1、www.CRTER.org趙玉果，等. 脫細胞基質材料制備方法及在骨關節軟骨損傷修復中的應用脫細胞基質材料制備方法及在骨關節軟骨損傷修復中的應用趙玉果1，李明明2(1南陽市中心醫院，河南省南陽市 473000；2鄭州大學第一附屬醫院，河南省鄭州市 450001)引用本文：趙玉果，李明明. 脫細胞基質材料制備方法及在骨關節軟骨損傷修復中的應用J.中國組織工程研究，2016，20(34):5051-5056.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.34.006 ORCID: 0000-0002-0003-0264(趙玉果)文章快速閱讀：脫細胞基質組織工程材料在骨關節軟

2、骨損傷修復中的應用趙玉果，男，1982年生，河南省南陽市人，漢族，2009年鄭州大學畢業，碩士，主治醫師，主要從事骨關節損傷及脊柱微創的臨床研究。中圖分類號:R318文獻標識碼:A文章編號:2095-4344(2016)34-05051-06稿件接受：2016-06-12用牛膝關節軟骨制備軟骨脫細胞基質支架主要觀察指標：脫細胞基質材料大體情況；觀察脫細胞基質材料組織學觀察；脫細胞基質材料理化性能；兩組支架材料A值比較；兔骨關節缺損修復12周后大體和組織學觀察。纖維樣組織組采用纖維樣組織修復脫細胞基質組織組采用脫細胞軟骨基質支架修復30只新西蘭大白兔建立骨關節軟骨缺損模型 文題釋義：脫細胞基質：

3、是將同種異體組織經過脫細胞工藝處理后，去除能夠引起免疫排斥反應的抗原成分，同時完整地保留細胞外基質的三維空間結構及一些對細胞分化有重要作用的生長因子，如成纖維細胞生長因子2、轉化生長因子、血管內皮生長因子等。經過處理的細胞外基質材料具有良好的機械力學性能，該材料的組織相容性好，植入體內沒有免疫排斥現象，在體內起著支持、連接細胞的作用，同時其三維的空間結構及細胞因子有利于細胞的黏附和生長。關節軟骨：屬于透明軟骨，表面光滑，呈淡藍色，有光澤，它是由一種特殊的叫做致密結締組織的膠原纖維構成的基本框架，這種框架呈半環形，類似拱形球門，其底端緊緊附著在下面的骨質上，上端朝向關節面，這種結構使關節軟骨緊緊

4、與骨結合起來而不會掉下來，同時當受到壓力時候，還可以有少許的變形，起到緩沖壓力的作用。摘要背景：研究顯示，組織脫細胞基質與正常細胞外基質相比能夠在機體內誘導上皮細胞、平滑肌細胞，促進其演化為機體的一部分。目的：觀察脫細胞基質組織工程材料在骨關節軟骨損傷修復中的應用效果。方法：采用隨機對照方法將30只新西蘭大白兔分為纖維樣組織組和脫細胞基質組織組，每組15只，在大白兔股骨髁部建立直徑為4 mm的骨關節軟骨缺損模型。用牛膝關節軟骨制備軟骨脫細胞基質支架，脫細胞基質組織組采用脫細胞軟骨基質支架修復；纖維樣組織組采用纖維樣組織修復，比較兩組不同組織修復效果。結果與結論：脫細胞基質組織工程材料交聯后呈現

5、為深藍色，疏松多孔，直徑為5 mm，硬度適中，具備一定的彈性；蘇木精-伊紅染色不含有細胞碎屑及藍染的核物質，不存在殘留的細胞外基質；甲苯胺藍染色為藍色材料支架孔隙率為90%，溶脹率為(1 314±337)%；脫細胞基質組織組材料1，3，5，7，9 d的A值顯著高于纖維樣組織組(P < 0.05)；兔纖維樣組織組缺損明顯，纖維瘢痕基本形成并充填在缺損中。脫細胞基質組織組修復12周后缺損部位存在白色組織覆蓋，表面光滑，缺損面基本修復，與正常組織邊界不明顯。甲苯甘藍染色顯示藍染，細胞細小變平，軟骨下骨骨結構與軟骨連接良好，直接基本降解；結果提示：脫細胞基質組織工程材料具有良好的生物相

6、容性、細胞吸附性以及親水性而在骨關節軟骨損傷修復中得到應用，能促進損傷部位的修復效果，是一種適用于骨關節軟骨損傷的修復材料。3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 kf23385083Zhao Yu-guo, Master, Attending physician, Central Hospital of Nanyang, Nanyang 473000, Henan Province, China關鍵詞：生物材料；軟骨生物材料；細胞基質；骨關節軟骨損傷；修復；纖維樣組織 主題詞：骨；軟骨，關節；組織工程Tissue-engineered acellular matrix

7、material: preparation and application in articular cartilage repairZhao Yu-guo1, Li Ming-ming2 (1Central Hospital of Nanyang, Nanyang 473000, Henan Province, China; 2First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, Henan Province, China)AbstractBACKGROUND: It has been reported th

8、at tissue-engineered acellular matrix can induce and promote epithelial cells and smooth muscle cells to evolve into a part of body in vivo compared with the normal extracellular matrix.OBJECTIVE: To investigate the effect of tissue-engineered acellular matrix in articular cartilage repair.METHODS:

9、Totally 30 New Zealand rabbits were randomly allotted to fibroid tissue and acellular matrix groups (n=15 per group), and then articular cartilage defect models, 4 mm in diameter, were established at the white rabbit femoral condyle. Acellular cartilage matrix scaffold was prepared using bovine knee

10、 cartilage, and model rats in the acellular matrix group were repaired with acellular cartilage matrix scaffold and the others in the fibroid tissue group repaired with fibroid tissues. Finally, repair effects between two groups were compared.RESULTS AND CONCLUSION: The dark blue and porous tissue-e

11、ngineered acellular matrix material could be found, with a diameter of 5 mm and moderate hardness, and exhibited certain flexibility after cross-linking. Hematoxylin-eosin staining showed that cell debris, blue-stained nuclear materials and residual extracellular matrix disappeared. Toluidine blue s

12、taining found that the porosity of the blue scaffold was 90%, and the swelling ratio was (1 314±337)%. The absorbance value in the acellular matrix group was significantly higher than that in the fibroid tissue group at 1, 3, 5, 7 and 9 days (P < 0.05). In the fibroid tissue group, defects f

13、illed with newborn fibrous scars were overt. By contrast, in the acellular matrix group, the white tissues covered the defect region with smooth surface, and the wound was basically healed, with an unclear boundary after 12 weeks. Moreover, blue-stained, small flattened cells appeared, subchondral b

14、one structure was connected well with the cartilage, and the scaffold was directly degraded. In conclusion, the tissue-engineered acellular matrix material exhibits good biocompatibility, cell adsorption and hydrophilicity, and can promote the defect repair after articular cartilage injury. Therefor

15、e, it is a suitable substitute for articular cartilage repair.Subject headings: Bone; Cartilage, Articular; Tissue EngineeringCite this article: Zhao YG, Li MM. Tissue-engineered acellular matrix material: preparation and application in articular cartilage repair. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 20

16、16;20(34):5051-5056.5ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction創傷、骨性關節炎等均為臨床上常見的骨科疾病，這種疾病發病率較高，誘因也相對較多，且多數患者損傷后伴有軟骨下骨的缺損，缺損如果得不到及時有效的修復，將會誘發其他疾病，嚴重者甚至導致關節功能的喪失1-2。目前，臨床上對于骨關節軟骨缺損尚缺乏理想的修復方法，常用的修復方法尚存在一定的局限性，自體移植是目前最理想的修材料，但是該方法受到來源的限制、取骨軟骨處受到進一步損傷，增加患者痛苦，而對于異體或異種移植則容易產生免疫排斥反應等3-4。研究結果

17、顯示：組織脫細胞基質與正常細胞外基質相比能夠在機體內誘導上皮細胞、平滑肌細胞5-6，從而促進其演化為機體的一部分。目前，臨床上對于脫細胞處理的真皮、心包、角膜等作為相應組織替代物已經取得了階段性進展7-8。組織工程學是一門新興的學科，它主要是利用細胞生物學、生物材料學以及工程學原理，開發應用于修復或改善機體缺損器官結構、功能替代物的學科9-10。組織工程在修復過程中其三大要素包括種子細胞、支架材料以及生長因子等，并且三者相輔相成，融會貫通，融合了工程學、生命科學等原理和理論11。支架材料在構建組織工程軟骨時，材料的性能在一定程度上影響細胞的生物學特性及細胞增殖能力，從而影響植入物及受體效果12

18、-13。目前，臨床上對于細胞基質組織工程材料制備方法及其性能以及在骨關節軟骨損傷中的效果尚缺乏研究。因此，臨床上研究細胞基質材料在骨關節軟骨損傷修復中的效果能為提高臨床治愈率提供依據14-15。文章研究細胞基質組織工程材料制備方法及其性能，探討細胞基質組織工程材料在骨關節軟骨損傷修復中的應用效果。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 設計 動物對照性分析。1.2 時間及地點 于2014年11月至2015年11月在鄭州大學第一附屬醫院實驗室完成。1.3 材料實驗動物：30只新西蘭大白兔，體質量為1.60- 2.49 kg，平均(1.73±0.26) kg，

19、雌雄隨機，由鄭州大學附屬醫院動物實驗中心提供。飼養嚴格遵守相關標準進行飼養，合格證號為豫飼審(2008) 01095。對新西蘭大白兔進行等條件喂養，對動物處理符合關于善待實驗動物的指導性意見中相關規則16-17。將30只新西蘭大白兔采用隨機對照方法將新西蘭大白兔分為纖維樣組織組和脫細胞基質組織組，每組15只。脫細胞基質材料修復軟骨缺損實驗用儀器和試劑：儀器和試劑來源酶聯免疫檢測儀美國GIBCO公司胎牛血清(FCS)杭州四季青公司生產常規手術器械上海醫療器械廠CO2細胞培養箱、低溫高速離心機德國Hera公司生產1.4 實驗方法1.4.1 軟骨脫細胞基質支架的制備 將牛膝關節軟骨(鄭州大學第一附屬

20、醫院實驗室提供)進行反復沖洗，并放粉碎機中進行粉碎，然后放入pH 7.5、溫度為4 無菌PBS中浸泡，離心5 min，速度2 000 r/min，去除沉淀。將上層軟骨碎片再次進行5 min離心，速度為8 000 r/min，篩選出直徑在100-154 m的軟骨粒，根據改進的Courtman改良法進行脫細胞處理18-19。向獲得的軟骨粒中加入含濃度為0.25%胰蛋白酶和0.03%EDTA的PBS，震蕩1 h，離心3次，速度為7 000 r/min，采用PBS進行沖洗20。在4 下加入濃度為1%的Triton X-100及10 mmol/L的Tris-HCl(pH=7.5)和濃度為0.035%的P

21、MSF，震蕩24-72 h，離心后采用PBS沖洗21-22。在37 下放入濃度為50 U/mLDNA 酶及1 U/mL RNA 酶，消化12 h，離心后采用PBS沖洗23。在溫度4 下加入濃度為1%的Triton X-100 的10 mmol/L的Tris-HCl (pH=7.5)，震蕩24 h、沖洗后獲得白色粉末狀沉淀。將其放入磨具中，冷凍、烘干后獲得三維多孔支架材料。將獲得的材料進行沖洗、冷凍、消毒后備用24-25。1.4.2 脫細胞基質組織工程材料組織學觀察 蘇木精-伊紅染色：將細胞接種在培養皿內24 mm×24 mm的蓋玻片上，添加軟骨培養基和成骨培養基，誘導24 h。取蓋玻

22、片，PNS漂洗2次，采用蘇木精染核10 min，采用流水浸洗2 min。滴加蘇木精染色5 min后，流水浸洗1 min，依次放置在乙醇、二甲苯中脫水、透明，采用中性樹膠封固。甲苯胺藍染色：取蓋玻片，PBS沖洗2次，滴加濃度為1%甲苯胺藍溶液5 min，流水浸洗 1 min，浸入5 min丙酮溶液中，流水浸洗1 min，吹干后根據二甲苯、順序分別進行2 min透明，采用中性樹膠封固。1.4.3 脫細胞基質組織工程材料理化性能檢測 孔隙率：將支架材料采用濃度為3.0%戊二醛進行24 h固定，將其放置在掃描電鏡下觀察，觀察后選取3個視野，每個視野測量10個孔徑，測定孔隙率。溶脹率：將支架浸在雙氧水中

23、24 h，濾紙吸干表面水分稱質量1次，記為mw，凍干取出后稱質量1次，記為md，溶脹率= (mw-md)/md×100.0%。1.4.4 新西蘭大白兔建模及處理方法 將入選新西蘭大白兔均采用體積分數為3.6%水合氯醛進行全身麻醉，待麻醉生效后進行消毒、鋪巾。大白兔仰臥固定在手術臺上，在膝關節內側作為手術切口，逐層切開皮膚、皮下及關節囊，保證大白兔膝關節屈曲達到70°，充分暴露股骨髁的位置，采用消毒后的骨鉆在大白兔股骨髁部位制作一個直接為4 mm的骨髓腔全層缺損，建立新西蘭大白兔骨關節軟骨損傷模型26。采用無菌紗布止血后纖維樣組織組采用纖維樣組織(鄭州大學第一附屬醫院實驗室提

24、供)修復，脫細胞基質組織組采用脫細胞軟骨基質支架修復。大白兔手術完畢后采用小針縫線進行固定，并將多所有動物逐層縫合頸前組織和皮膚，并經過耳緣靜脈注射160×104 U青霉素27-28。1.4.5 兩組材料吸光度(A值)比較 取脫細胞基質組織組和纖維樣組織組支架材料采用二甲基雅蘭法帶正電染料結合，產生顏色，利用紫外分光光度計檢測，在 480 nm波長下檢測A值。1.5 主要觀察指標 脫細胞基質組織工程材料大體情況；脫細胞基質組織工程材料組織學觀察；脫細胞基質組織工程材料理化性能；兩組支架材料A值比較；兔骨關節缺損修復12周后大體和組織學觀察。1.6 統計學分析 采用SPSS 18.0軟

25、件處理搜集的數據，計數資料行卡方檢驗，采用n(%)表示，計量資料行 t 檢驗，采用±s表示，P < 0.05表示差異有顯著性意義。2 結果 Results 2.1 實驗動物數量分析 實驗選用新西蘭大白兔30只，實驗過程中途無脫落，全部進入結果分析。2.2 脫細胞基質組織工程材料大體觀察 脫細胞基質組織工程材料交聯后呈現為深藍色，疏松多孔，直徑為5 mm，硬度適中，具備一定的彈性，見圖1。2.3 脫細胞基質組織工程材料組織學觀察 蘇木精-伊紅染色下脫細胞基質組織工程材料相互連接成網，軟骨細胞消失，軟骨巢不清晰，但是脫細胞基質組織工程材料中不含有細胞碎屑及藍染的核物質，不存在殘留的

26、細胞外基質。甲苯胺藍染色為藍色，見圖2。2.4 脫細胞基質組織工程材料理化性能檢測 脫細胞基質組織工程材料支架孔隙率為90%，溶脹率為 (1 314±337)%。2.5 兩組支架材料A值比較 脫細胞基質組織組材料1，3，5，7，9 d 的A值顯著高于纖維樣組織組(P < 0.05)，見表1。提示：脫細胞基質組織組材料中脫細胞基質濃度較高。2.6 兩組大白兔骨關節軟骨缺損的修復大體觀察 兩組大白兔術后1 d均可以站立，3 d后正常行走，手術傷口均未發生感染，愈合良好，兩組大白兔術后動物正常飲食，并未發生手術不良反應。2.7 大白兔骨關節缺損修復12周后組織學觀察 纖維樣組織組兔缺

27、損明顯，纖維瘢痕基本形成并充填在缺損中。脫細胞基質組織組修復12周后缺損部位存在白色組織覆蓋，表面光滑，缺損面基本修復，與正常組織邊界不明顯，見圖3A。甲苯甘藍染色顯示藍染，細胞細小變平，軟骨下骨骨結構與軟骨連接良好，直接基本降解，見圖3B。3 討論 Discussion支架材料是組織工程中常見的修復方法，患者修復過程中不僅會會影響修復體生物學特性，還會對生長增殖能力產生影響。理想的支架應該具備以下特性：良好的生物相容性29-30。植入支架材料具備降解性，對機體無毒副作用，不會對其他組織產生免疫排斥反應。生物可溶性31。植入的支架材料需要具備與組織細胞再圖1 脫細胞基質組織工程材料大體觀察Fi

28、gure 1 Gross observation of the tissue-engineered acellular matrix material圖2 脫細胞基質組織工程材料組織學觀察(×50)Figure 2 Histological observations of the tissue-engineered acellular matrix material (×50)圖注：圖A為蘇木精-伊紅染色；B為甲苯胺藍染色。圖3 脫細胞基質組織組大白兔骨關節缺損修復12周后觀察Figure 3 Observation of articular cartilage injur

29、y in the acellular matrix group at 12 weeks after repair圖注：圖A為脫細胞基質組織組大體觀察；圖B為脫細胞基質組織組大白兔骨關節缺損修復12周后細胞學觀察(×100)。表1 兩組修復材料不同時間段A值比較 (±s，n=15)Table 1 Comparison of the absorbance values between two materials at different time points after repair時間脫細胞基質組織組纖維樣組織組tP1 d0.55±0.080.41±0.

30、0723.04< 0.053 d1.13±0.081.04±0.0619.88< 0.055 d1.72±0.091.63±0.0622.76< 0.057 d1.78±0.091.64±0.0719.31< 0.059 d1.87±0.051.71±0.0420.48< 0.05生速度相同的降解速度。生物相容性好32。支架材料具有多孔結構特性，孔隙率為85%以上，能夠為種子細胞的生長提供足夠的空間33-34。此次研究中，脫細胞基質組織工程材料支架孔隙率為90%，溶脹率為(1 314&

31、#177; 337)%。植入材料具備一定的可塑性和機械強度。具有承載生長因子能力。脫細胞基質是近年來研究較多的一種生物學材料，該材料具有低抗原性、良好的生物相容性、細胞吸附性等優點35。脫細胞基質和人工材料相比具有其獨特的優勢，這種材料十分適合種子細胞的生長36。為了達到組織工程應用所要求的參數，天然材料需要在使用前進行交聯，交聯后能有效的提高生物材料的抗降解能力，最大限度的保留生物相容性特點。研究中，蘇木精-伊紅染色下脫細胞基質組織工程材料相互連接成網，軟骨細胞消失，軟骨巢不清晰，但是脫細胞基質組織工程材料中不含有細胞碎屑及藍染的核物質，不存在殘留的細胞外基質37-38。甲苯胺藍染色為藍色。

32、支架不僅需要具備良好的生物相容性，能夠促進生長組織生長，為細胞提供三維空間結構，具備一定的增殖分化能力。研究中，通過透析法將牛骨形態發生蛋白有效的復合到脫細胞軟骨基質支架后，由于牛骨形態發生蛋白的強大的促進 細胞增殖作用，能在支架生長旺盛，很短的時間內形成覆蓋在支架表面，促進骨缺損部位的修復，提高支架的生物活性39。研究實驗組修復12周后缺損部位存在白色組織覆蓋，與正常組織邊界不明顯。甲苯甘藍染色顯示藍染，細胞細小變平，軟骨下骨骨結構與軟骨連接良好，直接基本降解。由此看出：脫細胞基質組織工程材料在骨關節軟骨損傷修復中的臨床效果40。研究中兩組大白兔術后1 d均可以站立，3 d后正常行走，手術傷

33、口均未發生感染。綜上所述，脫細胞基質組織工程材料具有良好的生物相容性、細胞吸附性以及親水性，而在骨關節軟骨損傷修復中得到應用，能促進損傷部位的修復效果，是一種適用于骨關節軟骨損傷的修復材料，具有較高的臨床應用價值。作者貢獻：設計、實施、評估均為本文作者，實驗采用盲法評估。利益沖突：所有作者共同認可文章內容不涉及相關利益沖突。倫理問題：實驗動物在戊巴妥納麻醉下進行所有的手術，并盡一切努力最大限度地減少其疼痛、痛苦和死亡。文章查重：文章出版前已經過CNKI反剽竊文獻檢測系統進行3次查重。文章外審：文章經國內小同行外審專家雙盲外審，符合本刊發稿宗旨。作者聲明：第一作者對研究和撰寫的論文中出現的不端行

34、為承擔責任。論文中涉及的原始圖片、數據(包括計算機數據庫)記錄及樣本已按照有關規定保存、分享和銷毀，可接受核查。文章版權：文章出版前雜志已與全體作者授權人簽署了版權相關協議。4 參考文獻 References1 李海鵬,孫天勝.朱娟麗.等.關節鏡檢查不同年齡段患者膝關節軟骨損傷特點J.中國骨傷,2012,25(11):903-905.2 Menetrey J，Unno-Veith F，Madry H，et al.Epidemiology and imaging of the subchondral bone in articular cartilage repair.Knee Surg Spo

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