1、Westernblot 實驗目的 western 技術是用來檢測蛋白表達的特定的靈敏的方法。 原理 與 Southern 或 Northern 雜交方法類似， 但 WesternBlot 采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，探針”是抗體，顯色”用標記的二抗。經過 PAGE 分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛

2、應用于檢測蛋白水平的表達。 三、操作步驟（一）樣品處理 1 培養的細胞： 去培養液后用溫的 PBS 沖洗 23 遍（冷的 PBS 有可能使細胞脫落）。 加入適量的冰預冷的裂解液后置于冰上 1020min。 用細胞刮刮下細胞，收集在 EP 管后超聲（100200w）3s,2 次。 （4）12000g 離心，4C,2min。 取少量上清進行定量。 將所有蛋白樣品調至等濃度，充分混合沉淀后加 loadingbuffer 后直接上樣最好， 剩余溶液（溶于 1Xoadingbuffer）可以低溫儲存，-70C 一個月，-20C 一周，4c1-2天,每次上樣前 98C,3min。 或收取細胞于 EP 管中

3、加入適量的 1XSDS,吹勻，100 度 5min,重復一次。 1200rpm,10min.取上清定量。 3.組織： 勻漿對于心肝脾腎等組織可每 50100mg 力口 1ml 裂解液，肺 100200mg 加 1ml 裂解液?？墒謩踊螂妱觿驖{。注意盡量保持低溫，快速勻漿。 12000g 離心，4C,2min。 取少量上清進行定量。 將所有蛋白樣品調至等濃度， 充分混合沉淀加 loadingbuffer 后直接上樣最好， 剩余溶液 （溶于 1Moadingbuffer）可以低溫儲存，-70C 一個月，-20C 一周，4c12 天，每次上樣前98C,3min。 由于蛋白酶抑制劑可影響蛋白定量，且新

4、鮮蛋白很少降解，故可不加，如加按建議比例即可。提取磷酸化的蛋白還需加 Na3VO40.1mM 及 NaF25mM）。 1loadingbuffer 配方：10%甘油，50mMTrisCl（pH6.8）,2%&琉基乙醇，0.20.5%澳酚藍，2%或 5%的 SDS。Buffer 可配成 2 墳 5%注意 SDS 終濃度勿超過 10%。 對于心臟，肌肉等碎屑較多的組織可用 5%的 SDS,肝腎等組織 2%即可。） （二）配膠1 .注意一定要將玻璃板洗凈，最后用 ddH2O 沖洗，將與膠接觸的一面向下傾斜置于干凈的紙巾晾干。 分離膠及濃縮膠均可事先配好（除 AP 及 TEMED 外），過濾后

5、作為儲存液避光存放于 4C,可至少存放 1 個月，臨用前取出室溫平衡加入 10%AP 及 TEMED. 2 .封膠： 灌入 2/3 的分離膠后應立即封膠，膠濃度10%時可用 0.1%的 SDS 封，濃度10%時用水飽和的異丁醇或異戊醇，也可以用 0.1%的 SDS。封膠后切記，勿動。本實 驗室一般用水或異丙醇封膠。 待膠凝后將封膠液倒掉，如用醇封膠需用大量清水及 ddH2O 沖洗干凈，然后加少量 0.1%的SDS,目的是通過降低張力消除殘留水滴。片刻后倒掉 SDS,將玻璃板倒立放置片刻控凈。 3.封好濃縮膠后 1h 拔除梳子，注意在拔除梳子時宜邊加水邊拔，以免有氣泡進入梳孔使梳孔變形。 撥出梳

6、子后用 ddH2O 沖洗膠孔兩遍以去除殘膠即可上樣， 長時間有利于膠結構的形成，因為肉眼觀的膠凝時其內部分子的排列尚未完成。 （10%的 AP 最好現配現用， 如在 4c 存放勿超過兩周。 30%的丙烯酰胺如有沉淀， 最好棄掉.） 各種分離膠 M種組價名林 各種凝膠體松所 對購的各種紈份的取樣錄 5nil lOttil 151111 2011U fioGrl HP 26 VA 一Q in5 iJ?AcivlaiticL? 1 !: 4 L5MliHel(pH8.B) U 2.5 丸g 5.0 10%9DS 0E5 0IC C.15 0.20 10%AP 0.05 010 115 0.2D TH

7、MFD 0CK14 nn-is 0017 0.016 的nCfl H2O T- 4,6 6S 9J 30?oAciylamcle 13 2-7 4 5;- I5MTi-Hcl(pH53) 13 2.5 3S 50 i Lf0 010 L c、. 10?oAP 0.05 010 0.15 020 IEMED O.OOJ o.oos 0009 0.012 10oGel H2Q 15 41 5.S) 75 3Q?uAciylannde 17 33 5 6.7 15MTriHclCpHS31 15 2弋 3.3 50 !。%$口， 0.05 0.10 0.15 O.2D 109AP 0.05 0.10

8、 0.15 O.2D ILMED 0.002 Q.(E 0.006 o.cos 1Z*oGI H2O 1.6 5J 4.9 66 S。oAciyiamide 7 4 6 8 L5MTtii-Hd：pH3.8- 13 J 3.3 5.0 IOHSDS 。3 o.ii) Q; O.2D lOuAP 005 口10 015 0.20 TEMED 0.002 。 由。4 O.OOS o.ocs 15%GM H2O 1.1 2.3 3.4 4.6 PrtAciyl.nrnde 25 S(1 了.5 U1) 1.5MIm-HclCpHS.K 1.J 工x 3.3 5(J 10?SDS 0.05 0.10

9、0.15 O.2D 10KAP 0.05 O.LO 0.15 0.20 TEVED 0002 0004 OOOfi 0CiOS 5%濃緬腹 一種組份弘稱各刊舉上收休日班對應的的取樣吊 lull 2nd Sull hid 5LLI1 MtJ Sui lOuil 0.68 1.40 210 250 340 4.10 5,50 8月 imide 033 050 0.6 0S3 1.00 130 1.7 1.5MTris-Hcl(pHSS) 0.13 。一” OSS 050 063 I00 1.25 0.01 0.02 003 038 005 0.06 0,08 0.10 10%AP 0.01 0.0

10、2 0心 。的 005 0.06 008 0。 TFNfED 0.001 0W2 0003 0005 0006 n.fms I-UHO (三)電泳 1 .上樣前將膠板下的氣泡趕走。 2 .在需要的地方加入 marker(Fermentas)3ul 所有蛋白樣品調至等濃度后上樣或上等 量的蛋白，樣品兩側的泳道用等體積的 1loadingbuffer 上樣，Marker 也用 1loadingbuffer 調整至與樣品等體積。 3 .以初始電壓為 100V 強度進行電泳， 當 marker 分開后換用 150V 至距膠下緣 1cm 以上結束。 （四）轉膜 毗轉印槽的鎖歷程股支架轉印央系蛇口轉印央（

11、1）支撐麟膠（2）印跡膜（3兩側有纖維村墊和油紙H）確保海膠三明治內的完全接觸口掇膠夾垂直插入緩沖液槽中Q 1 .電泳結束前 10min 戴上手套開始準備： 浸泡 NC 膜：將 NC 膜平鋪于去離子水面，靠毛細作用自然吸水后再完全浸入水中 10min 以排除氣泡，隨后浸泡入轉移液中。PVDF 膜則在 M-OH 中浸泡 20min 以上后轉入轉移液中。將濾紙也浸入轉移液中。 2 .取膠： 將膠卸下，保留 30-100KD 或分子量范圍更廣些的膠（以便以后雜其他感興趣的蛋白），左上切角，在轉移液中稍稍浸泡一下，置于潔凈玻璃板上，按順序鋪上膜與每側一張（干轉每側三張）濾紙。注意用玻棒逐出氣泡，剪去濾

12、紙與膜的過多部分（尤其是干轉，以防止短路） 3 .轉股： 濕轉：電轉槽用去離子水淋洗晾干，加入轉膜液。將膠平鋪于海綿上，滴加少許電轉液再次驅趕氣泡，封緊后放入電轉槽，注意膜在正極一側。降溫，將電泳槽置于冰水混合物中。100 伏 80min 左右，注意不同蛋白的要求不同。 干轉：用電轉液淋洗石墨電極，濾紙吸干，鋪上膠，再滴少許電轉液，以 1.5mA/cm2 凝膠面積轉移 1-2h。負載電壓不宜超過 1V/cm2 膠面積。 （五）封閉 5%脫脂奶，室溫 1h。 （六）免疫反應 1 用 TBST 洗膜刈/5min. 2 加入一抗，4c 放置 12hr 以上。 3 棄一抗，用 TBST 洗膜 M 4

13、加入辣根過氧化物酶偶聯的二抗平穩搖動,室溫 1h。 棄二抗，用 TBST 洗膜 X3/5min. （七）顯色 現常用的有底物化學發光 ECL 和底物 DAB 呈色，體同水平和實驗條件的是用第一種方法，目前發表文章通常是用底物化學發光 ECLo 只要買現成的試劑盒就行，操 作也比較簡單，原理如下（二抗用 HRP 標記）：反應底物為過氧化物+魯米諾，如遇到 HRP,即發光，可使膠片曝光，就可洗出條帶。 本實驗室用 FUJI 儀器進行掃描膜（具體見儀器使用說明）四、主要試劑 1、烯酰胺和 N,N-亞甲雙丙烯酰胺，應以溫熱(以利于溶解雙丙稀酰胺)的去離子水配制含有29%(w/v)內稀酰胺和 1%(w/

14、v)N,N-亞甲雙丙烯酰胺儲存液丙稀酰胺 29g,N,N-亞甲叉雙丙稀酰胺 1g,加 H2O 至 100ml。)儲于棕色瓶，4c 避光保存。嚴格核實 PH 不得超過 7.0,因可以發生脫氨基反應是光催化或堿催化的。使用期不得超過兩個月，隔幾個月須重新配制。如有沉淀，可以過濾。 2、十二烷基硫酸鈉 SDS 溶液:10%(w/v)0.1gSDS,1mlH2O 去離子水配制，室溫保存。 3、分離膠緩沖液：1.5mol/LTris-HCL(pH8.8):18.17gTris、水 75ml 再加 HCL 至 pH8.8,加水稀釋到 100ml 終體積。 4、 濃縮膠緩沖液：1mol/LTris-HCL(

15、pH6.8):12.11gTris 溶于 75mlH2O 中， 用 HCL 調至 pH6.8加水稀釋到 100ml 終體積。這兩種緩沖液必須使用 Tris 堿制備，再用 HCL 調節 PH 值，而不用 Tris.CLo 5、TEMED 原溶液：實驗室有商品化的可直接用。 6、2SDS 加樣緩沖液:pH6.80.5mol/LTris 緩沖液 8ml,甘油 6.4ml,10%SDS12.8ml,琉基乙醇3.2ml,0.05%澳酚藍 1.6ml,H2O32ml 混勻備用。按 1:1 或 1:2 比例與蛋白質樣品混合，在沸水終煮 3min 混勻后再上樣，一般為 20-25ul,總蛋白量 100 小田

16、7、Tris-甘氨酸電泳緩沖液：30.3gTris,188g 甘氨酸，10gSDS,用蒸儲水溶解至 1000ml,得0.25mol/LTris-1.92mol/L 甘氨酸電極緩沖液。臨用前稀釋 10 倍。 8、轉移緩沖液：配制 1L 轉移緩沖液，需稱取 2.9g 甘氨酸、5.8gTris 堿、0.37gSDS 并加入200ml 甲醇，加水至總量 1L。 或 10 洋專膜液：Tris 堿 30.28,甘氨酸 150.14 至 800ml. 9、麗春紅染液儲存液：麗春紅 S2g 三氯乙酸 30g 磺基水楊酸 30g 加水至 100ml 用時上述儲存液稀釋 10 倍即成麗春紅 S 使用液。使用后應予

17、以廢棄。 10、脫脂奶粉 5%(w/v)0 11、BST20mmol/LTris/HCL(pH7.5),500mmol/NACL.Tween 按 1：1000 加入。 12、過化物酶標記的二抗。 五.常見問題 1 .如何選擇最合適的蛋白雜交膜？ 解答：蛋白質印跡雜交是分子生物學實驗中極為常用的一門技術。選擇質量上層、 合乎要求、方便適用的雜交膜是決定這項實驗成敗的重要環節。根據雜交方案、 被轉移生物大分子的特性以及分子大小等等因素，我們要量體裁衣，從雜交膜的材質、孔徑和規格上都要做出合理的選擇。 硝酸纖維素膜：硝酸纖維素膜是蛋白印跡實驗的標準固相支持物。在低離子轉移緩沖液的環境下，大多數帶負電

18、荷的蛋白質會與硝酸纖維素膜發生疏水作用而高親和力的結合在一起，雖然這其中的機制還不是十分清楚，但由于硝酸纖維素膜的這個特性，而且易于封閉非特異性結合，從而得到了廣泛的應用。在非離子型的去污劑作用下，結合的蛋白還可以被洗脫下來。根據被轉移的蛋白分子量大小，要選擇不同孔徑的硝酸纖維素膜。因為隨著膜孔徑的不斷減小， 膜對低分子量蛋白的結合就越牢固。 但是膜孔徑如果小于 0.1mm,蛋白的轉移就很難進行了。因止匕，我們通常用 0.45 小和 0.2 小兩種規格的硝酸纖維素膜。大于 20kD 的蛋白就可以用 0.45 的膜，小于 20kD 的蛋白就要用 0.2 的膜了，如果用 0.45 小的 膜就會發生

19、“Blowthro 仙布現象。 從膜的質地上來看， 最重要的指標就是單位面積上能夠結合的蛋白的量。硝酸纖維素膜的結合能力主要與膜的硝酸纖維素的純度有關，市場上有些硝酸纖維素膜通常會還有大量的醋酸纖維素，因而降低了蛋白的結合量。S&S 公司采用的是 100%純度的硝酸纖維素，保證了最大的蛋白結合量，可達 80-150 仙 g/cm2 由于 100%的純度，因而也大大減少了非特異性的結合，降低雜交背景，無需高嚴謹度的洗脫步驟。其次，膜的強度和韌性也是需要考慮的因素。常規的硝酸纖維素膜比較脆，漂洗一兩次就會破損，不能反復使用。PVDF轉移膜：PVDF 是一種高強度、耐腐蝕的物質，通常是用來制

20、造水管的。PVDF 膜可以結合蛋白質，而且可以分離小片段的蛋白質，最初是將它用于蛋白質的序列測定，因為硝酸纖維素膜在 Edman 試劑中會降解，所以就尋找了 PDVF 作為替代品，雖然 PDVF 膜結合蛋白的效率沒有硝酸纖維素膜高，但由于它的穩定、耐腐蝕使它成為蛋白測序理想的用品，一直沿用至今。PVDF 膜與硝酸纖維 素膜一樣，可以進行各種染色和化學發光檢測，也有很廣的適用范圍。這種 PVDF 膜，靈敏度、分辨率和蛋白親和力在精細工藝下比常規的膜都要高，非常適合于低分子量蛋白的檢測。但 PVDF 膜在使用之前必需用純甲醇進行浸泡飽和 1-5 秒鐘。 離子交換型轉移膜：硝酸纖維素和 PVDF 膜是靠疏水作用結合蛋白的，還有一類膜是根據離子交換的方式結合生物大分子的。由 DEAE（二乙氨乙基）修飾的纖維素制成的 DEAE陰離子交換膜同樣可以作為蛋白質印跡的固相支持物。 DEAE 可以有效的結合陰離子基團，包括那些高于其等電點的蛋白質。在 pH10 以下，DEAE 基團都能帶電荷，在低離子強度的轉移液中結合蛋白分子。其最適的 pH 環境為 5-7。DEAE 膜可以用于蛋白多糖、病毒、酶以及血紅蛋白的研究。這種 0.45N 磯徑的 DEAE 膜，除了可以做 WesternBlot