1、熒光分析與化學發光分析馮振濤馮振濤1203180234 6-1 概 述 在前兩章中我們討論了物質對電磁輻射的吸收。吸收輻射能后，處于電子激發態的分子在返回基態時以發射輻射的方式釋放這一部分能量，發射的輻射波長可以同分子所吸收的輻射波長相同，也可不相同，這一現象稱為光致發光。最常見的兩種光致發光現象是熒光和磷光。這兩種光致發光過程的機理不同(見6-2)，可通過實驗觀察激發分子壽命的長短來加以區別。對于熒光，當激發光停止照射后，發光過程幾乎立即停止(10-9 10-6)，而磷光則將持續一段時間(10-3 10s)。 一般所謂熒光現象是指物質吸收紫外光后所發射出的可見熒光，以及吸收波長較短的可見光后

2、所發射出的波長較長的可見光熒光。但實際上熒光現象并不限于這些情況。有些物質吸收了比紫外光波長短得多的光后，發射出波長比所吸收的光波長稍長的光，這稱為光熒光，并據此建立了光熒光分析法(有關此法的詳細討論見第十四章)。此外，有些物質吸收了紅外光后發射出波長稍長的紅外光，這稱為紅外光熒光。近年來，隨著紅外探測器靈敏度的不斷提高，紅外光熒光分析法已應用于許多有機物質的結構分析。 由于物質分子的結構不同，所吸收的紫外光波長和發射的熒光波長也有所不同，利用這個特征可以對物質進行定性鑒定。同一種分子結構相同的物質，用同一種波長的紫外光照射激發，可發射特征波長的熒光，其強度與物質的量有關。據此，可利用某些物質

3、被紫外光照射后所發射的能反映出該物質特性的熒光進行定性以及定量分析，這種分析稱為熒光分析。 化學發光分析是利用化學發光現象進行分析測定的一類方法。與熒光分析一樣，屬于發光分析的范疇。化學發光與熒光分子的發光相似，他的大部分性質和熒光相同，不同點在于熒光的激發能來自外光源的激發(照射)，而化學發光的激發能則產生自化學反應，也即某些物質在進行化學反應時，由于吸收了反應時產生的化學能，使分子或原子被激發，這種受激分子或原子返回基態時，以光輻射的方式釋放能量。其光輻射的能量及光譜范圍由化學反應的物質所控制(處于可見光區)。每一個化學反應都有其特征的化學發射光譜，其發光強度則與物質的濃度有關，這是化學發

4、光分析的依據。 此外還有其他類型的發光: 生物發光、熱致發光、放射發光(放射性分解引起激發)、聲致發光(聲波激發)、點發光(電激發)、摩擦發光(機械能激發)等。其中生物發光在分析化學中得到重要的應用，在生物發光中導致激發態的化學反應是在生物體內進行的。 磷光現象也被用于分析目的，但應用范圍有限。6-2 熒光分析法一基本原理二熒光定性分析 三熒光定量分析四熒光計與熒光分光光度計 1. 熒光的發生 處于基態的分子吸收一定波長的輻射能后。電子發生躍遷。此時由 原來的能級躍遷至第一電子激發態或第二電子激發態中各個不同振動 能級和各個不同的轉動能級，如圖6-1中(a)和(b)所示。分子在吸收了 光而被激

5、發至第一或更高的電子激發態的各個振動能級之后，通常急 劇降落至第一電子激發態的最低 振動能級，在這一過程中他們和 同類分子或其他分子(例如溶劑分 子)碰撞而消耗了相當于這些能級 之間的能量，因而不發射光(無輻 射躍遷，圖6-1中c)。由第一電子 激發態的最低振動能級繼續往下 降落至基態的各個不同能級時， 則以光的形式發射，所發生的光 即熒光(圖6-1中d)。某些物質的分子在被激發至較高的能級并通過無 輻射躍遷降落至第一電子激發態的最低振動能級之后，并不繼續直接 降落至基態，而是通過另一次無輻射躍遷至一個中間的亞穩的能級 三重態(圖6-1中e)。一、基本原理一、基本原理 已知電子激發態的自旋多重

6、性為2S+1，S是自旋量子數的代數和。大多數分子含有偶數電子，在基態時這些電子成對地存在于各個原子或分子軌道中。然而，根據保利不相容原理，在一個軌道上的這兩個電子的自旋是相反的，自旋量子數為+()和-()。由于自旋成對的結果，大多數分子的自旋量子數的代數和S=0，此時這個分子所處的電子能態稱為單重態(singlet state)，即2S+1=1。如果分子中有一個未成對的電子，則S=，而2S+1=2，此種狀態稱為雙重態(doublet state)。若分子中有兩個未成對的電子，此時S=1,2S+1=3，這種狀態稱為三重態(triplet state)。 在基態分子的一個電子吸收光輻射而被激發的過

7、程中，通常它的自選不變(S=0)，則激發態仍是單重態，如圖6-2所示。某些分子的激發單重態通過無輻射躍遷，在體系間跨越的過程中發生自選反轉，造成兩個電子自旋平行的狀態，也即是激發三重態(6-2)。 這些分子在三重態稍事逗留后，在發射輻射而下降至單重態各振動能級，所發射的光即為磷光(圖6-1中f)。因自三重態降落至單重態時所給出的能量比由單重第一電子激發態的最低振動能級直接降落至單重基態時所給出的能量小，所以磷光的波長比熒光波長長。如將溫度降低，則由三重態降落至單重態的時間將大為延遲，在很低的溫度下，這些分子有可能被“凍結”在三重態上。某些分子在躍遷至三重態后，通過熱激活作用可 以再回到第一電子

8、激發態的 各個振動能級，然后再由第 一電子激發態的最低振動能 級降落至基態而發射出熒光， 這種熒光就被稱為遲滯熒光 (圖6-1中g和f)。 如果把蒽的乙醇溶液裝入試管，并放在液氮中，并用紫外光照射，停止照射后，還能見到蒽溶液輻射出的橙色光，而光的強度隨時間的延長而逐漸變弱，最終消失為止。這種即使停止用光激勵，還能繼續發光的現象，就是蒽的磷光。圖6-3表明了蒽吸收了波長366nm的光，生成最低激發單重態S1， S1輻射熒光到基態，同時激發單重態S1體系間跨越到三重態T1，T1輻射磷光回到基態。 2. 熒光激發光譜和熒光發射光譜 熒光發射光譜簡稱熒光光譜，它表示該熒光物質所發射的熒光中各種不同波長

9、組分的相對強度，是以熒光強度對熒光波長所繪制的曲線。 如果把某物質的熒光光譜與他的吸收光譜進行比較，可發現這兩種光譜之間存在著密切的“鏡像對稱”關系。熒光光譜好像是吸收光譜照在鏡子中的像，但又比吸收光譜缺少了一些短波 長的吸收峰。圖6-4表示蒽的乙醇 溶液的熒光光譜和吸收光譜。 3. 化合物的熒光和化學結構的關系 產生熒光必須具備兩個條件。首先，物質分子必須具有能吸收紫外或可見光的生色基團；其次該物質應具有一定的熒光效率。分子中能發射熒光的基團，稱為熒光基團。熒光基團一定是生色基團，但生色基團未必一定是熒光基團。這是由于它的熒光效率不高，而將所吸收的能量消耗于與溶劑分子或其他溶質分子之間的相互

10、碰撞，因此不能發射熒光。 熒光效率(F)又稱為熒光量子產率，是熒光物質吸光后所發射的熒光量子數與所吸收的激發光的量子數的比值，即 F= 此外，一種物質吸收光的能力及量子產率又與物質所處的環境緊密相關，因為環境條件(如溶劑、pH、溫度等)常常是物質量子產率高低，甚至能否產生熒光的重要因素。發射的量子數吸收的量子數 熒光通常發生于具有剛性平面結構的電子共軛體系的分子中，隨著電子共軛度和分子平面度的增大，熒光效率也將增大，它們的熒光光譜也將移向長波方向。任何有利于提高電子共軛度的結構改變，都將提高熒光效率，使熒光波長向長波長的方向移動。 絕大部分的熒光(磷光)物質都是環狀化合物(芳香環或雜環)，芳香

11、環越多，熒光效率越高，熒光光譜也移向長波長方向(表6-1)。但環狀結構并不是發生熒光的絕對條件，如吡啶( )、呋喃( )、噻吩( )和吡咯( )是非熒光或弱熒光物質。但取代上苯基后，由于共軛體系的增大，熒光效率將大為增加。 例如苯并呋喃( )、吲哚硫茚的熒光和笨相近。 在芳香化合物的芳環上進行不同基團的取代，對該化合物的熒光強度和熒光光譜都將產生影響。通常有以下一些規律： (1) 給電子基團常使熒光增強，因為它們使最低激發單重態與基態之間的躍遷幾率增大。作用特別明顯的基團是-NH2和-OH。 (2) 同電子體系相互作用小的取代基如 -SO3H、 -NH3 和烷基等，對熒光影響小。 (3) 吸電

12、子基團如-COOH、-NO2、-N=N-及鹵素會減弱甚至破壞熒光。 (4) 重原子或雜原子引入到電子體系中常會減弱熒光，所以苯胺和苯酚的熒光較苯強20倍，而硝基苯、苯甲酸和碘代苯則是非熒光或弱熒光物質。表6-2表明取代基對苯的熒光的影響。+ 具有剛性平面結構的分子有利于熒光的產生。這可以比較熒光素和酚酞的結構來說明: 又如芴和聯苯在類似的測量條件下的熒光效率分別為1.0和0.2。這是由于芴上的亞甲基增強了分子的剛性的緣故。 有些有機分子本身不會發熒光，但與金屬形成絡合物后，由于增強了他的剛性并大大減少了分子的內振動作用，因而產生熒光。 前文已述，由于物質分子結構不同，所吸收的紫外波長和發射的熒

13、光波長具有特征性，因此根據熒光物質的激發光譜和發射光譜可鑒別化合物。最直接的熒光定性分析方法是將待分析的熒光發射光譜與預期化合物的熒光發射光譜相比較。這種方法比較簡便并常能取得較好的效果。圖6-5(a)(b)是從一個城市河流底泥試樣中以熒光法鑒定苯并()芘的實例。二、熒光定性分析二、熒光定性分析 圖6-5 苯并()芘和苯并()芘的熒光激發光譜及發射光譜 對于一些復雜的樣品來說，光譜鑒定有時會發生困難。可以采用標準加入的辦法。即在試樣中添加擬存在的組分，若此組分存在，則在添加該組分的純物質加入后，該物質的特征峰將加強。 同步掃描熒光法可使光譜簡化和窄化，是原來互相重疊的光譜分辨開來，從而提高了熒

14、光法的選擇。同步掃描法通常在固定時進行，此時使激發單色器和發射單色器的波長差(= Em- En)保持固定地同時進行掃描，所得譜圖稱為同步光譜，所測得的熒光信號為同步信號。 圖6-7 菲、蒽、苝的光譜圖圖6-8 萘、菲、蒽、苝、并四苯混合物的常規熒光光譜及混合物的同步光譜圖圖6-9 工廠區大氣樣品萃取物中強致癌物苯并()芘及其共存物的熒光光譜和同步光譜 1. 熒光強度與濃度的關系 熒光的發光是由于物質在吸光之后發射出波長較長的熒光，因此溶液的熒光強度與該溶液的吸光程度以及溶液中熒光物質的熒光效率有關。溶液被入射光(I0)激發后，可以在溶液的各個方向觀察到熒光強度(F)。但由于激發光源能量的一部分

15、被透過，因此，在透射光的方向觀察熒光是不適宜的。一般是在與激發光源垂直的方向觀測。 根據比耳定律，透過光的比例為 式中： I0為入射光(激發光)強度； I為透過光強度；C為濃度，b為液層厚度；為摩爾吸光系數。 相應地被吸收的部分是 將上式重新排列，可得被吸收的光的量為 I0-I= I0 (1-10 ) (6-3) 三、三、 熒光定量分析熒光定量分析II0- =10-b C-b C 1- - =1-10I0I-b C(6-2)(6-1) 總的熒光強度(F) 同試樣吸收的激發光的光量子數目和熒光量子效率(F)成正比 F = F(I0- -I)= I0 F(1- -10 ) (6-4) 將上式括弧中

16、指數項展開可得 F = I0 F (6-5) 對于很稀的溶液，投射到試樣溶液上被吸收的激發光不到2 時，也就是b C =A0.05時，括弧內第二項以后可以忽略不計，則上式可簡化為 F = 2.3 F b C I0 (6-6) 對于一定的熒光物質，當分析條件及儀器使用條件確定后，上式中F 、 、b 、I0 均為常數，當被測熒光物質的濃度C很小時(b C 0.05)，式(6-6)可寫作 F = kC (6-7) 即熒光強度與熒光物質的濃度呈線性關系。但當b C 增大時，從式(6-5)可以看出濃度與熒光強度之間呈非線性關系，若b C 很大時，式(6-5)成為 F = I0 F (6-8) 此時熒光強

17、度與濃度無關。因此在熒光分析中，熒光強度和濃度的線性關系僅限于很稀的試液。-b-b C C2.3 b C- - - - (- 2.3 b C )2!(- 2.3 b C )3!23 2. 影響熒光強度的因素 (1) 激發光照射的影響 對于容易分解的熒光物質的測定，應通過實驗確定能準確讀取熒光強度的方法。 (2) 溫度影響 通常熒光物質的溶液隨著溫度的降低而熒光強度增大。一般溫度升高1，熒光強度約下降1。 (3) 溶劑影響 一般來說，熒光強度隨著溶劑極性的增大而增強。 (4) 溶液pH的影響 當熒光物質為弱酸或弱堿時，溶液pH值的改變對熒光強度將有很大的影響。對于金屬離子與有機試劑形成的絡合物，

18、溶液pH值的改變還會影響到絡合物的組成，從而影響到它們的熒光性質。 (5) 各種發散光的影響 主要是散射光和拉曼光。降低方法:從儀器上考慮；從溶劑考慮。 (6) 熒光熄滅 熒光物質和溶劑或其它溶質分子的互相碰撞或電子轉移等作用引起的。鹵素離子、重金屬離子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物等都是顯著地熒光熄滅劑。 (7)熒光自滅 熒光物質的濃度大于1gL時，常發生熒光的自滅現象。 由上述可見，最適宜的測定條件如pH、溶劑、試劑的濃度、溫度以及熒光強度最大時所需的時間等都需要試驗來確定。 3. 定量分析方法 (1) 標準曲線法 熒光分析一般多采用標準曲線(工作曲線)法，尤其在測定大批樣

19、品的例行測定時更是如此。 (2) 直接比較法 取已知量的純熒光物質配制一標準溶液，使其濃度在線性范圍內，測定熒光強度(Fs)。然后在同樣條件下測定試樣溶液的熒光強度(Fx)。由標準溶液的濃度(Cs)和兩個溶液的熒光強度，求試樣中熒光物質的含量(Cx)。在空白溶液的熒光強度若未能使儀器讀數調至0，則必須從Fs及Fx值中扣除空白溶液的熒光強度(F0)，然后進行計算。根據式(6-6)可得 Fs - F0 = 2.3 F b I0 Cs Fx - F0 = 2.3 F b I0 Cx 因為對于同一熒光物質， F及 相同，且b 一定，故 (3) 熒光熄滅法 利用熒光熄滅現象可對某些物質進行定量測定。 (

20、4) 同步掃描熒光法 同步熒光信號的強度與欲測熒光物質的濃度(濃度很稀時)呈線性關系。但是，同步熒光法存在濃度效應。欲克服，只需將溶液適當稀釋即可。F F = 2.3 2.3 F F bb C C I I0 0 (6-6)Fs - F0 CsFx - F0 Cx = Cx = Cs (6-9)Fx - F0Fs - F0 測定熒光強度的儀器有目測熒光計、光電熒光計和熒光分光光度計等。它們主要由光源、濾光片、或單色器、樣品池及檢測器等部件組成。常用的熒光計是由濾光片、硒光電池及微電流計裝配成的光電熒光計，如圖6-12。 在測定微量熒光物質含量時，使用濾光片光電熒光計可得到滿意的結果。但如前所述，各種不同的熒光物質具有不同的熒光光譜和熒光激發光譜，為了研究某種熒光物質的特性，或在建立熒光分析方法時選擇合適的熒光波長，常需測繪熒光發射光譜和熒光激發光譜。此時需要使用熒光分光光度計。其構造原理圖如圖6-13。圖6-14為其儀器結構示意圖。在該儀器所做的光譜上，最高峰波長就是物質在最大激發波