1、多重PCR分析檢測和定量分析小定鞭金藻（定鞭藻門）的物種特異性孫勇摘要 多重PCR用于檢測和定量分析小定鞭金藻的物種和基因特異性，以基因組基因?yàn)槟０妫靡惶滓锾禺愋缘臄U(kuò)增四種具有基因特異性的PCR產(chǎn)物，通過普通PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過凝膠電泳可以產(chǎn)生診斷條帶，熒光分子標(biāo)記被用于實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR），通過分離小定鞭金藻及其相關(guān)物種，對其物種和基因特異性加以評價(jià)，用定量PCR進(jìn)行評估環(huán)境樣品中藻類數(shù)目可比從人工計(jì)數(shù)得到平均值有較低的標(biāo)準(zhǔn)偏差。這顯著的改善了基于DNA的檢測技術(shù)，通過快速同時(shí)測定四種特異性條帶，可以區(qū)分一些長期地理隔離的小定鞭金藻。引言 小定鞭金藻與世界范圍內(nèi)很多魚類的死亡，快速的

2、從水體中檢測出來該藻顯得十分必要，早期的檢測往往有缺憾，包括光學(xué)顯微鏡檢測溶血性檢測，但這些檢測方法對低濃度的金藻無能為力。有一些分子生物學(xué)的替代方案用于檢測，如實(shí)時(shí)定量PCR，為了擴(kuò)大檢測范圍改善檢測方法，使用多重?zé)晒釶CR，在普通PCR的基礎(chǔ)上加入多對引物，以增加遺傳標(biāo)記的數(shù)目，使PCR不需要經(jīng)過凝膠電泳就能分析，縮短了檢測時(shí)間。實(shí)驗(yàn)及結(jié)果先選取相應(yīng)引物，進(jìn)行單引物擴(kuò)增，獲得特異性條帶，并測定序列，單引物擴(kuò)增后多引物擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)及結(jié)果 多引物擴(kuò)增采用選取四個(gè)引物GMP1,SYNAP1,FUCO,GST，由于小定鞭金藻多以單藻形式生存，而常規(guī)PCR也不能給出相關(guān)藻類濃度方面的信息，所以根據(jù)所測

3、定的序列使用特異性熒光分子信標(biāo)，實(shí)時(shí)定量PCR（QPCR），根據(jù)熒光量得到相應(yīng)藻類的含量，用QPCR檢測了六個(gè)藻種（TX,SC,ME,UK,N1,N2,PAT）實(shí)驗(yàn)及結(jié)果 其中只有FUCO熒光信號在六個(gè)物種中均有存在，確定使用FUCO進(jìn)行QPCR，然后DNA的濃度梯度評估，細(xì)胞濃度梯度評估，以確定不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線，使他們可以用于定量未知樣本，得到DNA用量和細(xì)胞用量與信號強(qiáng)度的關(guān)系。DNA的量小于10pg大于50ng均得不到理想的曲線細(xì)胞用量小于100，大于10000個(gè)也得不到理想的曲線分別得到DNA用量和細(xì)胞用量與QPCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線然后測定信號大小根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到相應(yīng)藻類的量討論 討論本測定的效率隨地理隔離距離的增加而下降，也取決于探針的特異性和靈敏度，實(shí)驗(yàn)中可知每個(gè)探針的靈敏度是不同的，在此次實(shí)驗(yàn)中其他的地理植株沒有被探測就是因?yàn)闆]有選取到特異性比較好的探針（引物），進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)應(yīng)當(dāng)尋找更加保守的DNA區(qū)域，更敏感的引物。討論 本實(shí)驗(yàn)表明多重QPCR可以用于小定鞭金藻的檢測，快速切特異性好。傳統(tǒng)多重PCR需要7個(gè)小時(shí)完成，而多重QP