1、 /海底天然氣水合物的微生物成因及識別The microbial genesis of submarine gas hydrate and its microb-iological indication吳后波1, 蘇曉波1, 顏 文2, 3(1. 中國科學院南海海洋研究所LED 實驗室, 廣東廣州510301; 2. 中國科學院廣州天然氣水合物研究中心, 廣東廣州510070; 3. 中國科學院邊緣海重點實驗室, 廣東廣州510301中圖分類號:P 618. 130. 1 文獻標識碼:A 文章編號:1000-3096(2008 03-0096-05當前, 天然氣水合物作為一種未來新型能源在國際

2、上備受關注, 世界上已直接或間接發現了天然氣水合物116處, 其中海洋就有85處(包括中國南海北部陸坡、南沙海槽和東海陸坡 , 直接采集到天然氣水合物樣品有23處。據估算, 全球天然氣水合物中蘊藏的天然氣總量約(1. 82. 1 1016m 31, 資源總量是全球所有已知常規礦物燃料總和的2倍。對天然氣水合物研究受到如此高度關注的主要原因, 一是由于它是一種潛力巨大、前景誘人的超級能源; 二是天然氣水合物的形成與演化是全球氣候變化和海底地質災害的潛在誘發因素, 對海洋生態環境也會產生重大影響2。所以, 無論從尋找戰略儲備能源的角度看, 還是從防治災害和維護人類生存環境的角度看, 對天然氣水合物

3、的研究均具有重要意義。海底天然氣水合物形成與賦存條件特殊, 迄今除了海底鉆探和海底沉積物獲得少量海底天然氣水合物樣品外, 世界各地絕大多數天然氣水合物的分布主要是通過天然氣水合物的地質、地球物理、地球化學以及生物學等識別標志來判別的。目前, 針對海底天然氣水合物的微生物成因及其微生物識別標志的研究還相當膚淺, 作者簡要介紹了國內外有關該方面的研究進展。1 海底天然氣水合物的形成條件和成因類型海底形成天然氣水合物主要受溫度、壓力、氣體成分與含量等3個因素的控制。(1 溫度不能太高, 海底的溫度是24e , 適合天然氣水合物的形成, 高于20e 就分解; (2 壓力要足夠大, 在0e 時只需要3.

4、 03106Pa 就可形成天然氣水合物, 海水深度每增加10m, 壓力就增加1. 01105Pa, 因此, 海水深300m 就可達到3. 03106Pa, 海水越深壓力越大,天然氣水合物就越穩定; (3 要有足量的甲烷氣源, 甲烷在水中的溶解度很低, 一般為每體積水中只能溶解0. 045體積的甲烷3, 而要形成天然氣水合物, 必需是水合物籠狀結構中90%以上被甲烷氣占據4, 即1體積的水中要容納大于150體積的甲烷氣, 因此要形成海底天然氣水合物, 必須要有足量的甲烷氣來源。除此之外, 還必須有充足的使天然氣水合物形成的有利的流體載體的輸導系統和供應, 因此地質條件是水合物形成的重要控制條件。

5、海底天然氣水合物的氣體成分通常以甲烷氣(CH 4 為主(>99% , 就甲烷的成因而言, 可將天然氣劃分為生物成因氣、熱成因氣和非生物成因氣等3類。生物成因氣主要是指微生物在缺氧環境下, 分解埋于地層深處大量地質時期的動植物遺骸等有機物產生的天然氣, 也稱為菌解氣。生物成因的甲烷氣通常形成于天然氣水合物穩定區帶中, 其水合物形成速度慢且范圍較廣。熱成因氣的形成方式與石油相似, 沉積有機質隨著沉積物的埋深增大而溫度升高, 其長鏈有機化合物斷裂、分解形成天然氣。熱成因的甲烷氣比生物成因的甲烷氣更具有富集性, 通常形成于沉積盆地較深部, 并通過盆地鹵水向上遷移至高孔隙度、高滲透率的淺部天然氣水

6、合物穩定區的沉積物中。它們一般在斷裂帶附近形成小丘, 或從斷裂帶開始向外蔓延, 并且很好的圈閉且阻止更多的甲烷逸散到地表。收稿日期:2007-09-03; 修回日期:2007-12-20基金項目:中國科學院知識創新工程重要方向項目(KZCX2-YW -211-03 。作者簡介:吳后波(1967- , 男, 湖北洪湖人, 副研究員, 博士, 主要從事海洋環境與分子微生物學研究, 電話 E -mail:wu hou -boscsio. ac. cn.96 3/非生物成因天然氣系指地球內部迄今仍保存的地球原始烴類氣體, 或地殼內部經無機化學過程產生的烴類氣體。不同成因的甲

7、烷氣具有完全不同的碳同位素組成。Bernar d 等5曾用烴類氣體成分R 值及甲烷碳同位素組成來判斷甲烷來源。微生物成因甲烷氣的R 值比較高(>1000 , 碳同位素比值D13C 很低, 一般為-90j -55j ; 熱成因甲烷氣的R 值比較低(<100 , D13C 值較高, 一般為-55j -29j 。2 生物成因甲烷氣產生的微生物機制海洋深處及海底微生物產生甲烷氣, 主要有以下2個途徑:(1 厭氧細菌通過直接分解埋于地層深處的動植物遺骸等有機物而產生甲烷氣。在這種產甲烷過程中存在種類繁多、關系復雜的微生物區系, 參與甲烷產生的微生物總體上可分為2大類, 即包括硫酸鹽還原菌(S

8、ulphate -reducing bacteria, SRB 、硝酸鹽還原菌(Nitr ate -reducing bacteria, NRB 等在內的非產甲烷菌(non -methanog en 和產甲烷菌(methanogen 。甲烷的產生是一個復雜而連續的微生物學過程, 是這個微生物區系中各種微生物相互平衡、協同作用的結果。這兩大類微生物的相互關系包括:非產甲烷細菌和產甲烷細菌之間的相互關系; 非產甲烷細菌之間的相互關系; 產甲烷細菌之間的相互關系。其中非產甲烷細菌和產甲烷細菌之間的相互關系最為重要, 非產甲烷菌將動植物遺骸等有機底物等進行厭氧消化, 為產甲烷菌提供了生長和代謝所需的碳

9、源和能源, 非產甲烷細菌和產甲烷細菌相互依賴, 互為對方創造良好的環境和條件。產甲烷細菌通過乙酸發酵途徑產生甲烷氣。(2 自養產甲烷菌還原CO 2形成甲烷氣。海洋環境中產甲烷氣主要以CO 2還原途徑為主。海底產甲烷菌的CO 2底物有兩個來源:1 CO 2來源于有機質降解。埋于地層深處的動植物遺骸等有機質先被氧化為CO 2, 又由產甲烷細菌還原為甲烷。這種方式產生甲烷氣也須由兩種或以上的微生物協同完成。有機質為什么不直接由微生物降解為甲烷, 而要先氧化為CO 2, 又由產甲烷細菌還原為甲烷, 這種曲折的過程很令人費解6。2 CO 2來源于洋底的火山熱液-噴溢系統。產甲烷細菌生長的溫度范圍非常寬,

10、 它可以生活在近于冰點的南極湖泊中, 也可以棲息在110e 的深海火山熱液噴孔7, 在現代火山-熱液噴孔中發現了多種高溫自養甲烷菌8, 在天然氣水合物礦床中也發現有中高溫的自養甲烷桿菌9。D D CH4值(甲烷氫同位素值 被用來區別以上2個主要的微生物產甲烷途徑10。由CO 2還原作用產生的甲烷中氫只來源于周圍的水, 其D D CH4值大于-250j SMOW (standard mean ocean w ater , 代表值近于-191j ? 19j 11; 而乙酸發酵產生的甲烷中3/4的氫來源于有機質, 只有1/4的氫來源于水, 其D D CH4值小于-250j SM OW, 介于-355

11、j 和-290j 之間。3 海底天然氣水合物的生態環境效應由于海底天然氣水合物的形成與賦存條件的特異性, 其形成后對周圍的生物群落必將產生獨特的影響, 從而在其周圍形成獨特的生物群落特征。3. 1 海底天然氣水合物形成對其周圍微生物生態的影響微生物通過產甲烷作用參與了甲烷水合物的形成, 同時, 微生物在厭氧條件下還可以氧化甲烷水合物晶體中的甲烷氣12以及海底天然氣滲漏系統中的甲烷氣9, 1315, 微生物的這種氧化作用對甲烷氣及CO 2的全球循環以及成巖過程影響非常大。因此, 微生物群落的組成對甲烷水合物的穩定性、組成及晶體結構的影響非常重要。為了證明微生物細胞與水合物晶體有直接的接觸, 并證

12、明水合物晶體內存在微生物細胞, Lanoil 等16對墨西哥灣的天然氣水合物樣品進行了詳細的微生物學分析。他們用DNA 染液將天然氣水合物樣品DAPI 染色后在熒光顯微鏡下觀察, 發現天然氣水合物樣品里存在微生物細胞, 密度可達1. 0106個/m L 。利用分子生物學方法對天然氣水合物樣品里的微生物進行分類鑒定, 發現細菌的群落組成復雜, 絕大多數細菌屬于紫色細菌群(Pro teobac -teria 、放線菌群(Actinobacteria 和厚壁菌門(Firm -icutes 的細菌, 其中33%35%的細菌屬于放線菌群和厚壁菌門的細菌。天然氣水合物樣品里的古細菌群落組成相對簡單, 幾乎

13、所有古細菌都屬于產甲烷古細菌, 特別是鬃毛甲烷菌屬(Methanosaeta 。天然氣水合物晶體里的微生物群落不僅生命活動旺盛, 而且它們的生命活動并不局限于天然氣水合物晶體內, 它們還可以自由地與周圍的沉積物環境進行各種物質交換。甲烷水合物滲透性強, 天然氣水合物晶體中水分子間的空穴(晶穴 大小為100400nm, 而且晶穴占整個晶體的25%40%17, 這樣就有利于微生物賴以生存的底物如硫酸鹽及其代謝產物亞硫酸鹽等非常容易地進出天然氣水合物晶體, 有的晶穴甚至大到可以讓微生物細胞自由進出。微生物在天然氣水合物晶體內主要進行2種類型的代謝活動:(1 厭氧甲烷氧化作用(anaero bic m

14、eth -97 /ane ox idatio n, AOM , A OM 是發生在缺氧環境下以微生物為媒介的甲烷氧化作用, 通常與硫酸鹽的還原作用(Sulfate Reduction, SR 同時發生, AOM 在全球甲烷的收支平衡中極為重要, 并通過其將碳循環和硫循環聯系起來。微生物的AOM 活動不僅可以改變天然氣水合物中氣體的組成, 影響天然氣水合物的穩定性, 而且還可以改變天然氣水合物的地球化學特性以及沉積物的成巖過程。微生物的AOM 活動通常需要多種細菌的協同作用15, 18, 19。AOM 活動的機理目前還不完全清楚, 但存在兩種假說, 一種為單一硫酸鹽還原細菌說, 另一種是不同細菌

15、共生體說。類脂類生物標志化合物及單分子碳同位素分析特征表明微生物為非單一有機質來源, 古細菌16S rRNA 基因分析也證實A OM 古細菌具有多種來源, Boetius 等13和Orphan 等20在顯微鏡下找到了以甲烷古細菌為中心外部被硫酸鹽還原細菌包圍的細菌共生體, 為共生體假說提供了直接的依據。(2 非甲烷的碳水化合物氧化。天然氣水合物晶體中的很多細菌都可以進行這種非甲烷的碳水化合物氧化作用21, 特別是對脂肪族和芳香族的碳水化合物, 天然氣水合物晶體中的細菌通過這種非甲烷碳水化合物氧化作用影響著天然氣水合物晶體中碳水化合物向周圍環境的釋放22, 23。海底天然氣水合物在一定的溫壓條件

16、下, 即在天然氣水合物穩定帶內可以穩定存在, 如果脫離天然氣水合物穩定帶天然氣水合物就會分解為甲烷氣和水, 甲烷氣在海底水壓下以一種爆炸式的破裂方式從海底地層泄露出來, 在海底表面形成/梅花坑0地貌(深10m 、直徑100m , 同時還伴隨著一系列的物理、化學及生物作用過程, 形成與海底天然氣滲漏相關的、與海底天然氣水合物伴生的冷泉碳酸鹽巖。6400m 深的日本海溝陸坡冷泉環境中生長著Caly ptog ena 群落, 該環境大多數古細菌的16S rRNA 序列屬于嗜泉古菌, 顯示出與海洋古菌群1的rRNA 高度相似6。此外, 從沉積物中獲得的一個與布氏擬甲烷球菌(M ethanococcoi

17、des bur tonii 相關的序列屬于廣域古菌24。科學家在冷泉碳酸鹽巖中還發現了微生物化石, 這進一步證明了微生物細胞與天然氣水合物穩定帶水合物晶體有直接的接觸, 并證明天然氣水合物穩定帶水合物晶體里存在微生物細胞。東沙群島海域海底冷泉碳酸鹽巖形態類似于煙囪, 主要由方解石、伊利石、石英、黃鐵礦等礦物組成。方解石保存了細菌絲狀體形態, 絲狀體直徑小于0. 5L m 。通過掃描電鏡觀察, 在碳酸鹽巖斷裂面上發現了直徑小于0. 3L m 的細菌, 同時在碳酸鹽巖的外表層觀察到薄層外殼(厚0. 5L m , 顯示出細菌形態特征。此外, 在光學顯微鏡下可觀察到黃鐵礦集合體內保存了直徑小于0. 1

18、L m 的棒狀和卵形納米細菌。在碳酸鹽巖中保存的細菌化石證明了碳酸鹽巖是海底天然氣滲漏系統中細菌對甲烷氣氧化的產物。3. 2 海底天然氣水合物形成對其周圍大型生物生態的影響隨著海洋高技術的發展, 借助海底電視、遙控觀測器(ROV 和深潛器等先進工具, 在海底/梅花坑0內可以觀察到與水合物相關的化學自養生物群落25, 這些自養生物群落主要包括以Begg iatoa 為主要種屬的厭氧菌、貽貝類和蚌類等深海雙殼類生物, 管蠕蟲及冰蠕蟲, 以大量殼長為2030cm 的巨型貝類遺體為主, 形成了一種特殊的以溢出天然氣為/食物0的生物群落, 因有大量冷甲烷氣泡溢出, 故又稱/冷生物群落溢氣口0。1984年

19、首次在墨西哥灣發現這類生物, 目前在日本南海海槽、美國俄勒岡外海及大西洋布萊克海脊等地均見到類似現象26, 而在/梅花坑0以外的地區則難見到此類生物。此外, 科學家發現在海底天然氣水合物的周圍同樣棲息著一些特有的蠕蟲動物, 通常在這樣深的海底是沒有底棲生物生存的。4 海底天然氣水合物的生物判別標志選擇培養與海底天然氣水合物形成密切相關的微生物, 是海底天然氣水合物現場分析調查的重要輔助手段之一。但是由于目前分離培養技術的限制, 加上對許多海洋細菌的營養要求、培養條件等知之甚少, 因此未能有效的對許多已知類群的海洋細菌進行分離培養, 導致應用常規的分離培養方法無法全面反映海洋微生物的資源狀況27

20、, 即使是在普通環境中, 可培養的微生物也僅占微生物總種群數的0. 01%10%28, 而可培養的微生物所占比例則更少。而且對微生物進行選擇培養時往往加入了濃度遠高于自然狀況的營養物質, 其結果是在新的選擇壓力下群落結構通常會發生變化, 適應富營養條件的菌種成為優勢種, 取代了自然條件下的優勢種。近年來, 分子生物學技術開始廣泛應用于微生物群落結構分析, 且發展非常迅速。研究的焦點集中在具有保守序列的16S rDNA 上。研究方法包括分子雜交法29、聚合酶鏈式反應法(PCR 30、克隆基因文庫分析法31, 以及采用基因指紋圖譜技術的單鏈構象多態性法(SSCP 32、變性梯度凝膠電泳法(DGGE

21、 30、溫度梯度凝膠電泳法(T GGE 33、限性酶切片段長度多態性法(RFLP 34、限制性酶切末端98 3/片段長度多態性法(T -RFLP 35等, 具有很高的靈敏性, 與傳統的培養方法或其它不依賴培養技術的方法相比顯示出明顯的優越性, 推動了微生物多樣性研究的快速發展。因此, 針對重點采樣區域, 通過微生物群落和多樣性分析, 研制出特定細菌的DNA 探針(DNA probe , 為人們在現場通過特定的微生物群落特征及特定的細菌生物標志(biomarker 來探測天然氣水合物的存在提供了極大的可能和非常有用的工具。參考文獻:1 K venvolden K A. Gas hydrate a

22、s a potential ener gy re -source -A review of t heir methate co ntentA. I n H ow -ell, DG. (ed :T he F utur e o f Energ y Gases, U SGS Pro -fessional Paper1570C .L ondon:A cademic Pr ess,1993, 555-561. 2 M acdonald G. Role o f methane clathr ates o n past and future climateJ. Clim atic Change , 1990

23、, 16:247-281. 3 Y amAO M to S, Alcauskas J, Cro zier T. So lubility of methane in distilled wat er and sea water J. Journal of Chemical and Engineering Data , 1976, 21:78-80. 4 Sloan E D. Clathrate H ydr ates o f N atur al G as M . N ew Y or k:M ar cel Dekker Pr ess, 1990.5 Ber na rd B, Bro oks J M

24、, Sackett W M . A geochemicalmodel fo r char act erizatio n of hydro car bon g as sources in mar ine sediment sA .In:Pr oceeding 9t h Annua l O ff -sho re T echnolog y ConferenceC .Ho usto n:Offshor e T echno lo gy Co nfer ence, 1977, 435-438.6 狄永軍, 郭正俯, 李凱明, 等. 天然氣水合物成因探討J. 地球科學進展, 2003, 18(1 :138-

25、142.7 Cavicchio li R, T homas T. Ext remophilesA. In:Led -erberg J, A lex ander M , Hull R, et al (eds. Encyclo -pedia o f M icro biolo gy (2ndC. L ondon:A cademic P ress, 2000, 3:317-337. 8 Sower s K R. M ethanog enesis A . In:L eder ber g J, A lex ander M , H ull R, et al (eds . Encyclopedia o f M

26、 -i crobio lo gy (2nd C.L ondon:A cademic Pr ess, 2000, 2:204-225.9 M ar chesi J R, W eightman A J, Cr agg B A, et al .M ethanogen and bacter ial diversity and dist ributio n in deep gas hy dr ate sediments fro m the Cascadia M ar gin as r ev ealed by 16S rR NA molecular analysis J. FEMS Microbio Ec

27、ol , 2001, 34:221-228.10 Schoell M. T he hydrog en and carbo n isoto pic co mpo -sit ion of methane f rom natural gases of v ario us o rig insJ.Geochimica et Cosmochimica Acta, 1980, 44(5 :649-661.11 W hiticar M J, Faber E, Scho ell M. Bio genic methane format ion in marine and freshwater env ir onm

28、ents:CO 2reductio n vs. acetate fer mentat ion -isoto pe ev-i denceJ. Geochimica et C osm ochimica Acta , 1986, 50(5 :693-709.12 Sassen R, M acDo nald I R, G uinasso N L J, et al .Bact er ial methane ox idation in sea -floor gas hy dr ate:sig nificance to life in ext reme enviro nmentsJ.Geolo -gy ,

29、1998, 26:851-854.13 Boetius A , R avenschlag K , Schubert C J, et al . Amar ine micro bial co nso rtium appar ently mediating an -aero bic o x idat ion of met haneJ. Nature , 2000, 407:623-625.14 T hiel V , Peckmann J, Seifer t R, et al . H ig hly isoto p -ically depleted iso pr eno ids:mo lecular m

30、ar ker s fo rancient methane v ent ing J. Geochim C osm ochim Ac -ta , 1999, 63:3959-3966.15 V alentine D L , R eeburg h W S. N ew perspectiv es onanaero bic methane ox idatio n J. Environ Microbiol , 2000, 2:477-484.16 L ano il B D, Sassen R, M yro n T , et al . Nealson.Bacter ia and A r chaea phys

31、ically asso ciated w ith Gulf o f M ex ico Gas Hy dr atesJ.Applied and Environmen -tal Microbiology , 2001, 67(11 :5143-5153.17 K uhs W F , K lappro th A, Go tthardt F , et al . T hefo rmatio n of meso -and macro po rous gas hy dr atesJ. Geophys Res Lett , 2000, 27:2929-2932.18 H oehler T M , A lper

32、in M J, A lbert D B, et al . F ieldand laborat ory studies of methane ox idatio n in an an -ox ic ma rine sediment:ev idence for a methanog en -su-l fate reducer consor tiumJ.Global Biogeochem Cycles , 1994, 8:451-463.19 T ho msen T R , Finster K, R amsing N B. Biog eochem -ical and mo lecular sig n

33、atur es of anaer obic methane o x-idat ion in a marine sedimentJ. Appl Environ Microb-iol , 2001, 67:1646-1656.20 O rphan V J, H ouse C H , H inrichs K , et al . M ultiplear chaeal g ro ups mediate methane ox idatio n in anox ic cold seep sediments J .Micrology, 2002, 99(11 :7663-7668. 21 Balo ws A

34、, T ruber H G, Dwo rkin M , et al . T he P ro -kary otes M . N ew Yo rk:Spring er -V erlag P ress, 1992.22 Broo ks J M , Cox H B, Br yant W R, et al . Associa -tio n o f g as hy dr ates and o il seepage in the G ulf ofM ex icoJ. Org Geochem , 1986, 10:221-234.23 K ennicutt M C, Br oo ks J M , Deno u

35、x G J. L eakag e of deep, reservo ir ed petro leum to t he near sur face of the G ulf of M exico continental slo pe J . Mar Chem , 1988, 24:39-59.24 L i L, K ato C, H or ikoshi K. M icro bial div ersity insediments collected fr om the deepest cold -seep area J. The Japan Trench Marine Biotechnology

36、, 1999,99 /1:391-400.25 T y ler P A, Ger man C R, Ramir ez -L io dr a E, et al . U nderstanding the biog eog raphy of chemo sy nt hetic e -cosy st emsJ. Oceanologica Acta , 2003, 25:227-241. 26 于曉果, 李家彪. 天然氣水合物分解及其生態環境效應研究進展J.地球科學進展, 2004, 19(6 :947-954.27 Boivin -Jahns V , Bianchi A, Ruim y R , et

37、al . Compar-i sio n of phenot ypical and mo lecular methods for theidentif ication o f bacterial stra ins iso lated fro m a deep subsur face env iro nment J.Appl Environ Microbiol , 1995, 61(9 :3400-3406.28 Amann R I, Ludw ig W , Schleifer K H. Phylog enetic identif ication and in situ detectio n of

38、 indiv idual micro -bial cells w ithout cult ivationJ.Microbiol Rev , 1995, 59:143-169.29 Bach H J, Errampalli D, L eung K T , et al . Specificdetectio n o f the g ene fo r the ex tracellular neutr al pro -tease of Bacillus cer eus by P CR and blo t hybridizatio n J.Appl Environ Microbiol , 1999, 65

39、:3226-3228.30 M ur ray A E, H ollihaugh J T , O rr ego C. Polyg eneticco mpo sitio ns o f bacter ioplankton fro m tw o California estuar ies co mpar ed by denatur ing gr adient gel electro -phor esis o f 16s rD NA frag ments J .Appl Environ Microbiol , 1996, 62:2676-2680.31 Ro ndon M R, August P R,

40、Bet termann A D, et al .Clo ning the soil metag enome:a st rateg y fo r accessing the g enetic and functional diver sity of uncultur ed m-icro org anismsJ.Appl Environ Microbiol , 2000, 66:2541-2547.32 Lee D H , Zo Y G, K im S J. N onradioactive metho d tostudy genetic pro files of natural bacterial communities by PCR -single -co nfo rmation poly -mo rphismJ. Appl Environ Microbiol , 1996, 62:3112-3220.33 Felske A, Akkermans A D L. Quantification