1、免疫學(xué)實驗免疫學(xué)實驗基本原理基本原理 它采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待它采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測定。測定的對象顏色反應(yīng)，用于定量測定。測定的對象可以是抗體也可以是抗原。可以是抗體也可以是抗原。在這種測定方法中有在這種測定方法中有3 3種必要的試劑：種必要的試劑：固相的抗原或抗體（固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）免疫吸附劑）酶標(biāo)記的抗原或抗體（酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）標(biāo)記物）酶作用的底物（酶作用的底物（顯色劑）顯色劑）l雙抗體夾心法，屬于非競爭結(jié)合測定。它是檢測抗原最常用ELISA，適用于檢測分子中具有至

2、少兩個抗原決定簇的多價抗原。其基本工作原理是：利用連接于固相載體上的抗體和酶標(biāo)抗體分別與樣品中被檢測抗原分子上兩個抗原決定簇結(jié)合，形成固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體免疫復(fù)合物。復(fù)合物的形成量與待測抗原的含量成正比。測定復(fù)合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物質(zhì)量(OD值)，即可確定待測抗原含量。實驗原理實驗原理 雙抗體夾心法實驗器材和藥品l固相載體在ELISA測定過程中作為吸附劑和容器。最常用的是聚苯乙烯和聚氯乙烯。它們有較強的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學(xué)活性。微量滴定板，量滴定板為812的96孔式。ELISA板的特點是可以同時進行大量標(biāo)本的檢測，并可在特制的比色

3、計上迅速讀出結(jié)果。聚苯乙烯經(jīng)射線照射后，其吸附性增加。酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原聯(lián)結(jié)的產(chǎn)酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物。具有酶促反應(yīng)，顯示出生物放大作用。物。具有酶促反應(yīng)，顯示出生物放大作用。在ELISA中，常用的酶為辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)和堿性磷酸酶(alkalinephosohatase,AP)。酶的底物1、HRP催化過氧化物的氧化反應(yīng)。供氫體：鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，最適吸收波長為492nmTMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍色，用HCL或H2SO4終止后，由藍色呈黃色，最適吸收波長

4、為405nm2、AP為磷酸酯酶一般采用對硝基苯磷酸酯(p-NPP)作為底物。產(chǎn)物為黃色的對硝基酚，在405nm波長處有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)陽性對照品(positivecontrol)和陰性對照品(negativecontrol)陰性對照品須先行檢測，確定其中不含待測物質(zhì)。陽性對照品在含蛋白保護劑的緩沖液中加入一定量的待檢物質(zhì)，含量約為最低檢測敏感度的1020倍。l洗滌液洗滌液常用的稀釋液為含0.05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液。l酶反應(yīng)終止液酶反應(yīng)終止液HRP反應(yīng)終止液為硫酸，一般采用2mol/LAP用NaOH終止實驗方法實驗方法:l1.加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于已包被之反應(yīng)孔中，置37孵育1小時。然后洗滌。(同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔)。2.加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml。37孵育0.51小時，洗滌。3.加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的底物溶液0.1ml，371030分鐘。4.終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。5.結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強，陰性反應(yīng)為無色或極淺。也可測OD值：在ELISA檢測儀上，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。DNM-9602GDNM-9602G酶標(biāo)分析儀酶