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6、5.35CRDLAND P F.The structure of bruchid eggs may explain t heovicidal effect of oilsJ .Journal of Stored Product s Research ,1992,28:129.收稿日期:2007202201修訂日期:20072032063通訊作者E 2mail :tingchangzhao 轉(zhuǎn)基因作物對土壤微生物多樣性影響王振1,2,趙廷昌23,劉學(xué)敏1,鄧欣2(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,哈爾濱150030;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所,植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室,北京100094摘要土壤

7、微生物的多樣性及其活性是保持農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定的基礎(chǔ),而作物的改變對土壤微生物的多樣性結(jié)構(gòu)和活性具有顯著的影響。轉(zhuǎn)基因作物被引入到農(nóng)田后所帶來的微生物群落的變化及對農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)所帶來的不確定因素,已成為研究熱點。本文綜述了近年來轉(zhuǎn)基因作物對土壤微生物群落影響的研究進展,并且著重介紹了轉(zhuǎn)基因抗蟲棉對根際微生物多樣性影響的研究進展。關(guān)鍵詞轉(zhuǎn)基因作物;土壤微生物群落;生物安全;轉(zhuǎn)基因抗蟲棉中圖分類號X 172Advances in research on the impacts of transgenic crops on soil microbesWang Zhen 1,2,Zhao Tingcha

8、ng 2,Liu Xuemin 1,Deng Xin 2(1.College of A g ronom y ,N ortheast A g ricultural Universit y ,H arbin 150030,China;2.S tate Key L aboratory f or B iology of Plant Diseases and I nsect Pests ,I nstitute ofPlant Protection ,Chinese A cadem y of A g ricultural Sciences ,B ei j ing 100094,China Abstract

9、 Microbes in the soil play a key role in keeping a healthy and sustainable agroecosystem.Introduction of transgenic crop s significantly affects the structure and ecological f unctions of soil 2borne plant 2associated microorgan 2isms.This paper focused on the effects of transgenic crops and their r

10、esidues ,particularly the insect 2resistant trans 2genic cotton ,on various organisms in the rhizosphere in the soil.K ey w ords genetically modified crops ;soil microbes ;biosafety ;insect 2resistant transgenic cotton土壤是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的基礎(chǔ),而土壤微生物在土壤物質(zhì)能量轉(zhuǎn)化過程中起著重要的作用。土壤微生物的多樣性與活性的保持是農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)健康和穩(wěn)定的基礎(chǔ)122。近年來的研究表明,轉(zhuǎn)基

11、因作物的外源基因和基因表達產(chǎn)物可通過根系分泌物或殘茬進入土壤生態(tài)系統(tǒng),進而對土壤生物功能類群及多樣性51專論與綜述 造成影響325。因此,土壤微生物在轉(zhuǎn)基因作物風(fēng)險評價中占有重要地位326。如美國環(huán)保局(署(En2 vironmental Protection Agency,EPA2000年將轉(zhuǎn)基因作物對土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響列為風(fēng)險評價的重要組成部分。本文簡要綜述了近幾年轉(zhuǎn)基因作物安全評價方面的發(fā)展狀況,外源基因及基因表達產(chǎn)物在土壤中的行為以及轉(zhuǎn)基因作物對土壤微生物影響的研究現(xiàn)狀。1引言近年來隨著轉(zhuǎn)基因作物的大面積種植,轉(zhuǎn)基因作物的生態(tài)安全性逐漸受到政府、科學(xué)家及民間的關(guān)注,研究的主要內(nèi)容是關(guān)于

12、轉(zhuǎn)基因作物與近緣物種之間的水平基因轉(zhuǎn)移、靶標害蟲抗性的產(chǎn)生、對非靶標生物和生態(tài)系統(tǒng)的影響以及作為食品的安全性等問題。許多專家對其利弊做了分析,但對其是否會導(dǎo)致嚴重的生態(tài)環(huán)境問題有不同的觀點。目前對于轉(zhuǎn)基因作物對土壤微生物群落影響的途徑認識是比較明確的:首先,轉(zhuǎn)基因作物的外源基因主要是通過轉(zhuǎn)基因作物根系分泌物和轉(zhuǎn)基因作物殘體降解的途徑進入土壤生態(tài)系統(tǒng)從而影響土壤微生物群落,使土壤生物功能類群以及土壤生物多樣性都有可能因此改變,從而影響整個生態(tài)系統(tǒng)的功能與穩(wěn)定性。其次,轉(zhuǎn)基因作物的遺傳改良可能會影響到植物本身的分解速度和碳、氮水平,進而影響土壤生物、生態(tài)過程,同樣影響到整個生態(tài)系統(tǒng)的功能。2轉(zhuǎn)基因

13、作物外源基因表達產(chǎn)物及其分解的殘體在土壤中的行為及其對土壤微生物的影響轉(zhuǎn)基因作物外源基因的產(chǎn)物釋放到環(huán)境尤其是土壤環(huán)境后,對土壤生物可能產(chǎn)生的影響已經(jīng)引起人們的關(guān)注。有關(guān)轉(zhuǎn)基因作物外源基因的表達產(chǎn)物在土壤中的行為,目前主要以轉(zhuǎn)Bt基因作物表達產(chǎn)物Bt蛋白在土壤中行為研究為主。Saxena等通過沙培試驗和田間試驗證實,根系分泌物中的Bt蛋白在土壤中存在180d以后,仍有殺蟲活性7。更有科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)Bt基因玉米收獲后,根茬中的Bt 殺蟲蛋白1447d后才消失8。而Tapp等通過生物測定研究純化的Bt蛋白與土壤顆粒結(jié)合后的活性表明,結(jié)合態(tài)Bt蛋白的毒性比非結(jié)合態(tài)的還強9。有研究表明Bt毒素在土壤

14、中也能夠存留較長的一段時間,且不易被土壤微生物分解,其活性持續(xù)時間與黏粒含量成正比,而與土壤p H成反比10。如Rui等發(fā)現(xiàn)Bt棉根系分泌的Bt毒素的高活性可持續(xù)2個月11。Palm測定轉(zhuǎn)Bt蛋白和純化的Bt 蛋白降解速度在土壤的濃度均是在前14d里迅速下降,然后緩慢下降,并在幾個月內(nèi)保持一定濃度,而這些較低含量的Bt蛋白可能會對非靶標的土壤微生物產(chǎn)生不利影響,并且隨著轉(zhuǎn)Bt植物的不斷種植而積累12。但Graham等報道,在連續(xù)種植了3 6年的轉(zhuǎn)Bt棉花田中,用EL ISA和生物檢測法未檢測到這種Bt毒蛋白13,認為種植了轉(zhuǎn)Bt棉花后殘留在田中的植株殘體向土壤釋放的Bt毒蛋白含量很低,生物活性

15、也不足以達到能檢測到的水平。芮玉奎通過對轉(zhuǎn)Bt棉花的根際土壤中毒蛋白的周年變化的試驗研究表明,Bt毒蛋白在盛蕾期到棉鈴發(fā)育期之間毒蛋白降解速度加快,最快時達到4ng/gh;到吐絮期以后毒蛋白的降解明顯放慢,降低幾十倍,降解速度不到0.2ng/gh。但到棉花收獲后,毒蛋白在抗蟲棉根際土壤中殘留降低到常規(guī)棉根際土壤的水平,據(jù)此認為轉(zhuǎn)基因抗蟲棉毒蛋白殘留不會對生態(tài)環(huán)境造成長時間的影響,但會對當(dāng)季作物造成不利影響14。由于作物被收獲的只有一小部分,大部分會殘存或重新返回土壤中(秸稈還田等,增加了土壤微生物群落與作物殘體內(nèi)存在的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的接觸時間。另外,作物殘體在土壤中逐步分解的過程,其降解產(chǎn)物也會對

16、土壤微生物群落產(chǎn)生一系列影響。J ames報道,Bt毒素可通過枯枝落葉和根系分泌物殘留在土壤中,與土壤黏粒結(jié)合毒性難以降解15。Donegan等對轉(zhuǎn)蛋白酶抑制劑I基因煙草中蛋白酶抑制劑在土壤中的殘留進行了分析,發(fā)現(xiàn)含轉(zhuǎn)基因煙草葉片的垃圾袋埋入土壤后57d后仍能檢測到0.05%的蛋白酶抑制劑16。Widrner等利用枝葉埋入土壤法對轉(zhuǎn)基因煙草中抗生素基因在土壤微生態(tài)系統(tǒng)中的殘留進行了研究,發(fā)現(xiàn)120d之后土壤中仍能檢測到0.14%的外源抗生素序列17。Hoff mann等發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因油菜、黑芥菜、蒺藜和甜豌豆中抗抗生素基因(n pt可通過轉(zhuǎn)基因植株的殘枝落葉轉(zhuǎn)移到一種能與植物共生的黑曲霉微生物中

17、18。錢迎倩等報道,帶有幾丁質(zhì)酶的抗真菌的轉(zhuǎn)基因作物可通過殘枝落葉的降解和根系分泌物減少土壤中菌根的種群19。 由上可知,轉(zhuǎn)基因作物的外源基因產(chǎn)物在土壤環(huán)境中的作用還存在爭議,但大多數(shù)科學(xué)家傾向于有影響,它的存在是引起土壤中微生物變化的一個原因。因此在轉(zhuǎn)基因作物安全評價體系中轉(zhuǎn)基因作物的外源基因產(chǎn)物在土壤的行為應(yīng)該是評估的重要內(nèi)容,而相應(yīng)的土壤中微生物的變化也應(yīng)是重要的評估內(nèi)容。3轉(zhuǎn)基因作物的遺傳改良對土壤微生物的影響Dunfield研究了在加拿大的4個不同田塊連續(xù)2年種植4種轉(zhuǎn)抗除草劑基因的油菜和4種常規(guī)油菜品種對根際微生物多樣性的影響20。通過分析表明,轉(zhuǎn)基因油菜品種Quest的根內(nèi)和根際

18、細菌群落與常規(guī)品種Excel和Fairview有差異。轉(zhuǎn)基因油菜的根際微生物群落在一些脂肪酸上顯著偏高,表明其微生物群落組成發(fā)生了變化。2003年Dunfield等又繼續(xù)對這個問題進行了進一步的研究21。他研究了連續(xù)2年種植轉(zhuǎn)抗除草劑基因油菜(抗草甘膦和常規(guī)油菜以及未種植油菜的田塊的微生物群落,結(jié)果表明土壤微生物群落隨著品種和生長季節(jié)而發(fā)生,在生長季節(jié)的某些時間觀察到了轉(zhuǎn)基因植物品種的差異。所有的分析表明,在越冬后轉(zhuǎn)基因油菜和非轉(zhuǎn)基因油菜的微生物群落沒有差異。轉(zhuǎn)基因植物對微生物群落的影響是暫時的,不會持續(xù)到下一個生長季節(jié)。Holger Heuer等研究了轉(zhuǎn)T4溶菌酶馬鈴薯,指出T4溶菌酶表達的

19、馬鈴薯與對照相比沒有發(fā)現(xiàn)根際群落有偏差,是季節(jié)、田塊的位置或年份相關(guān)的環(huán)境因子而不是轉(zhuǎn)基因植物表達的T4溶菌酶影響了根際群落22。Jana Lottmann等研究了轉(zhuǎn)T4溶菌酶馬鈴薯根際產(chǎn)生植物激素吲哚乙酸的有益細菌和對病原菌Erw inia carotovora和Verticillium dahliae 有抗性的抗生細菌的變化,也得出相似的結(jié)論,認為轉(zhuǎn)T4溶菌酶基因?qū)@些微生物的影響與環(huán)境中的自然變異相比是很小的23。Jana Lottmann等還將利福平抗性突變的兩個植物結(jié)合細菌用于接種T4溶菌酶表達的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯、轉(zhuǎn)基因?qū)φ振R鈴薯和非轉(zhuǎn)基因的親本馬鈴薯塊莖上,評估轉(zhuǎn)基因馬鈴薯產(chǎn)生的T4溶

20、菌酶對這些接種菌生存的影響24。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在所有取樣時間,根際和塊莖表面群落的DGGE模式在接種和非接種的馬鈴薯之間沒有差異。Griffiths等研究了轉(zhuǎn)兩種凝集素伴刀豆蛋白A (ConA和雪花凝集素(G NA的馬鈴薯以及純化的凝集素對土壤微生物群落的影響25。實驗室研究發(fā)現(xiàn)土壤細菌群落沒有檢測到直接影響。田間試驗表明轉(zhuǎn)G NA的馬鈴薯在收獲時改變了根際微生物群落,但是這種效應(yīng)不能從一個季節(jié)持續(xù)到下一個季節(jié),轉(zhuǎn)G NA馬鈴薯對后來種植的大麥生長沒有顯著影響。Step hen Gyamfi等研究了轉(zhuǎn)Basta抗性的油菜的種植以及相應(yīng)的除草劑的使用對根際Pseu do2 monas和Eubacte

21、ri al群落結(jié)構(gòu)的影響26。試驗結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因植物的根際微生物群落發(fā)生了輕微的變化,但是這個變化與植物生長帶來的變化相比是很微弱的。在生長后期都檢測到了兩種除草劑對Pseu domonas和Eubacteri al群落結(jié)構(gòu)的暫時的改變。Saxena等把轉(zhuǎn)Bt基因玉米和非Bt轉(zhuǎn)基因玉米以及空白土壤對照相比,細菌、放線菌和真菌在數(shù)量和類群上沒有顯著差異27。而Thomas L ukow用末端限制性片段長度多態(tài)性(T2RFL P分析了轉(zhuǎn)GUS基因和B arnase/ B arst ar基因馬鈴薯和非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的土壤細菌群落,發(fā)現(xiàn)它們有顯著的差異28。S. D.Siciliano 的研究也表明抗

22、除草劑草甘膦的轉(zhuǎn)基因油菜與對照相比根內(nèi)有更多的Fl avobacteri um和Pseu domonas 分離菌,而B acill us、M icrococcus和V ariovora x分離較少29。根際與對照相比A rt hrobacter和B acil2 l us分離菌較少。與對照相比轉(zhuǎn)基因油菜的微生物多樣性減少。G. D.Di G iovanni對轉(zhuǎn)木質(zhì)素過氧化酶基因的苜蓿進行了研究,轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因親本之間的Biolog GN的細菌群落的ERIC2PCR指紋聚類分析表明在根際富集的細菌類型有區(qū)別30。陳敏、應(yīng)文荷通過研究轉(zhuǎn)Bt水稻與常規(guī)水稻根際土壤,初步判斷轉(zhuǎn)Bt水稻根際土壤的細菌生

23、理類群無論在數(shù)量或是結(jié)構(gòu)組成上均明顯不同于常規(guī)水稻31。4轉(zhuǎn)基因棉對根際微生物多樣性的影響目前轉(zhuǎn)基因抗蟲棉所用的基因主要是Bt殺蟲蛋白基因(B acill us t huri niensis,Bt、豇豆胰蛋白酶抑制劑基因(cowpea tryp sin inhibitor,Cp TI、植物凝集素基因等。中國、美國、印度等幾個國家種植了轉(zhuǎn)基因抗蟲棉,其中我國是世界上抗蟲棉種植面積最大的國家。我國于1988年啟動了轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的研究,十多年的研究取得了豐碩的成果,目前我國已審定了16個抗蟲棉品種,其中單價抗蟲棉13個,雙價棉3個。累計推廣面積達600萬hm2,累計產(chǎn)生的社會經(jīng)71專論與綜述 濟效益

24、超過120億元,顯示了巨大的經(jīng)濟效益32。伴隨著轉(zhuǎn)基因棉花的大面積種植,轉(zhuǎn)基因棉花對土壤微生物群落的影響逐漸成為研究熱點。Donegan等研究發(fā)現(xiàn),2個轉(zhuǎn)Bt基因的棉花品系的處理小區(qū),細菌和真菌的數(shù)量顯著高于其他處理,而另一個轉(zhuǎn)Bt基因的棉花品系及純化的Bt蛋白則不顯著33。通過微生物群落物質(zhì)利用和DNA指紋分析也發(fā)現(xiàn)上述變化。他認為轉(zhuǎn)Bt基因棉可能由于遺傳修飾后的植株的生理生化特性發(fā)生變化而對土壤微生物產(chǎn)生影響,并非表達產(chǎn)物的直接影響。Oger等研究轉(zhuǎn)產(chǎn)冠癭堿基因植物根際分泌物對細菌群落的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),雖然轉(zhuǎn)基因植物和非轉(zhuǎn)基因植物根際的總細菌數(shù)無明顯差異,但在轉(zhuǎn)基因植物根際中利用冠癭堿的細

25、菌種群的個體數(shù)量是非轉(zhuǎn)基因植物的80倍,表明轉(zhuǎn)基因植物根系分泌物改變了根際微環(huán)境,導(dǎo)致細菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化34。徐征研究指出抗蟲棉土壤的微生物種類、組成與常規(guī)棉差異顯著35。土壤中好氧細菌和真菌數(shù)量顯著增加,芽孢桿菌和鏈球菌是優(yōu)勢種。Yudina等發(fā)現(xiàn)4種不同轉(zhuǎn)Bt基因棉花促使了土壤中細菌和真菌數(shù)量發(fā)生短暫性的顯著增加36。Wat rud和Seidier 也報道,轉(zhuǎn)Bt基因棉花可以提高土壤中細菌和真菌的數(shù)量37。Trevors等認為轉(zhuǎn)基因Bt抗蟲作物的遺傳體在土壤中被降解后,對土壤微生物活動過程(硝化作用、固氮作用等的影響,可導(dǎo)致土壤生物地球化學(xué)循環(huán)的嚴重變化38。但是,也有轉(zhuǎn)基因作物對微生物

26、群落沒有影響的報道。Tapp39與Stotzky10發(fā)現(xiàn)與土壤結(jié)合的Bt毒素不能作為碳源被微生物利用。沈法富等在大田栽培條件下,以轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉GK212和常規(guī)棉花泗棉3號作為材料,研究根際土壤微生物的變化,表明不同年份和生育期棉花根際微生物數(shù)量存在差異,但年度間和相同的發(fā)育時期棉花根際微生物的數(shù)量變化趨勢一致40。裴克全采用對原核生物核糖體小亞基16S rDNA全序列分析的方法,研究轉(zhuǎn)基因抗蟲棉根際土壤微生物的多樣性,也沒有發(fā)現(xiàn)抗蟲棉田與非抗蟲棉田間有顯著的差異41。5結(jié)束語土壤中的微生物在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中不僅可以調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育、抑制病原微生物的生長,而且在生態(tài)系統(tǒng)中的營養(yǎng)元素礦化、土壤肥

27、力的保持和提高以及能量轉(zhuǎn)化和物質(zhì)循環(huán)等方面具有其他生物無法代替的作用。隨著各種抗蟲、抗病等轉(zhuǎn)基因作物不斷選育種植,這種變化對土壤微生物存在潛在危險而可能造成對農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的影響成為研究熱點。但正如上面所述,有的學(xué)者認為轉(zhuǎn)基因作物對生態(tài)環(huán)境沒有影響,但也有學(xué)者認為轉(zhuǎn)基因作物對生態(tài)環(huán)境是有影響的,本人傾向于后者。因為耕作作物作為農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中重要的組成部分,它的改變必然會影響農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中其他的組成部分。轉(zhuǎn)基因作物對土壤生物的影響是復(fù)雜的,多方面的,例如它所產(chǎn)生的特有蛋白是否會對其他生物產(chǎn)生毒害作用,發(fā)生毒害作用所需要的積累時間有多長;為了適應(yīng)轉(zhuǎn)基因作物而改變的生產(chǎn)勞動方式對原有的生物產(chǎn)生的負面影

28、響有多大等等。還有它與現(xiàn)有的策略是否相沖突。如T abashnik認為,轉(zhuǎn)基因作物使害蟲數(shù)量降低,對保持天敵的有效數(shù)量會有負面影響42。這些結(jié)果意味著轉(zhuǎn)基因作物與依賴健康天敵數(shù)量的IPM防治策略及生物保育存在潛在的沖突。另一方面,在美國威斯康星(Wisconsin進行的田間試驗發(fā)現(xiàn),在轉(zhuǎn)Bt馬鈴薯田里捕食性昆蟲和寄生性昆蟲的數(shù)量要比傳統(tǒng)的采用化學(xué)殺蟲劑防治非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯害蟲的田間大。但是這個試驗沒有檢測未施或少施化學(xué)殺蟲劑的傳統(tǒng)馬鈴薯田間的情況43。這些結(jié)果說明,在評價轉(zhuǎn)基因抗蟲作物的作用時,必須與現(xiàn)在的各種防治措施進行比較,包括頻繁使用化學(xué)藥劑、少用或根本不用化學(xué)藥劑的情況。因此對于轉(zhuǎn)基因作

29、物的評價必須建立生態(tài)學(xué)意義的評估方法和理論體系并加以科學(xué)驗證,尤其是需要加強分子生物學(xué)方法的應(yīng)用,以獲得更精確的評價。同時應(yīng)當(dāng)認識到轉(zhuǎn)基因生物安全性的研究是一件長期而艱苦的任務(wù),也許需要10年、20年或者更多年的積累。參考文獻1FINLA Y B J,MABERL Y S C,COOPER J I.Microbial diver2sity and ecological functionJ.Oikos,1997,80:2092213. 2GROFFMAN P M,BO HL EN P J.Soil and sediment biodiver2sity2cross2system compariso

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