1、腫瘤耐藥性1腫瘤耐藥性機理化學療法是治療癌癥的首選方法，由于腫瘤出現的耐藥性限制了最終治療效果。腫瘤對化療藥物的耐藥性可以分為兩大類：內在的或獲得性的耐藥性。內在的耐藥性是腫瘤在接受化學藥物治療之前已預先存在抗藥性中介因子，導致腫瘤細胞的化學治療失效。獲得性的耐藥性是最初治療敏感的腫瘤在治療期間出現突變現象和各種適應性反應，化療藥物再次治療時難以發揮作用，從而導致治療失效和腫瘤難以被治愈。研究耐藥性的機理發現，腫瘤細胞主要通過降低藥物在細胞內的富集量、降低藥物的生物活性、破損DNA的自修復機制和抑制凋亡過程來實現對化療藥物的耐藥性和抑制自身凋亡(Figurel-5)。EffluxpumpsAl

2、tarvdMiluyclodwchpnU*AHoratlonaInnT»FTlb4iiF>VItpid*InmMawi*ahefedi.drugtJirgMaInducHCMi創ttn«rg*r>cyrespcnse甘呂ifb毎Repa-lrofdam»gtIncreased<xxx»ooApoplDsifilHihEbn#dOecrensBdLupkeFigure1-5Thiscartoonsummarizesmanyofthewaysinwhichculturedcancercellshavebeenshowntobecomeres

3、istanttocytotoxicanticancerdrugsTheeffiuxpumpsshownschematicallyattheplasmamembraneincludeMDR，1MRPfamilymembers，andMXR(ABCG2)，whichispresumedtofunctionasadimer1.1 降低藥物在細胞內的富集量腫瘤細胞通過降低對化療藥物的攝取和提高對胞內藥物的排出，來減少藥物在細胞內的富集量和作用量，從而產生耐藥性。水溶性藥物以擴散、受體或轉運蛋白介導的主動運輸或內吞作用方式進入細胞，而耐藥性癌細胞常表現出藥物受體或轉運蛋白變性，抑制了藥物被腫瘤細胞攝取。

4、例如，化療藥物順鉑通過細胞膜表達的銅轉運蛋白介導的方式進入細胞，而對順鉑顯示耐藥性的腫瘤細胞內銅轉運蛋白的表達量遠低于非耐藥性的腫瘤細胞，從而導致順鉑藥物難被耐藥性腫瘤細胞攝取。只有少量的抗癌藥物通過內吞作用進入細胞，例如抗毒素以受體介導的內吞方式被細胞攝取，癌細胞的變性則會導致內吞作用的缺失，從而產生耐藥性。多種細胞膜轉運蛋白具有促進細胞外排化療藥物的能力，常與化學治療的耐藥性有關。作為跨膜蛋白質的一種，具有ATP能量依賴性的轉運蛋白質家族主要調節多種結構和作用機理不相關化療藥物的血漿膜通量。轉運蛋白質家族有49個成員，目前研究發現只有MDRl（P-糖蛋白和ABCBl）、MRP1和BCRP三

5、種蛋白與耐藥性有關系。它們均具有廣泛、重疊的底物特異性，促進細胞排出各種疏水性化合物，其中包括大部分癌癥化療藥物如紫杉烷、拓撲異構酶抑制劑和抗代謝物。1.2降低藥物的活性耐藥性機理的另一重要部分是耐藥性腫瘤細胞對藥物的解毒作用，降低藥物的生物活性抗癌藥物體內失活機理是相對復雜的，細胞可以改變藥物、降解藥物，或者通過藥物和細胞內的分子或者蛋白質發生作用，降低藥物的生物活性。不同藥物的胞內解毒機理不同，例如鉑類藥物被細胞內含巰基的物質（還原型谷胱甘肽GSH、金屬硫蛋白MT）解毒，這主要是因為GSH和MT能與活性的順鉑發生配位作用，生成非活性的鉑類物質，進一步被泵出胞外。卡培他濱是抗代謝藥物氟尿嘧啶

6、的前藥，能在細胞內胸苷磷酸化酶的作用下轉化成活性藥物，若編碼胸苷磷酸化酶的基因被甲基化，將會導致酶失活和引起細胞對卡培他濱的抗藥性。然而，這種表觀遺傳基因沉默具有腫瘤特異性，可以通過DNA甲基轉移酶抑制劑來逆轉。1.3破損DNA自修復機制多數抗癌藥物通過直接或間接的方式損傷DNA,促使細胞凋亡。例如鉑類藥物直接絡合DNA,抑制DNA的轉錄和翻譯；DNA拓撲異構酶抑制劑作為抗癌藥物，抑制DNA拓撲異構酶的活性，間接影響遺傳過程中DNA的斷開和再連接。細胞對DNA損傷會做出修復或細胞凋亡的反應，癌細胞的DNA自修復能力影響損傷DNA類抗癌藥物的治療效果。一些化療藥物誘導DNA雙鏈上的鳥嘌吟烷基化，

7、6-甲基鳥嘌吟DNA甲基轉移酶（MGMT）激活的DNA修復機制能修復烷基化的核苷酸，將烷基化鳥嘌呤轉換回鳥嘌呤，抑制癌細胞凋亡。MGMT的過度表達已經被證明可以保護造血干細胞免受烷基化劑的影響；同時，許多腫瘤細胞也有較高水平的MGMT，促使腫瘤對烷基化抗癌藥物產生耐藥性。基于鉑類藥物的腫瘤化學治療，順鉑引起的DNA雙鏈損傷經核苷酸剪切修復和同源重組機制作用，能重新復制成完整的DNA雙鏈，抑制細胞凋亡。DNA損傷導致細胞周期阻滯，但細胞仍有時間來修復DNA損傷。對于某些癌癥，腫瘤基因功能的改變會干擾細胞周期阻滯的調節，從而產生耐藥性。例如，p53蛋白的突變影響細胞周期阻滯檢查點，破壞DNA損傷誘

8、導的細胞周期阻滯。p53蛋白也參與誘導細胞凋亡，它的突變經常與化療藥物的耐藥性有關。1.4抑制凋亡過程細胞凋亡有兩種既定的途徑：一種由線粒體介導的內在途徑，包括B細胞淋巴瘤-2(BCL-2)家族的蛋白質、caspase-9和Akt,以及一種與細胞表面的死亡受體有關的外在途徑。內在和外在的途徑都是通過激活下游的caspase-3蛋白，啟動促凋亡過程，最終導致細胞凋亡。與細胞凋亡相關的蛋白變性或者過度表達將會導致細胞凋亡過程受阻，從而產生腫瘤化學治療的耐藥性。研究表明，BCL-2蛋白具有阻止線粒體釋放細胞色素C和中斷細胞凋亡信號的能力，過度表達抗凋亡BCL-2蛋白將導致白血病細胞和老鼠的胸腺細胞對

9、化療藥物產生耐藥眭。2納米藥物載體用于克服腫瘤耐藥性為了克服腫瘤細胞出現的耐藥性缺陷和有效治療腫瘤，大量關于新藥開發和以更有效的方式向腫瘤部位輸送化療藥物的策略被提出。從藥物輸送的角度來看，將納米粒子與藥物結合可以改善腫瘤部位的藥物輸送和減少藥物被泵出腫瘤細胞，最終提高抗癌藥物在腫瘤細胞的作用量；將多種藥物裝載入納米藥物載體可以實現聯合治療，提高治療效果；利用納米藥物輸送體系靶向干細胞和阻止腫瘤細胞與周圍環境的聯系，可以有效抑制腫瘤的生長和克服耐藥性缺陷。2.1 提高細胞內藥物聚集體外實驗表明高濃度的抗癌藥物能抑制耐藥性癌細胞的增長，可以猜測任何耐藥性的癌細胞都能被高濃度的藥物殺死，實現腫瘤耐

10、藥性的逆轉。由于抗癌藥物對健康組織也會有損傷，限制了治療時的藥物劑量，因此藥物在腫瘤部位的高濃度富集對克Nile瘤耐藥性至關重要。腫瘤血管特有的多孔結構促使小分子和納米粒子在血液循環過程中通過EPR效應可以泄露到腫瘤組織；而腫瘤組織缺少淋巴細胞，小分子和納米粒子在到達腫瘤組織后又能在腫瘤組織富集。小分子藥物在體內很快被代謝掉，循環時間較短，EPR效應對腫瘤的治療效果幫助不大。為了延長藥物在機體的血液循環時間，納米藥物載體是合適的選擇。“隱形”納米藥物載體不受腎臟過濾、血漿降解和網狀內皮系統清除的影響，能延長裝載藥物的血液循環時間，實現腫瘤組織的被動靶向，同時減少被非作用位點細胞的攝取。將納米粒

11、子外層修飾親水性的聚乙二醇形成“隱形”納米藥物載體，可以避免納米藥物載體與血漿蛋白發生疏水性和靜電相互作用，逃脫網狀內皮系統的“監視”和清除。“隱形”納米藥物載體的血液循環時間受PEG鏈的長度和PEG鏈在納米粒子表面的密度影響，研究發現分子量為2.5KDa的PEG鏈適合修飾納米藥物載體，顯示最優的治療效果；同時尺寸為50-150nm的納米粒子更有利于在腫瘤組織部位富集。納米藥物輸送體系通過被動靶向在腫瘤組織大量聚集，對克服腫瘤的藥物耐藥性具有重要意義。細胞外高濃度的抗癌藥物增強了通過細胞膜的藥物擴散，提高了耐藥性腫瘤細胞對抗癌藥物的攝取量；飽和了基于P糖蛋白(PgP)的細胞內藥物泵出，減少藥物

12、流出細胞；克服由于藥物失活和藥物的靶向性低引起的耐藥性；克服由于凋亡過程缺失引起的耐藥性。同時，納米藥物輸送體系能在不產生明顯毒副作用和風險的前提下提高給藥劑量，為治療耐藥性腫瘤提供了可行性方法。例如，PEG修飾的脂質體負載DOX藥物(Doxil)在體內的血液循環時間是DOX的300倍，在腫瘤組織的富集量提高了10-15倍，最終導致更好的腫瘤治療效果，能抑制耐藥性腫瘤的生長。對于血管化的腫瘤，納米藥物輸送體系通過EPR效應，實現被動靶向；而對于血管化較少的腫瘤(例如結腸癌和胰腺癌)，納米藥物輸送體系很難實現被動靶向的目的。由于腫瘤各處血管壁通透性不同，藥物在腫瘤部位分布不均勻，很難實現完整而高

13、效的腫瘤治療，通過配體-受體之間識別作用的主動靶向策略被提出來解決此問題。將諸如抗體、適配體、多肽和碳水化合物等配體共價鍵結到納米藥物輸送體系的表面，促進了納米藥物輸送體系被腫瘤細胞攝取。目前已報道了大約有100種以上配體和受體具有專一性識別能力。腫瘤細胞過度表達某些抗原，基于抗原.抗體之間的識別作用，將納米粒子表面修飾抗體能提高其在腫瘤組織的聚集量。結腸癌、B細胞淋巴瘤和轉移性的肺癌分別過量表達CC52抗原、CD19抗原和34A抗原，可以將對應的抗體修飾到納米藥物輸送體系實現對腫瘤組織的主動靶向。Park等報道了乳腺癌細胞對HER2抗體修飾的免疫脂質體粒子的攝取量是未修飾的免疫脂質體粒子的7

14、00倍，這主要是乳腺癌細胞過量表達HER2抗原；靜脈注射后，未修飾的脂質體粒子被巨噬細胞識別和很難進入腫瘤細胞，而HER2抗體修飾的脂質體粒子主要分布于腫瘤細胞的細胞質中，從而提高了腫瘤治療效果，克服了耐藥性問題。基于非特異性的細胞滲透多肽TAT與細胞膜兩側的磷脂具有相互作用，TAT多肽容易以易位的方式進入細胞，利用TAT多肽修飾抗癌藥物或納米粒子能提高腫瘤細胞對藥物的攝取量，增加藥物在作用位點的給藥劑量，提高腫瘤的治療效果和逆轉腫瘤出現的耐藥性。例如，Lee等設計了pH超敏感性多功能聚合物膠束粒子負載DOX，用于腫瘤特定酸性環境暴露耵汀多肽，提高腫瘤細胞對載藥粒子的攝取量，實現逆轉腫瘤細胞對

15、化療藥物的耐藥性。聚合物膠束由聚合物PLA-PEG-PHis-TAT(PLA:聚乳酸，PHis:聚組氨酸、PEG-PHis和DOX共組裝而成，在血液循環過程中TAT多肽被隱藏在聚合物膠束粒子的內部；在腫瘤微酸性環境刺激下，TAT多肽暴露在聚合物膠束的表面，促進了聚合物膠束被腫瘤細胞攝取。2.2 多種藥物聯合治療與抗癌藥物被泵出細胞外有關的基因有ATP結合盒B亞家族l轉運蛋白基因(ABCBl，與P-gP有關)和ATP結合盒藥物轉運蛋白(ABCC1)，利用小干擾RNA(siRNA)技術和反義寡聚核苷酸(asODNs)可以降低耐藥性腫瘤細胞內ABCBl和ABCCl基因的表達,從而減少抗癌藥物被泵出細

16、胞外，克服腫瘤細胞的耐藥性。Davis等首次報道了基于納米輸送體系裝載siRNA用于治療轉移型黑色素瘤，納米輸送體系由環糊精-聚合物組裝而成，表面修飾PEG提高粒子的穩定性，表面修飾轉鐵蛋白賦予粒子對腫瘤細胞的靶向性。siRNA納米輸送體系能顯著沉默目標基因M2核苷酸還原酶，顯示出較好的腫瘤治療效果。這說明了通過沉默耐藥性基因來提高腫瘤治療效果策略的可行性。進一步，Yadav等利用PEG-PbAE(PEG：聚乙二醇，PbAE：聚氨基酯)納米粒子負載與ABCBl有關的siRNA，靜脈注射24h后再次靜脈注射裝載紫杉醇藥物的PEG-PCL(PCL:聚己內酯)納米粒子。實驗發現設計的體系能完全沉默體

17、內的耐藥性基因，明顯提高紫杉醇藥物對耐藥性卵巢癌細胞的毒性，達到對耐藥性卵巢癌細胞的毒性與非耐藥性細胞的相當oPatil等設計了同時裝載siRNA和紫杉醇藥物的PLGA(聚-丙交酯-CO-乙交酯)藥物輸送體系，載藥粒子表面修飾生物素提高了對腫瘤細胞的靶向性。裝載siRNA和紫杉醇的納米藥物輸送體系對耐藥性腫瘤細胞的毒性遠高于只負載紫杉醇的納米藥物輸送體系，能明顯抑制耐藥性腫瘤的生長。中斷細胞凋亡信號(與BCL-2和缺氧.誘導因子HIFIa的表達有關)會導致腫瘤細胞出現耐藥性。BCL-2家族蛋白調控細胞程序性死亡，HIFIa編碼轉錄因子，對細胞適應缺氧狀態起重要作用1261。通過小干擾RNA(s

18、iRNA)技術和反義寡聚核苷酸(asODNs)法可以調節細胞內BCL-2和HIFIct的表達，從而調控抗癌藥物引起的細胞凋亡。Chen課題組通過多孔硅納米粒子裝載與BCL-2相關的siRNA和DOX，聚酰胺胺樹枝狀分子(PAMAM)作為次級載體，分別通過靜電相互作用和化學反應負載siRNA和DOXo實驗發現納米粒子裝載的siRNA能顯著抑制耐藥性腫瘤細胞BCL-2信使基因的表達，克服了由P糖蛋白介導的藥物泵出所引起的耐藥性；納米粒子通過內吞作用進入細胞，DOX主要分布在細胞核附近，避免被細胞膜表面的P糖蛋白泵出細胞外，提高了DOX的藥物活性；設計的多級納米粒子能抑制對DOX顯示耐藥性的乳腺癌細

19、胞的生長，細胞毒性是DOX的132倍。轉錄因子NF-kB參與細胞對外加刺激的反應，如壓力、細胞因子、自由基、紫外線照射和微生物抗原、調節關鍵蛋白質的表達(BCL-2、BclXL、細胞凋亡抑制劑clAPs、生存素、TRAF、Cox-2、MMP9和誘導型一氧化氮合酶)和細胞周期調控因子。NF-KB調節異常與慢性炎癥、自身免疫性疾病、腫瘤產生、腫瘤增長以及化學治療中涉及的腫瘤耐藥性相關。因此，轉錄因子NF-kB已成為腫瘤治療的新作用位點，利用NF-kB抑制劑調節抗腫瘤反應和增強腫瘤對抗癌藥物的敏感性。吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)作為NF-kB抑制劑，通過抑制NF-kB釋放IKBct阻斷NF-k

20、B的活性，誘導細胞凋亡。Fan等利用葉酸修飾的殼聚糖納米粒子裝載DOX和PDTC，載藥粒子通過靶向性內吞作用被耐藥性腫瘤細胞攝取，在酸性內涵體和細胞液環境刺激下實現藥物的可控釋放；DTC抑制NF-kB的活性，克服了細胞耐藥性，提高釋放的DOX治療效果。實驗結果顯示殼聚糖納米粒子在中性或堿性條件下緩慢釋放DOX藥物，在酸性環境下實現藥物快速釋放，2h內大約有75.95%的藥物被釋放出來，這主要是由于在中性和堿性環境下，殼聚糖聚合物的臨界聚集濃度低于酸性環境；葉酸的引入賦予納米粒子靶向性，提高納米粒子被腫瘤細胞攝取；相比于DOX和只負載DOX的納米粒子，同時負載DOX和PDTC的納米粒子對耐藥性腫

21、瘤細胞顯示出最高的細胞毒性，說明同時負載NF-KB抑制劑和DOX藥物的納米粒子能逆轉腫瘤細胞的耐藥性。2.3靶向腫瘤干細胞和阻止癌細胞與周圍環境的聯系腫瘤干細胞對各種腫瘤治療具有抵抗性，而傳統的化學療法往往無法將它們摧毀。腫瘤干細胞的耐藥性通過增加Wnt/13-catenin和Notch信號、改變DNA修復機制和延緩細胞增殖來實現。一項對骨肉瘤細胞的研究表明，抗腫瘤藥物沙利霉素可以靶向干細胞，通過Wnt/13-catenin信號通路的中斷來抑制腫瘤細胞的生長增殖。因此，Zhang等設計了奧曲肽修飾的聚合物膠束粒子負載沙利霉素和紫杉醇藥物，膠束粒子能有效地靶向從乳腺癌細胞分離出的腫瘤干細胞(CD

22、44+/CD24-),對腫瘤的治療效果明顯優于沙利霉素藥物和紫杉醇。用奧曲肽修飾負載聚合物膠束粒子賦予了聚合物膠束粒子對癌細胞內過表達的生長激素抑制因子受體的靶向能力，提高了細胞對膠束粒子的攝取量，可以同時治療腫瘤細胞和腫瘤干細胞，克服了腫瘤細胞的耐藥性。癌細胞周圍的支持間質和血管為癌細胞提供能量和進行物質交換，促進癌細胞生長和增殖，若阻止癌細胞與周圍間質和血管的聯系，就能克服癌細胞的耐藥性。眾所周知，成熟的B-細胞惡性腫瘤通過CXCR4信號與周圍環境進行交流獲取能量，而基質細胞位于骨髓微環境中，能分泌CXCR4的配體一基質細胞因子，促使癌細胞轉移到骨髓，并在骨髓處生長和獲得耐藥性信號。CXCR4拮抗劑作為納米藥物的重要補充可以破壞腫瘤與周圍環境的相互作用，迫使白血病細胞返回血液，提高了細胞對化療藥物的敏感性。Jai等利用白蛋白和通過具有酸性環境響應性的腙鍵連接DOX的細胞周期蛋白肽組裝成納米藥物載體，其中細胞周期蛋白肽可靶向血小板源生長因子受體。由于靶向識別作