1:正常膀胱組織與膀胱癌組織PEDF定量PCRPEDF對裸鼠膀胱癌模型的治療預期成果:(1)明確測定出PEDF在膀胱癌中的表達情況以及其與相關細胞因子表達之間的關系。(2)PEDF在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。(3)PEDF對膀胱癌的治療有效,為最終過渡到臨床應用提供強有力的實驗依據(jù)。成果以論文的形式表達,并申請“PEDF治療裸鼠膀胱癌模型技術”的專利;擬發(fā)表論著57篇,其中國內權威雜志45篇,SCI收錄雜志2篇。申請成果鑒定。本課題實施過程中,形成一整套的細胞因子檢測方法、膀胱癌細胞株培養(yǎng)及腺病毒轉染膀胱癌細胞技術、裸鼠膀胱癌模型的建立及PEDF治療裸鼠膀胱癌模

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