1、第五講 RNA的生物合成以DNA為模板，在依賴于DNA的RNA聚合酶的催化下合成RNA的過(guò)程，稱為轉(zhuǎn)錄（transciption）。把與m RNA序列相同的那條DNA鏈稱為編碼鏈（coding strand）或有意義鏈（sense strand），并把另一條根據(jù)互補(bǔ)原則指導(dǎo)m RNA合成的DNA鏈稱為模板鏈（template strand）或反義鏈（antisense strand）。貯藏在任何基因中的生物信息都必須首先被轉(zhuǎn)錄生成RNA，才能得到表達(dá)。除了少數(shù)的RNA病毒，所有RNA分子都來(lái)自DNA。儲(chǔ)存于DNA雙鏈中的遺傳信息通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則轉(zhuǎn)化為單鏈RNA分子。生物體內(nèi)共有3種RNA：

2、編碼特定蛋白質(zhì)序列的信使RNA（messenger RNA, m RNA），能特異性解讀mRNA中的遺傳信息、將其轉(zhuǎn)化成相應(yīng)氨基酸后加入多肽鏈中的轉(zhuǎn)移RNA（transfer RNA, t RNA），直接參與核糖體中蛋白質(zhì)合成的核糖體RNA（ribosomal RNA, r RNA）。一、RNA的轉(zhuǎn)錄無(wú)論是原核還是真核細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄的基本過(guò)程包括：模板識(shí)別、轉(zhuǎn)錄起始、通過(guò)啟動(dòng)子及轉(zhuǎn)錄的延伸和終止。1、 轉(zhuǎn)錄的特點(diǎn)2、 轉(zhuǎn)錄過(guò)程中所需物質(zhì)1） 底物2） 模板3） RNA聚合酶A 聚合酶的特點(diǎn)B 大腸桿菌RNA聚合酶大腸桿菌RNA聚合酶由2個(gè)亞基、一個(gè)亞基、一個(gè)亞基和一個(gè)亞基組成，稱為核心酶(core

3、 enzyme)。加上一個(gè)亞基后則成為聚合酶全酶（holoenzyme），相對(duì)分子質(zhì)量為4.65105。亞基可能與核心酶的組裝及啟動(dòng)子識(shí)別有關(guān)，并參與RNA聚合酶和部分調(diào)節(jié)金子的相互作用。實(shí)驗(yàn)證明，T4噬菌體感染大腸桿菌后對(duì)亞基的一個(gè)精氨酸殘基進(jìn)行ADP糖基化修飾，造成RNA聚合酶全酶對(duì)啟動(dòng)子親和力降低。因子可以極大地提高RNA聚合酶對(duì)啟動(dòng)子區(qū)DNA序列的親和力，酶底結(jié)合常數(shù)提高103倍，酶底復(fù)合物的半衰期可達(dá)數(shù)小時(shí)甚至十小時(shí)。因子還能使RNA聚合酶與模板DNA上非特異為點(diǎn)的結(jié)合常數(shù)降低104倍。因子的作用是負(fù)責(zé)模板鏈的選擇和轉(zhuǎn)錄的起始使酶專一性識(shí)別模板上的啟動(dòng)子。在某些細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)包含有能識(shí)別

4、不同啟動(dòng)子的因子，以適應(yīng)不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的要求，調(diào)控不同基因裝爐的啟示。列如，枯草桿菌中就有6種不同相對(duì)分子質(zhì)量的因子。C 真核生物的RNA聚合酶真核生物中有3種RNA聚合酶，即RNA聚合酶I、RNA聚合酶和RNA聚合酶，分布于細(xì)胞核的不同部位。它們之間的區(qū)別主要在于對(duì)-鵝膏碳?jí)A的敏感性：最敏感的是聚合酶，存在于核質(zhì)中，轉(zhuǎn)錄前體m RNA；其次是聚合酶，也存在于核質(zhì)中，轉(zhuǎn)錄t RNA、5S r RNA和其它幾種小分子RNA；不敏感的是聚合酶I，存在于核仁中，轉(zhuǎn)錄r RNA。這三種聚合酶的相對(duì)分子量都在5105左右，一般為814個(gè)亞基。聚合酶研究得比較深入，至少由1012個(gè)亞基組成，有2個(gè)最大亞

5、基。第一大亞基相對(duì)分子量為2.4105，相當(dāng)于細(xì)菌RNA聚合酶的亞基，其羧基端有多磷酸化位點(diǎn)的7肽重復(fù)序列，稱為羧基末端結(jié)構(gòu)域（carboxy-terminal domain, CTD），為聚合酶獨(dú)有特征，可能是轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程中不同階段的開關(guān)。第二大亞基的相對(duì)分子量為1.4105，與大腸桿菌RNA聚合酶亞基有同源區(qū)，可能類似原核生物RNA聚合酶的亞基的識(shí)別功能。真核生物除上述3種RNA聚合酶外，在線粒體和葉綠體中，也發(fā)現(xiàn)了少數(shù)的RNA聚合酶，它們都是由核基因編碼，在細(xì)胞質(zhì)中合成后再運(yùn)送到細(xì)胞器中。這些RNA聚合酶的相對(duì)分子質(zhì)量小，活性也比較低，這與細(xì)胞器DNA的簡(jiǎn)單性是相適應(yīng)的。4）終止因子 因

6、子是一種強(qiáng)堿性蛋白，由3個(gè)二聚體組成，能與RNA結(jié)合。能水解各種核苷酸三磷酸，實(shí)際上是一種NTP酶。RNA合成起始以后，因子即附著在新生的RNA鏈上，靠ATP水解產(chǎn)生的能量，沿著53方向朝著RNA聚合酶移動(dòng)，到達(dá)RNA的3OH端后取代了暫停在終止位點(diǎn)上的RNA聚合酶，使之從模板DNA上釋放m RNA，完成轉(zhuǎn)錄過(guò)程。3 原核生物的轉(zhuǎn)錄 一般過(guò)程包括啟動(dòng)、起始、延伸、終止。1）啟動(dòng)子A 定義B 幾個(gè)概念C 啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)2）識(shí)別原核生物RNA聚合酶中的因子識(shí)別轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，并促使核心酶結(jié)合形成全酶復(fù)合物。被辨認(rèn)的區(qū)段就是位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)-35區(qū)的TTGACA序列。酶與該區(qū)結(jié)合后，即滑動(dòng)至-10區(qū)的TAT

7、AAT序列（Pribnow盒），并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。因子在DNA雙鏈上迅速、隨機(jī)滑動(dòng),尋找到啟動(dòng)子因子識(shí)別轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)（-35區(qū)）促使核心酶結(jié)合形成全酶復(fù)合物酶與該區(qū)結(jié)合后,即滑動(dòng)至-10區(qū),并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。 3）起始4）延伸 核苷酸不斷加到RNA鏈的3OH上，RNA鏈就延長(zhǎng)。酶沿DNA鏈移動(dòng)，解開DNA螺旋，裸露一段新的單鏈模板區(qū)，核苷酸以共價(jià)鍵加合到RNA成長(zhǎng)鏈的3末端，在去螺旋區(qū)形成一段RNADNA雜交鏈。在解螺旋的后部，DNA摸板鏈由于原配對(duì)鏈重新形成雙螺旋，RNA以自由單鏈形式被擠出來(lái)。 在延伸過(guò)程中，DNA分子和酶分子發(fā)生構(gòu)象的改變。DNA從解旋到重旋。酶分子也是如此。在轉(zhuǎn)錄起始階段，全酶與DN

8、A分子形成穩(wěn)定的復(fù)合物；在延長(zhǎng)階段，亞基從全酶上釋放出來(lái)，由核心酶負(fù)責(zé)鏈的延伸。亞基的存在與否，因其與亞基構(gòu)象上的變化，即當(dāng)亞基締合時(shí)，與表現(xiàn)為有利于專一與DNA結(jié)合的構(gòu)象，而亞基釋放后留下核心酶，則與DNA結(jié)合不專一，不能形成穩(wěn)定的復(fù)合物。 鏈的延伸速度是不恒定的，在DNA某些區(qū)域，轉(zhuǎn)錄速度減慢或停止，這種速度的降低叫pause，pause發(fā)生在復(fù)含GC區(qū)，在圖中，由于GCAT的變化，使得突變株消除了pause，因?yàn)镚C變成AT后降低了氫鍵的穩(wěn)定性。 一個(gè)RNA聚合酶附屬因子，稱為NusA蛋白。像一樣，NusA與RNA聚合酶的核心酶結(jié)合，但不那么牢固。在細(xì)胞中，當(dāng)釋放出來(lái)以后，NusA就馬上

9、與RNA聚合酶分子結(jié)合，并轉(zhuǎn)錄出一條RNA鏈。但是，在轉(zhuǎn)錄時(shí)，NusA并非總是固定在一個(gè)RNA聚合酶上，二是可以和幾個(gè)RNA聚合酶分子起作用。RNA聚合酶從DNA分子上釋放出來(lái)后，因子由于與核心酶的親合力比NusA大，所以又取代了NusA與核心酶結(jié)合在一起。5）終止（1）不依賴于因子的終止 終止位點(diǎn)上游一般存在一個(gè)富含GC堿基的二重對(duì)稱區(qū)，由這段DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA容易形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在終止位點(diǎn)前面有一段由48個(gè)A組成的序列，所以轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3端為寡聚U，這種結(jié)構(gòu)特征的存在決定了轉(zhuǎn)錄的終止。 在新生RNA中出現(xiàn)發(fā)夾式結(jié)構(gòu)會(huì)導(dǎo)致RNA聚合酶的暫停，破壞RNADNA雜合鏈5端的正常結(jié)構(gòu)。寡聚U的存在

10、使雜合鏈的3端部分出現(xiàn)不穩(wěn)定的r UdA區(qū)域。兩者共同作用使RNA從三元復(fù)合物中解離出來(lái)。（2）依賴于因子的終止 RNA合成起始以后，因子即附著在新生的RNA鏈上，靠ATP水解產(chǎn)生的能量，沿著53方向朝著RNA聚合酶移動(dòng)，到達(dá)RNA的3OH后端取代了暫停在終止位點(diǎn)上的RNA聚合酶，使之從模板DNA上釋放m RNA，完成轉(zhuǎn)錄過(guò)程。4 轉(zhuǎn)錄后的加工 RNA在轉(zhuǎn)錄完成后，繼續(xù)形成具有功能的活性的RNA分子。即轉(zhuǎn)錄后加工（Post-transcriptional processing）在轉(zhuǎn)錄中新合成的RNA往往是較大的前體分子，需要經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的加工修飾，才轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂猩飳W(xué)活性的、成熟的RNA分子，這一

11、過(guò)程稱為轉(zhuǎn)錄后加工或RNA的成熟。主要包括剪接、剪切和化學(xué)修飾。 與一個(gè)多肽鏈相對(duì)應(yīng)的DNA片段加上啟動(dòng)部位再加上終止部位叫做一個(gè)順?lè)醋?，一次轉(zhuǎn)錄下來(lái)的mRNA可以包含一個(gè)順?lè)醋右部梢园鄠€(gè)順?lè)醋?，分別叫做單順?lè)醋觤RNA（mono-cistron mRNA）和多順?lè)醋觤RNA（poly-cistron mRNA）。原核生物中，多順?lè)醋觤RNA比單順?lè)醋痈毡椤?由于轉(zhuǎn)錄與翻譯過(guò)程偶聯(lián)，大多數(shù)原核生物mRNA都不需要加工，轉(zhuǎn)錄后直接翻譯；只有少數(shù)多順?lè)醋觤RNA需要經(jīng)過(guò)加工，切成小單位后再進(jìn)行翻譯。 rRNA 和tRNA的合成過(guò)程與mRNA沒(méi)有什麼不同，但r RNA 和t RNA有以下三點(diǎn)特

12、性與mRNA不同：成熟的rRNA和tRNA5端是5-單磷酸； 比原初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物??； 所有tRNA都含有稀有堿基1）mRNA的加工 少數(shù)多順?lè)醋觤RNA須通過(guò)核酸內(nèi)切酶切成較小的單位，然后再進(jìn)行翻譯，加工的意義在于可對(duì)mRNA的翻譯進(jìn)行調(diào)控。T7早期轉(zhuǎn)錄的6個(gè)基因轉(zhuǎn)錄成一個(gè)大的多順?lè)醋觤RNA分子，每個(gè)mRNA分子之間有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，RNaseIII在莖環(huán)處將大分子切開，形成單個(gè)mRNA分子進(jìn)行翻譯。切點(diǎn)在不配對(duì)的泡上，而不是在環(huán)上。2）tRNA的加工 tRNA的種類遠(yuǎn)比r RNA要多，在原核生物中有3040種。并且一些tRNA基因和rRNA基因連接在一起。此外，tRNA基因多以基因簇存在，構(gòu)成多順?lè)?/p>

13、子轉(zhuǎn)錄單位。原核的tRNA初始轉(zhuǎn)錄本多為多順?lè)醋樱╬olycistron），也就是幾個(gè)tRNA分子串連在一起。這有三種不同的情況：串聯(lián)的tRNA分子都是相同的，如在27的tRNATyr-tRNATyr；串聯(lián)的tRNA分子是不同的，如71的tRNAIle-tRNAAla-tRNAThr；由tRNA和rRNA串聯(lián)組成。少數(shù)的tRNA前體為單順?lè)醋樱╩onocistron）如43的tRNAser（圖13-1）。tRNA的加工分成3個(gè)階段（圖13-2）：(1) 剪切、修剪和剪接： RNase P是一種不常用的酶，是由23蛋白和至少77RNA組成的復(fù)合體。其RNA長(zhǎng)375nt，分子量為130kDa。RN

14、ase P具有內(nèi)切酶的活性，是一類主要的加工酶，可切除E.coli前體tRNA 5端的前導(dǎo)序列（41nt），形成成熟的5末端，也被叫做tRNA5成熟酶。此酶不識(shí)別特殊的序列，而識(shí)別二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)夾所組成的tRNA。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，RNase P的專一性也與3CCAOH有關(guān)。RNaseF是3內(nèi)切核酸酶，切下前體中3端的核苷酸序列。RNase和RNaseE在tRNA加工中可能也起作用，使大的新生轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物變得小些。 RNaseD，分子量38000U，為單一亞基蛋白質(zhì)?？梢詮?端逐個(gè)切去附加的序列，以暴露出tRNA3端，是體內(nèi)3tRNA成熟酶。 （2）核苷修飾 成熟的tRNA分子中含有許多修飾成分，不同的tR

15、NA所含修飾成分種類和數(shù)目都各不相同。tRNA的修飾是在多核苷酸鏈上進(jìn)行的，由修飾酶所催化。 tRNA修飾酶具有高度的專一性，一般說(shuō)來(lái)，每種修飾核苷都有催化合成本身的修飾酶。 tRNA甲基轉(zhuǎn)移酶，高度的專一性，如tRNA（腺嘌呤1）甲基化酶催化tRNA中特定位置的Am A，tRNA甲基化酶也具有嚴(yán)格的順序要求，如酵母中的二個(gè)甲基化酶，分別甲基化tRNA中的G19和G43生成m1G19和m1G43。 還有tRNA異戊烯轉(zhuǎn)移酶、tRNA鳥嘌呤轉(zhuǎn)糖苷酶和tRNA合成酶。3）rRNA的加工 大腸桿菌中的rRNA有三種：5S rRNA、16S rRNA和23S rRNA。這些rRNA和幾個(gè)tRNA全部包

16、含在一個(gè)具有5000個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄子中。 當(dāng)轉(zhuǎn)錄子完成以后，一序列的酶與之作用。其中最主要的是RNase，這是一種切割雙鏈RNA的酶。四、真核生物的轉(zhuǎn)錄 真核生物的順式作用元件，即DNA上對(duì)基因表達(dá)有調(diào)節(jié)作用的特定序列，包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、沉默子。 真核生物的轉(zhuǎn)錄，是由RNA聚合酶與這些元件相互作用，在蛋白質(zhì)輔助因子的協(xié)同下完成的。1、啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu) 真核生物有3種RNA聚合酶，每種酶都有自己的啟動(dòng)子。1）RNA聚合酶的啟動(dòng)子 Pribnow實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)5個(gè)核苷酸組成的共有序列，RNA聚合酶緊密結(jié)合位點(diǎn)，稱為Pribnow區(qū)，又位于上游10bp處，又稱為10區(qū)。2）RNA聚合酶的啟動(dòng)子真核生物DN

17、A序列5上游區(qū)有一段與原核生物Pribnow區(qū)相似的富含TA的保守區(qū)列。在2535區(qū)含有TATA序列，稱為TATA框（hogness box），它可選擇轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，控制轉(zhuǎn)爐的精確性。在7080區(qū)含有CCAAT序列，為CAAT框，共有序列是GGCCCAATCT，決定啟動(dòng)子的起始頻率。在80110含有GCCACACCC或GGGCGGG序列，稱為GC框，也具有調(diào)控啟示和轉(zhuǎn)錄效率的功能。3）聚合酶的啟動(dòng)子 可以用上游和下游啟動(dòng)子。分為兩類：內(nèi)部啟動(dòng)子和上游啟動(dòng)子。2、增強(qiáng)子的結(jié)構(gòu) 能強(qiáng)化轉(zhuǎn)錄起始的序列成為增強(qiáng)子或強(qiáng)化子（enhancer）。增強(qiáng)子位于上游，距轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)至少100bp以上，是一種遠(yuǎn)端控

18、制元件，又稱游上激活序列（upstream activating sequence, UAS）或上游啟動(dòng)子元件（upstream promoter element, UPE），它通過(guò)啟動(dòng)子來(lái)增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄效率。增強(qiáng)子區(qū)的跨度一般為100200bp，由812bp的“核心”組件構(gòu)成，共有序列為TGGAAAG與TTT，可有完整或部分的回文結(jié)構(gòu)，并以單拷貝或多拷貝的形式存在。增強(qiáng)子通常能距轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)14kb，甚至30kb外起作用。 增強(qiáng)子是一種能夠提高轉(zhuǎn)錄效率的順式調(diào)控元件，最早是在SV40病毒中發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)約200bp的一段DNA，可使旁側(cè)的基因轉(zhuǎn)錄提高100倍，其后在多種真核生物、甚至在原核生物中都發(fā)現(xiàn)了增強(qiáng)

19、子。增強(qiáng)子通常占100-200bp長(zhǎng)度，也和啟動(dòng)子一樣由若干組件構(gòu)成，其基本核心組件常為8-12bp，可以單拷貝或多拷貝串連形式存在。增強(qiáng)子的作用有以下特點(diǎn)：增強(qiáng)子提高同一條DNA鏈上基因轉(zhuǎn)錄效率，可以遠(yuǎn)距離起作用，通?？删嚯x1-4kb、個(gè)別情況下離開所調(diào)控的基因30kb仍能發(fā)揮作用，而且在基因的上游或下游都能起作用。增強(qiáng)子的作用與其序列的正反方向無(wú)關(guān)，將增強(qiáng)子方向倒置依然能起作用。而將啟動(dòng)子倒置就不能起作用，可見(jiàn)增強(qiáng)子與啟動(dòng)子是很不相同的。增強(qiáng)子要有啟動(dòng)子才能發(fā)揮作用，沒(méi)有啟動(dòng)子存在，增強(qiáng)子不能表現(xiàn)活性。但增強(qiáng)子對(duì)啟動(dòng)子沒(méi)有嚴(yán)格的專一性，同一增強(qiáng)子可以影響不同類型啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。例如當(dāng)含有增強(qiáng)

20、子的病毒基因組整合入宿主細(xì)胞基因組時(shí)，可能夠增強(qiáng)整合區(qū)附近宿主某些基因的轉(zhuǎn)錄；當(dāng)增強(qiáng)子隨某些染色體段落移位時(shí)，也能提高移到的新位置周圍基因的轉(zhuǎn)錄。使某些癌基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)增強(qiáng)，可能是腫瘤發(fā)生的因素之一。增強(qiáng)子的作用機(jī)理雖然還不明確，但與其他順式調(diào)控元件一樣，必須與特定的蛋白質(zhì)因子結(jié)合后才能發(fā)揮增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的作用。增強(qiáng)子一般具有組織或細(xì)胞特異性，許多增強(qiáng)子只在某些細(xì)胞或組織中表現(xiàn)活性，是由這些細(xì)胞或組織中具有特異性蛋白質(zhì)因子所決定的。3、轉(zhuǎn)錄因子 真核生物的轉(zhuǎn)錄起始較為復(fù)雜。目前已知RNA聚合酶至少有六種不同的蛋白因子參與轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的形成。這些蛋白因子被稱為轉(zhuǎn)錄因子（trans-criptional f

21、actor, TF)。包括 TFA，TFB，TFD，TFE，TFF，TF-I。 4、轉(zhuǎn)錄的過(guò)程1）起始復(fù)合物的形成：，TFD與TATA框特異結(jié)合，形成TFD啟動(dòng)子復(fù)合體；TFD是起始轉(zhuǎn)錄中最重要的基本起始因子。TFA進(jìn)入復(fù)合物，使TFD能夠保護(hù)上游更遠(yuǎn)的區(qū)段。TFB結(jié)合于TATA框的下游，保護(hù)模板鏈的起始區(qū)域。TFF攜帶RNApol裝配轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。TFE結(jié)合，保護(hù)延伸的下游區(qū)段。 真核生物轉(zhuǎn)錄的起始，基本上與原核相似，先形成封閉復(fù)合物，再轉(zhuǎn)變成開放復(fù)合物。2）延伸 延伸前，TF因子要釋放，便于聚合酶活動(dòng)轉(zhuǎn)錄。TF因子釋放后，RNA聚合酶轉(zhuǎn)變?yōu)檠由爝^(guò)程。TFH因子再延伸中起重要作用。TFH和TF

22、E結(jié)合進(jìn)入無(wú)纏繞的DNA區(qū)帶，使RNA聚合酶開始移動(dòng)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。3）終止 目前機(jī)制還不是特別清楚，在一些因素的影響下，如，受到核小體結(jié)構(gòu)的影響、蛋白因子與轉(zhuǎn)錄的3端結(jié)合、DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)彎曲、DNA形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)等等，轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物被迫停止在一定位置上，只是轉(zhuǎn)錄停止。修飾位點(diǎn).轉(zhuǎn)錄越過(guò)修飾點(diǎn)后,合成的mRNA被切斷,隨即加polyA尾巴和5帽子.余下的RNA雖然繼續(xù)轉(zhuǎn)錄,但很快被RNA酶降解.5 轉(zhuǎn)錄后的加工 真核生物的核DNA，由于基因的長(zhǎng)度和性質(zhì)的差異，原使轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物很不均一，被統(tǒng)稱為不均一核RNA（heterogeneous nuclear RNA，hnRNA）。1）mRNA的加工A 帽 成熟

23、的真核生物mRNA，其結(jié)構(gòu)的5端都有一個(gè)m7G-PPNmN結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)被稱為甲基鳥苷的帽子。鳥苷通過(guò)5-5焦磷酸鍵與初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的5端相連，反應(yīng)由鳥苷轉(zhuǎn)移酶完成。當(dāng)鳥苷上第7位碳原子被甲基化形成m7G-PPNmN時(shí)，此時(shí)形成的帽子被稱為“帽0”，被尿苷酸7甲基轉(zhuǎn)移酶催化。第一個(gè)甲基出現(xiàn)在所有真核生物中，單細(xì)胞真核生物主要使這個(gè)結(jié)構(gòu)。如果除m7G-PPNmN外，在第二個(gè)核苷酸核糖的第“2”號(hào)碳上也甲基化，形成m7G-PPNm，稱為“帽1”，真核生物中以這類為主。如果5末端N1和N2中的兩個(gè)核糖均甲基化，成為m7G-PPNmPNm2，稱為“帽2”。有帽2的mRNA只占有帽mRNA總量的1015以下。

24、從真核生物帽子結(jié)構(gòu)形成的復(fù)雜可以看出，生物進(jìn)化程度越高，其帽子結(jié)構(gòu)越復(fù)雜。有帽結(jié)構(gòu)的mRNA可免遭核酸酶的破壞，更容易被蛋白質(zhì)合成的起始因子所識(shí)別，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成。B尾目前還不清楚RNA聚合酶所轉(zhuǎn)錄基因的準(zhǔn)確終止位點(diǎn)，但研究發(fā)現(xiàn)，幾乎所有真核基因的3末端轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)上游1530bp處的保守序列AAUAAA對(duì)于初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的準(zhǔn)確切割及加尾是必需的。大多數(shù)的真核mRNA 都有3端的多聚尾巴（A），多聚（A）尾巴大約為200bp。多聚（A）屠巴不是由DNA編碼的，而是轉(zhuǎn)錄后在核內(nèi)加上去的。加polyA時(shí)需要由內(nèi)切酶切開m RNA3端生物特定序列，然后受polyA聚合酶催化，該酶能識(shí)別，mRNA

25、 的游離3-OH端，并加上約200個(gè)A殘基。polyA是mRNA由細(xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)所必須的形式，大大提高了mRNA在細(xì)胞質(zhì)中的穩(wěn)定性。C 剪接 在5端帽子和3端尾巴形成以后，內(nèi)含子一個(gè)一個(gè)被切除，外顯子連接形成成熟的m RNA，這個(gè)過(guò)程就是RNA的剪接（核內(nèi)） 。mRNA拼接反應(yīng)需要有核內(nèi)小分子RNA參與，以及它們與蛋白質(zhì)形成的復(fù)合物稱為小核糖核蛋白顆粒（snRNA），SnRNA分別被命名為U1,U2,U3,U4,U5,和U6RNA(由100-200個(gè)核苷酸組成)。步驟：U1snRNA以堿基互補(bǔ)的方式識(shí)別mRNA前體5剪接點(diǎn)；由結(jié)合在3剪接點(diǎn)上游富嘧啶區(qū)的U2AF因子引導(dǎo)SnRNA中的U2sn

26、RNA與分支點(diǎn)相結(jié)合，形成一個(gè)剪接前提，并進(jìn)一步與U4、U5、U6snRNA相結(jié)合，形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)剪接體，由特定的酶來(lái)識(shí)別切除該環(huán)狀結(jié)構(gòu)，完成剪接過(guò)程。 內(nèi)含子通常是有序或組成性的從mRNA前體中被剪接。真核生物 mRNA前體在剪接過(guò)程中，還可以形成套索樣的結(jié)構(gòu)，在內(nèi)含子序列中常有一個(gè)分支部位的腺苷酸殘基，它的2-OH可以自動(dòng)攻擊內(nèi)含子5端與外顯子1連接的磷酸二酯鍵，切開了外噗子1，而腺苷酸原來(lái)已有3，5-磷酸二酯鍵相連的兩個(gè)相鄰的核苷酸殘基，加上此3，5-磷酸二酯鍵連接后，在腺苷酸處出現(xiàn)了一個(gè)套索，已被切下的外顯子1的3-OH攻擊內(nèi)含子3末端與外顯子2之間的3，5-磷酸二酯鍵，鍵斷裂后，內(nèi)含子

27、以套索的形式被節(jié)下來(lái)，此時(shí)外顯子1和外顯子2可以連接起來(lái)（圖17-13）。D 編輯 圖23.15 所示是哺乳動(dòng)物的腸和肝臟中，載脂蛋白B(Apolipoprotein B)基因和mRNA的序列?；蚪M中含有一個(gè)單基因(割裂基因)，基因序列在所有的組織中都是相同的，編碼區(qū)有4563個(gè)密碼子。此基因轉(zhuǎn)錄成一個(gè)能代表肝臟中整個(gè)編碼序列的mRNA，翻譯的蛋白質(zhì)大小為512kD，即全長(zhǎng)載脂蛋白。在腸中合成的卻是只包含有2153個(gè)密碼子的m RNA，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)較短，為250kD 左右。這種蛋白質(zhì)其實(shí)是全長(zhǎng)載脂蛋白的N-末端。翻譯此蛋白質(zhì)的mRNA序列和肝臟中的這種mRNA 序列基本相同，只是在第2153

28、個(gè)密碼子上的一個(gè)C 變成了U。這個(gè)堿基的替換使得編碼谷氨酰胺的CAA 變成了終止密碼UAA。是什么導(dǎo)致了這種替換？基因組中沒(méi)有編碼這種新序列的任何可變基因或外顯子，其剪接機(jī)制也沒(méi)有任何改變。我們只能認(rèn)為在轉(zhuǎn)錄物的序列中直接發(fā)生了一種變化。 RNA 編輯的另外一個(gè)例子是在大鼠腦中谷氨酸受體中發(fā)現(xiàn)的。一個(gè)位置上的編輯使DNA中谷氨酰胺的密碼子在RNA中變成了精氨酸的密碼子，這種變化影響了通道的傳導(dǎo)性，因此對(duì)控制通過(guò)神經(jīng)遞質(zhì)的離子流有重要影響。在谷氨酸受體中另外一個(gè)位置上，一個(gè)精氨酸密碼子變成了甘氨酸密碼子。載脂蛋白B中的編輯使C2153變成了U；谷氨酸受體中兩個(gè)位置上A變成了I(次黃苷)。這些事件

29、是脫氨基作用，即核苷酸環(huán)上的氨基酸基團(tuán)被除掉了。這些事件分別是由胞苷和腺苷脫氨酶(Deaminase)催化的。如在錐蟲cox的mRNA上158個(gè)位點(diǎn)插放了394核苷酸；在9個(gè)位點(diǎn)刪去了18個(gè)尿苷酸，實(shí)際增加了376個(gè)核苷酸，使coxIII的長(zhǎng)度增加了55%。因此cox的基因比成熟的mRNA小了很多，故稱其隱匿基因。E 變異不論拼接過(guò)程如何，拼接必須極為精確，否則會(huì)導(dǎo)致遺傳信息傳遞障礙，合成的蛋白質(zhì)可能喪失其正常的功能。我國(guó)南方廣大地區(qū)是-地中海貧血的高發(fā)區(qū)，這是由于-珠蛋白鏈的合成受到部分或完全抑制所引起的一種血紅蛋白病。實(shí)驗(yàn)表明-珠蛋白基因元1中核苷酸的點(diǎn)突變改變了正常拼接部位的堿基順序，結(jié)

30、果造成錯(cuò)誤部位的拼接。加工成熟的 mRNA雖能翻譯，但產(chǎn)物不是正常的-珠蛋白，結(jié)果引起血紅蛋白級(jí)結(jié)構(gòu)和功能的改變。2）tRNA加工原核生物和真核生物剛轉(zhuǎn)錄生成的tRNA前體一般無(wú)生物活性，需要進(jìn)行剪切和拼接堿基修飾3-OH連接-ACC結(jié)構(gòu)。成熟的tRNA分子中有許多的稀有堿基，因此tRNA在甲基轉(zhuǎn)移酶催化下，某些嘌呤生成甲基嘌呤如AmA,GmA。有些尿嘧啶還原為雙氫尿嘧啶。尿嘧啶核苷轉(zhuǎn)變不假尿嘧啶核苷。某些腺苷酸脫氨基為成為次黃嘌呤核苷酸（）3末端加上CCA：在核苷酸轉(zhuǎn)移酶作用下，3-末端除去個(gè)別堿基后，換上tRNA分子統(tǒng)一的CCA-OH末端，完成tRNA分子中的氨基酸臂結(jié)構(gòu)。 tRNA前體的

31、加工tRNA前體在tRNA剪切酶的作用下，切成一定在小的tRNA分子。大腸桿菌RNase P可特異剪切tRNA前體的5旁順序，因此，該酶被稱為。除了RNaseP外，tRNA前體的剪切尚需要一個(gè)3-核酸內(nèi)切酶，這可將tRNA前體3端的一段核苷酸序列切下來(lái)。此外RNaseD是tRNA3端成熟酶。近年來(lái)的研究表明大腸桿菌RNaseP是一種非常特殊的酶分子，它是由RNA和蛋白質(zhì)組成，最近發(fā)現(xiàn)RNAaseP分子中的RNA部分在某些條件下，可以單獨(dú)地催化tRNA前體的加工成熟，這個(gè)發(fā)現(xiàn)和四膜蟲tRNA能自我拼接被認(rèn)為是近十年來(lái)生化領(lǐng)域內(nèi)最令人鼓舞的發(fā)現(xiàn)之一。說(shuō)明RNA分子確具有酶的催化活性。經(jīng)過(guò)剪切后的t

32、RNA分子還要在拼接酶作用下，將成熟tRNA分子所需的片段拼起來(lái)。 轉(zhuǎn)錄后加工：第一，切除tRNA前體兩端多余系列。tRNA前體5端較成熟tRNA通常多幾個(gè)到10個(gè)核苷酸，去除這些核苷酸是有高度專一的RNaseP（即tRNA 5端成熟酶）催化的。tRNA 3端的切除有兩個(gè)酶催化，即tRNA3端成熟核酸內(nèi)切酶核酸外切酶。第二是末端的添加，即在3添加CCA序列，此一步驟由tRNA核苷 轉(zhuǎn)移酶（tRNA nu-cleotidyl transferase）催化。第三，修飾。tRNA修飾堿基很多，主要為甲基化修飾占被修飾堿基的一半以上。其它如堿基（U異化產(chǎn)生），Y堿基（tRNA特定位置上的G37轉(zhuǎn)變而來(lái)

33、），I和Q主要系置換產(chǎn)生（前者是次黃嘌呤置換了前提t(yī)RNA上34位的腺嘌呤，后者是Q堿基置換了前提t(yī)RNA34位上的鳥嘌呤獲得）。3）rRNA加工真核生物rRNA前體比原核生物大，哺乳動(dòng)物的初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為45s，低等真核生物的rRNA前體為38s，真核生物5sRNA前體獨(dú)立于其他三種rRNA的基因轉(zhuǎn)錄。真核生物rRNA前體的加工真核生物rRNA前體中含有插入順序，rRNA前體要形成成熟的rRNA，需要經(jīng)過(guò)拼接反應(yīng)。例如，四膜蟲的rRNA前體的拼接是一種無(wú)酶催化的自動(dòng)拼接過(guò)程。四膜蟲基因組內(nèi)，26srRNA編碼的區(qū)域內(nèi)有413bp的插入順序。該插放序列可以不消耗能量從rRNA前體中被除掉。用SD

34、S煮沸和用蛋白酶外理等破壞酶活性辦法，都不能破壞拼接活性，但反應(yīng)中Mg2+和鳥嘌呤核苷酸是必在的。用32P-GTP進(jìn)行追蹤實(shí)驗(yàn)表明，起始過(guò)程是GTP在插入順序5端發(fā)生親核反應(yīng)，同時(shí)GMP與5端切點(diǎn)的切除段形成磷酸二酯鍵并使原RNA斷開。第二步是5切點(diǎn)的外元3-OH與3切點(diǎn)的外元5-P共價(jià)連接，獲得成熟的rRNA，被切除部分最后環(huán)化，形成一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，同時(shí)從5端去掉一個(gè)15核苷酸啐片。剩余部分連接成399核苷酸的環(huán)狀產(chǎn)物，再經(jīng)過(guò)幾步，最后切下一個(gè)19個(gè)核苷酸的線性內(nèi)含子序列即L-19，它具有催化活性，上面的剪接作用，是由內(nèi)含子本身的催化性質(zhì)決定的 。從哺乳動(dòng)物的中間產(chǎn)物的大小來(lái)看rRNA前體的加

35、工可能有多種途徑，但并不是所有的途徑都已搞清楚了。圖13-9表明HeLa（人類）細(xì)胞和L（鼠）細(xì)胞中rRNA的加工途徑：切除5端的前導(dǎo)序列，即外部的轉(zhuǎn)錄間隔序列（ETS），使45S的初始轉(zhuǎn)錄本變成41S的中間產(chǎn)物；從41S的中間產(chǎn)物中先切下18S的片段，但Hela細(xì)胞途徑和L途徑不同，前者的切點(diǎn)在18S和5.8S之間的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔序列（ITS），產(chǎn)物分別為20S（含18S rRNA片段）和32S；而后者的切點(diǎn)在18S序列和ITS的交界處，這樣18S rRNA就已經(jīng)成熟，無(wú)需修整，故稱為先成熟；部分退火：兩種途徑中的32S和36S中間產(chǎn)物（含5.8S和28S rRNA）中的5.8S和28S之間進(jìn)

36、行退火，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)；最后修正：在HeLa細(xì)胞途徑通過(guò)外切酶等將20S中殘余的ITS切除，還要將已退火的32S中的ITS切除掉；在L細(xì)胞途徑中只需將已退火的32S中的ITS切除即可。我們現(xiàn)在尚不知道加工的細(xì)節(jié)；但已知道45S RNA立即和蛋白質(zhì)結(jié)合，在核糖體上進(jìn)行加工，而不是以游離的rRNA進(jìn)行加工的。 4）核酶的發(fā)現(xiàn)眾所周知，核酸DNA、RNA是遺傳信息的載體，而作為功能分子的蛋白質(zhì)能催化成千上萬(wàn)的化學(xué)反應(yīng)，即起著酶的作用。蛋白質(zhì)與DNA、RNA之間存在著千絲萬(wàn)縷的聯(lián)系，這一點(diǎn)從中心法則中可窺其一斑（圖1）。沒(méi)有DNA和RNA，就無(wú)法進(jìn)行蛋白質(zhì)的生物合成，而沒(méi)有酶（蛋白質(zhì)），DNA和RNA無(wú)

37、法自我復(fù)制或相互轉(zhuǎn)錄。蛋白質(zhì)是DNA和RNA調(diào)控的產(chǎn)物，而DNA、RNA的自我復(fù)制離不開蛋白質(zhì)，那么蛋白質(zhì)（酶）與核酸（DNA、RNA）在生命形成過(guò)程中究竟孰先孰后呢？RNA可作為催化劑這一功能的發(fā)現(xiàn)打破了生物體內(nèi)生化反應(yīng)僅由蛋白質(zhì)酶催化的框子，為生命進(jìn)化提供了新的理論。這種RNA的形成需要從其前體中準(zhǔn)確地切去含有413個(gè)核苷酸的插入片段（IVS）并進(jìn)行一系列切割、剪接（圖2、3）。在研究中，Cech等驚訝地發(fā)現(xiàn)，該片段的切割、剪接并不需要酶至少不需要傳統(tǒng)意義上的酶只需要適量三磷酸鳥苷（GTP），或者正如后來(lái)所發(fā)現(xiàn)的，只需要適量鳥嘌呤或其衍生物。核酸所進(jìn)行的是一系列快速、溫和的化學(xué)反應(yīng)，從而導(dǎo)

38、致不需要蛋白質(zhì)酶的輔助而完成自身的切割、剪接。在剪接過(guò)程中，鳥嘌呤（或其衍生物）進(jìn)攻RNA中413個(gè)核苷酸插入序列的5端。這是一種酯交換反應(yīng)，鳥嘌呤的羥基（OH）進(jìn)攻第一個(gè)內(nèi)含子核苷與第一個(gè)外顯子核苷之間的磷酸二酯鍵的3端，使得鳥嘌呤基團(tuán)與內(nèi)含子的5端相連，而外顯子的3端被游離出（圖3）。“自由”了的外顯子3端又自發(fā)地與413個(gè)核苷酸插入序列的最遠(yuǎn)端相接，完成了將外顯子兩端相剪接的過(guò)程。內(nèi)含子被切除，外顯子被剪接后，自由的內(nèi)含子又自發(fā)地產(chǎn)生了一系列反應(yīng)（圖4）。首先該多聚核苷酸的3端幾乎完全專一地進(jìn)攻第15個(gè)核苷與第16個(gè)核苷之間的磷酸二酯鍵，形成環(huán)多聚核苷酸，從而導(dǎo)致從內(nèi)含子的5端切去含15

39、個(gè)核苷酸的片段。如果該環(huán)多聚核苷酸被置于高pH值（如pH=9.0）環(huán)境下，則分子精確地在最新形成的化學(xué)鍵處開環(huán)?；顫姷?端又一次進(jìn)攻，切去含有4個(gè)核苷酸的短鏈，并再一次成環(huán)。同樣，在堿性條件下開環(huán)，形成了含有395個(gè)核苷酸的多聚核苷酸長(zhǎng)鏈。定義為Ribozyme，即RNA酶（或RNA催化劑）。然而，近年的研究發(fā)現(xiàn)，許多RNA卻能催化其他分子而不是本身，從此，Ribozyme就完全符合酶的定義了。類內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)類內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是：其邊界序列為5 U G3（表示剪切位點(diǎn)）；具有中部核心結(jié)構(gòu)（Central core strucature）。所有的類內(nèi)含子中都具有2級(jí)結(jié)構(gòu)，圖13-24表示四膜

40、蟲內(nèi)含子中二級(jí)結(jié)構(gòu)模型，共九個(gè)配對(duì)區(qū)（P1-P9）其中有2個(gè)配對(duì)區(qū)（P4和P7）是類內(nèi)含子中共有的保守序列，P4由P和Q序列形成，長(zhǎng)10nt，有6-7堿基是可以配對(duì)的。P7是由R和S序列構(gòu)成的，長(zhǎng)12nt，但只有5個(gè)堿基可配對(duì)。其他的配對(duì)區(qū)在不同的內(nèi)含子中是不同的，突變分析表明，P3，P4，P6，P7是核心結(jié)構(gòu)，也就是可以執(zhí)行催化的最小區(qū)域。 具有內(nèi)部引導(dǎo)序列（internal guide sequence IGS）。Davies（1982年）第一個(gè)提出了內(nèi)部引導(dǎo)序列，它由六個(gè)nt組成，GGAGGG（四膜蟲）。內(nèi)含子中可與外顯子配對(duì)的序列稱為內(nèi)部引導(dǎo)序列。最初人們認(rèn)為IGS的作用是通過(guò)和兩個(gè)外

41、顯子近側(cè)區(qū)域配對(duì)，使外顯子并在一起，現(xiàn)在認(rèn)為其作用是決定剪接的專一性。而且使切點(diǎn)的U處于易于受到攻擊的暴露點(diǎn)。有的序列很短，在P7和P9之間配對(duì)，要在內(nèi)含子3端G激活前立即配對(duì)。堿基的配對(duì)對(duì)于產(chǎn)生核心結(jié)構(gòu)是很必要的，順式作用位點(diǎn)的突變就會(huì)阻止類內(nèi)含子的剪接。各種突變的線粒體內(nèi)含子在體內(nèi)都不能被切除，而四膜蟲的內(nèi)含子插入到細(xì)菌基因中，再轉(zhuǎn)化到細(xì)菌中，它仍可以剪切。圖13-25表示構(gòu)建一個(gè)重組DNA，轉(zhuǎn)化到在E.coli中表達(dá)。將自我剪接的內(nèi)含子插到-半乳糖苷酶的第10個(gè)密碼中，再轉(zhuǎn)化-gal-E.coli，若此內(nèi)含子不被剪接的話，-半乳糖苷酶基因受到破壞不能表達(dá)，菌株為白色，若能自我剪切，則-半

42、乳糖苷酶基因可以翻譯成完整的酶，能使底物X-gal發(fā)酵變蘭。用此方法可以檢測(cè)內(nèi)含子是否具有自我剪接的活性。(二) 類內(nèi)含子的剪接機(jī)制核酶具有多種催化活性，對(duì)于類內(nèi)含子來(lái)說(shuō)這些活性是由于它可以產(chǎn)生特殊的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，形成活性位點(diǎn)，相當(dāng)于傳統(tǒng)酶的激活位點(diǎn)。圖13-26就表示在這些位點(diǎn)上進(jìn)行的剪接反應(yīng)。內(nèi)含子的二級(jí)三級(jí)結(jié)構(gòu)形成了G苷酸結(jié)合位點(diǎn)和底物結(jié)合位點(diǎn)，后者依賴于內(nèi)部引導(dǎo)序列的配對(duì)來(lái)確定。核心結(jié)構(gòu)和內(nèi)部引導(dǎo)序列又使這兩個(gè)位點(diǎn)彼此靠近，便于相互作用。首先是GTP進(jìn)入G結(jié)合位點(diǎn)，左邊外顯子的3端通過(guò)和引導(dǎo)序列的互補(bǔ)配對(duì)進(jìn)入底物位點(diǎn)。GTP的3-OH作用左邊外顯子和內(nèi)含子交界處的磷酸二酯鍵，本身結(jié)合

43、到內(nèi)含子的5末端，被切下的5外顯子仍保持在底物位點(diǎn)上，并未游離。第二步內(nèi)含子的G414（即3交界序列上的G）又進(jìn)入了G-結(jié)合位點(diǎn)，切下的外顯子的3-OH又對(duì)G-結(jié)合位點(diǎn)上的G與3外顯子之間的磷酸二酯鍵發(fā)動(dòng)親核進(jìn)攻，切開磷酸二酯鍵，而其3-OH和3外顯子的P重新形成磷酸二酯鍵而連接起來(lái)，這樣就完成內(nèi)含子的剪接。內(nèi)含子成為線形的413nt的RNA分子。第三步，內(nèi)含子5端和引導(dǎo)序列相鄰的序列通過(guò)引導(dǎo)序列互補(bǔ)配對(duì)，進(jìn)入底物位點(diǎn)。仍然留在G結(jié)合位點(diǎn)上的G414其3-OH再作用底物位點(diǎn)上的序列，切下19nt的內(nèi)含子5端，并和余下內(nèi)含子的5-P形成二酯鍵，形成414nt的環(huán)狀內(nèi)含子。類內(nèi)含子的剪接型內(nèi)含子在

44、植物和低等真核生物的細(xì)胞器基因組中發(fā)現(xiàn)。類內(nèi)含子的剪接和I類內(nèi)含子不同，而和核mRNA 內(nèi)含子的剪切有些相似。但也有不同之處。(一)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)1列為5GUGCGYnAG，符合GT-AG法則。2二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成使兩個(gè)并列的功能區(qū)靠近。功能區(qū)5和功能區(qū)6被2堿基隔離開。功能區(qū)6含有1個(gè)不配對(duì)A殘基，其上帶有2-OH首先進(jìn)行轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。3在內(nèi)含子的近3端具有分支點(diǎn)順序（branch-point seguence），也就是在第6功能區(qū)有6-12nt保守序列，在哺乳動(dòng)物中為YNCURAY（Y：嘧啶，R：代表嘌呤，N表示任何核苷酸）。分支點(diǎn)順序可和上游序列互補(bǔ)，形成莖環(huán)，但A不配對(duì)（圖13-27）。(二)剪接機(jī)

45、制類內(nèi)含子的剪接無(wú)需鳥苷的輔助，但需鎂離子的存在。首先是分枝點(diǎn)A的2-OH對(duì)5端外顯子和內(nèi)含子交界處的磷酸二酯鍵發(fā)動(dòng)親核進(jìn)攻（圖13-28）切下外顯子1，內(nèi)含子5的邊界序列上的G與5磷酸和分枝點(diǎn)A的2-OH形成磷酸二酯鍵，從而產(chǎn)生了套索（lariat）結(jié)構(gòu)；第二步是切下的外顯子1，其3-OH繼續(xù)對(duì)內(nèi)含子3端的交界序列進(jìn)行親核進(jìn)攻，切下的外顯子2的5磷酸和外顯子1的3-OH形成磷酸二酯鍵，連接在一起，同時(shí)釋放出套索狀的內(nèi)含子。核mRNA的剪接和類內(nèi)含子十分相似，但根本的不同點(diǎn)是核mRNA前體的剪接本身不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，必需依賴于snRNP（U1，U2，U4，U5，U6）的幫助才能形成剪接體，進(jìn)行

46、自我剪接。它們自己本身不能象I類及類內(nèi)含子那樣依賴核心結(jié)構(gòu)，形成莖環(huán)，將5和3剪切點(diǎn)拉在一起。和snRNA的結(jié)合是相當(dāng)復(fù)雜的，但剪接反應(yīng)的第一步5位點(diǎn)的剪接是由U6催化的，3位點(diǎn)是由5外顯子1的3-OH對(duì)內(nèi)含子3端切點(diǎn)進(jìn)行轉(zhuǎn)酯反應(yīng)來(lái)完成。(一) 結(jié)構(gòu)特點(diǎn)1. 邊界順序:其邊界序列是完全符合GU-AG法則。2. 分枝點(diǎn)順序：它和類內(nèi)含子相似也具有分枝點(diǎn)順序。位于內(nèi)含子3端上游18-40nt處，序列為Py80NPy87Pu75APy95其中A為百分之百的保守，且具有2-OH。3. 內(nèi)含子5端有一保守序列（5GUAAGUA3）可以和U1 snRNA的5端的保守順序3CAUUUCAU5互補(bǔ)（圖13-2

47、9）。(二)剪接機(jī)制圖13-29已初步表明了核mRNA剪接的過(guò)程，實(shí)際上要比這復(fù)雜得多，首先要解決的是如何識(shí)別剪接位點(diǎn)，一般是通過(guò)兩種途徑：存在一種酶可以特異識(shí)別它們，并將兩者的保守序列拉到一起；通過(guò)RNA的堿基配對(duì)產(chǎn)生二級(jí)結(jié)構(gòu)，再由一種酶來(lái)識(shí)別。核mRNA的剪接可能要依賴于反式作用RNA（trans-acting RNA）。在高等生物中都含有很多的不連接的小分子RNA片段，在高等生物中其長(zhǎng)度在100-300nt，在酵母中長(zhǎng)度可達(dá)1000nt，其豐度很高。僅限制在核內(nèi)的這些RNA稱為小分子核內(nèi)RNA（small nuclear RNAs, snRNA）。在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的稱為小分子胞質(zhì)內(nèi)RNA(sm

48、all cytoplasmic RNAs,ScRNA)。在自然狀態(tài)下，它們以核糖核蛋白（snRNP）的形式存在。在剪接裝置中會(huì)有幾種snRNPs和大量的附加蛋白，常稱為剪接因子,這些snRNPs是U1，U2，U5和U4/U6。U1，U2和U5 snRNA每種都含有單個(gè)的snRNA和幾種蛋白，而U4/U6含有U4和U6 snRNAs及幾種蛋白。U1 snRNA自我配對(duì)形成了多個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，從而構(gòu)成了不同的功能區(qū)（圖13-30）。Sm結(jié)合位點(diǎn)是和其他snRNP相互作用的區(qū)域。其5末端有一保守序列：3CAUUCAU 5，這一序列可與核mRNA內(nèi)含子5端的邊界序列互補(bǔ)結(jié)合，這對(duì)于剪接反應(yīng)是很重要的。以腺

49、病毒12S RNA的5端邊界順序?yàn)槔?，如果此序列發(fā)生突變，從GUGAGG突變成為GUGAAU，雖然僅二個(gè)堿基發(fā)生突變，配對(duì)的堿基數(shù)仍然未變，僅減少了一個(gè)氫鍵，結(jié)果不能剪接。若在此基礎(chǔ)上U1 RNA的5端序列也發(fā)生相應(yīng)的突變，使得突變的堿基也能配對(duì)，結(jié)果又恢復(fù)了剪接的能力（圖13-31）。由此可見(jiàn)U1 RNA 5端保守序列和內(nèi)含子5剪接位點(diǎn)的配對(duì)對(duì)于剪接反應(yīng)來(lái)說(shuō)是十分重要的。其作用可能是通過(guò)配對(duì)使URNP可以和核mRNA3剪接位點(diǎn)牢固地結(jié)合，再通過(guò)U1和其他snRNP的相互作用使5剪接接點(diǎn)與3剪接位彼此靠近，彌補(bǔ)了核mRNA本身不能通過(guò)形成特殊的二級(jí)結(jié)構(gòu)將兩個(gè)剪接位點(diǎn)拉近的問(wèn)題。使剪接能順利進(jìn)行

50、。圖13-32表示snRNAp的剪接功能和反應(yīng)步驟。第一步是U1通過(guò)和5剪接位點(diǎn)的配對(duì)和5位點(diǎn)結(jié)合。但U1也可和分枝點(diǎn)結(jié)合，因帶有突變的分枝位點(diǎn)的pri-mRNA其5位點(diǎn)是不能和U1snRNA結(jié)合的，現(xiàn)在還不知道U1如何識(shí)別分枝位點(diǎn)的，可能和snRNP的某些組分有關(guān)，或者存在某些輔助因子。U1的存在對(duì)于第二步也是必要的。在第二步中U2 snRNA結(jié)合在分枝位點(diǎn)上。U2 snRNA通過(guò)和分枝位點(diǎn)的堿基配對(duì)來(lái)識(shí)別它。在酵母中分枝位點(diǎn)順序?yàn)?UACNACA 3，由于分枝位點(diǎn)緊靠3剪接位點(diǎn)，U1 snRNA（結(jié)合在5位點(diǎn)）和U2snRNA（結(jié)合在分枝位點(diǎn)）之間的反應(yīng)使兩個(gè)剪接點(diǎn)彼此靠近。含有U5和V4

51、/U6 snRNA的3聚體結(jié)合，水解ATP，現(xiàn)在剪接裝置的所有成分都全部到位，在剪接反應(yīng)前，它們都裝配起來(lái)。U1和U2是剪接起始階段是所需要的，它們的失活會(huì)阻礙5位點(diǎn)的剪切和套索的形成。雖5位點(diǎn)和U1snRNA的堿基配對(duì)是負(fù)責(zé)剪接位點(diǎn)的識(shí)別，但并不控制剪切。U1在反應(yīng)開始前解離。在此點(diǎn)上的U5 snRNA會(huì)改變自己的位置，開始它靠近外顯子，后來(lái)移到附近的內(nèi)含子上。催化反應(yīng)是通過(guò)U4的釋放來(lái)啟動(dòng)。此也需ATP的水解，U4snRNA的作用可能是抓住U6snRNA，直到U6參加反應(yīng)。以上幾種內(nèi)含子的剪接機(jī)制是不同的，現(xiàn)總結(jié)如表11-2所示：表11-2 幾種不同內(nèi)含子剪接反應(yīng)的區(qū)別酵母tRNAI類內(nèi)含

52、子類內(nèi)含子核mRNA前體邊界順序無(wú)5U-G35GU-AG35GU-AG3特殊順序C（莖上）G(環(huán)上)內(nèi)部引導(dǎo)序列分支點(diǎn)順序分支點(diǎn)順序,5外顯子順序二級(jí)結(jié)構(gòu)莖環(huán)構(gòu)象核心結(jié)構(gòu)5、6功能區(qū)連接體基因外的成分內(nèi)切酶，連接酶GTP，鎂離子鎂離子U1U2,U4,U5,U6能量要求ATP不不ATP中間型分子半分子tRNA環(huán)狀L-19 IVS套索套索Ribozyme的類型與特點(diǎn) 自從第一個(gè)Ribozyme被發(fā)現(xiàn)并命名后，至今已發(fā)現(xiàn)了幾十種Ribozyme。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的Ribozyme按其作用方式可分為切割型和剪接型。切割型的Ribozyme是只切不接，而剪接型的卻既剪又接。無(wú)論是切割還是剪接，所有的切割-連接反

53、應(yīng)都是轉(zhuǎn)酯基作用，即酯交換過(guò)程。根據(jù)作用的底物分類，Ribozyme可分為自體催化和異體催化兩類。絕大多數(shù)Ribozyme以自身為底物，進(jìn)行自體催化，即自我切割或自我剪接。而異體催化則是以其他分子為底物，可以是不同的RNA，也可以是其他分子。各類Ribozyme通常以RNA為底物，但也有例外。與蛋白質(zhì)酶相比，Ribozyme的催化效率較低。如四膜蟲rRNA插入序列具有核糖核酸酶的作用，水解RNA的速率為30秒鐘一次，而胰RNA酶作用速率則為每秒鐘數(shù)千次。另外，RNaseP中RNA單獨(dú)作用時(shí)，催化效率很低，而結(jié)合蛋白質(zhì)后，其催化效率大為提高，這也許與蛋白質(zhì)上含有多種活潑基團(tuán)有關(guān)。核酶作用方式較簡(jiǎn)

54、單，歸納起來(lái)主要有以下幾種類型：剪切型，這類核酸能催化自身RNA或異體RNA分子剪掉一段核苷酸片段，其催化功能相當(dāng)于內(nèi)切核酸酶的作用。剪接型，這類核酶催化自身RNA進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，首先切去自身RNA內(nèi)一個(gè)核苷酸片段，再將剩余的兩個(gè)片斷連接起來(lái)；相當(dāng)于內(nèi)切核酸酶及連接酶的聯(lián)合作用。其他類型，如核苷酸轉(zhuǎn)移，脫磷酸作用。錘頭狀結(jié)構(gòu)的RNA分子有13個(gè)保守的核苷酸序列，如果它們中的堿基改變會(huì)使這種催化活性失去作用。根據(jù)這種特片，科學(xué)家們?cè)隗w外沒(méi)計(jì)并人工合成這種RNA分子，用于抗腫瘤及抗病毒的實(shí)驗(yàn)中。1. 核酶的錘頭結(jié)構(gòu):科學(xué)家Symons自多種植物病毒衛(wèi)星RNA及類病毒RNA的自我剪接研究中，觀察到自我

55、切割區(qū)內(nèi)有錘頭結(jié)構(gòu)（hammer-head structure），其中的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是：（1）三個(gè)莖區(qū)形成局部的雙鏈結(jié)構(gòu)；其中含13個(gè)保守的核苷酸，N代表任何核苷酸。（2）圖中的箭頭表示自我切割位點(diǎn)，位于GUX的X外側(cè)，X可表示為C、U或A，不能是G2. 核酶的作用（1）核苷酸轉(zhuǎn)移作用。（2）水解反應(yīng)，即磷酸二酯酶作用。（3）磷酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)，類似磷酸轉(zhuǎn)移酶作用。（4）脫磷酸作用，即酸性磷酸酶作用。（5）RNA內(nèi)切反應(yīng)，即RNA限制性內(nèi)切酶作用。從大多數(shù)Ribozymw的結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)一些特征，例如：錘頭狀結(jié)構(gòu)的RNA分子有13個(gè)保守的核苷酸序列，如果它們中的堿基改變會(huì)使這種催化活性失去作用。根據(jù)這種特點(diǎn)

56、，科學(xué)家們?cè)隗w外設(shè)計(jì)并人工合成這種RNA分子，一個(gè)19ntRNA和一個(gè)24ntRNA，形成錘頭RNA。其中19ntRNA是酶，而24ntRNA是底物。合成的核酶在特定的部位切割靶RNA，以阻止病原物的RNA病毒的基因或基因組的表達(dá)，達(dá)到治療RNA病毒病的目的，用于抗腫瘤及抗病毒的實(shí)驗(yàn)中。1. RNA為生物催化劑，具有重要生物學(xué)意義。2.打破了酶是蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)觀念。3.在生命起源問(wèn)題上，為先有核酸提供了依據(jù)。4.為治療破壞有害基因，腫瘤等疾病提供手段。 有關(guān)RNA酶的資料：RNA作為催化劑的化學(xué)本質(zhì)磷元素在生命化學(xué)過(guò)程中起著重要作用，磷酯基團(tuán)充分勝任DNA、RNA的橋連基團(tuán)的角色。這是因?yàn)榱柞セ?/p>

57、團(tuán)既能連接兩個(gè)核苷基團(tuán)，又能保證自身的離子化。其離子化不僅可使核酸分子能存在于磷脂生物膜中，而且能防止被水解，確保核酸分子的穩(wěn)定。磷酯基團(tuán)的這些特殊功能是其他基團(tuán)所無(wú)法替代的。不僅如此，由于磷酯基團(tuán)的存在，能導(dǎo)致一系列不需要酶作用而發(fā)生的生化反應(yīng)，這是其他基團(tuán)所無(wú)法替代的，而Ribozyme的催化機(jī)理正是其中一種在磷酯基團(tuán)作用下發(fā)生的自發(fā)反應(yīng)。磷酯基團(tuán)的特殊功能與磷原子的原子結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。磷位于元素周期表近中心位置，外層有3個(gè)未成對(duì)的p電子和5個(gè)3d空軌道。其3s、3p及3d軌道的能量較為接近，易形成sp3、sp3d、sp3d2等多種雜化軌道，具有形成4、5、6等根化學(xué)鍵的能力。核酸磷酯基團(tuán)中的磷為五配位結(jié)構(gòu)，由于磷原子具有較多可利用的空電子軌道，配位數(shù)較多以及各化合價(jià)態(tài)間在一定條件