1、（生物科技行業(yè)）分子生物學實驗指導20XX年XX月多年的企業(yè)咨詢豉問經(jīng)驗.經(jīng)過實戰(zhàn)驗證可以落地機行的卓越管理方案，值得您下載擁有分子生物學實驗指導動植物檢疫專業(yè)2012 ， 2分子生物學實驗注意事項1 課前要提前預習實驗內(nèi)容，了解實驗設計的原理，理清實驗順序，制定實驗方案（沒有方案或方案不合理者不能進入實驗操作） 。2 由于實驗內(nèi)容多，時間短，多數(shù)實驗需要同時或穿插進行，壹定要做好統(tǒng)籌安排。3 實驗課中的所有單項實驗都屬于壹個整體流程。實驗時間安排上沒有上下午晚上等嚴格的作息安排，壹切服從實驗進度，必須在理論課上課期間完成。4 實驗的每壹步都要詳細地記錄操作內(nèi)容、時間、步驟、結(jié)果等，以備查詢！

2、5 對任何自己不熟悉的實驗儀器都不要隨意操作（尤其是微量移液器！ ） 。在操作的過程中發(fā)現(xiàn)任何意外的現(xiàn)象都要及時向任課教師匯報。6 寫作實驗報告或?qū)嶒炚撐囊级ㄒ睦硗槨⑦壿嬊逦D表說明詳細，討論分析透徹。7 在實驗室內(nèi)不能大聲喧嘩。8 在實驗的過程中制造的任何垃圾都要丟到垃圾筐里（或先放在自己的桌面壹角） ，嚴禁隨地丟棄！特別注意對廢棄細菌的殺滅和有毒垃圾的定點投放。9 實驗結(jié)束后要把用過的器皿清洗后歸放整齊且清點數(shù)目，向教師匯報征得同意后方可離開實驗實。10 值日組的同學最后離開，等待清掃實驗室的衛(wèi)生，關閉門窗水電。11 實驗時損壞的任何物品都要及時申報。實驗壹質(zhì)粒DNA 的提取12 目

3、的學會最常用的小量制備質(zhì)粒 DNA 的堿裂解方法。13 原理根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒 DNA 和線性 DNA 在拓撲學上的差異來分離。在 pH12.0 12.5 這個狹窄的范圍內(nèi)，線性DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變性。盡管在這項的條件下共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒 DNA 也會變性，但倆條互補鏈彼此互相盤繞，仍會緊密結(jié)合在壹起。當加入 pH4.8的乙酸鉀高鹽緩沖液使pH 恢復中性時，共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA 復性快，而線性的染色體DNA 復性緩慢，經(jīng)過離心和蛋白質(zhì)和大分子RNA 壹起沉淀下去。14 器材1.5ml 微超凈工作臺，接種環(huán)，酒精燈，臺式離心機，旋渦混合器，微量移液取樣器， 量離心管，恒溫搖床，搖菌試管

4、，雙面微量離心管架，試管架，標簽紙，磁力攪拌機。15 試劑pMD18-T-F 載體菌， LB 培養(yǎng)基 1000ml （含 100ug/ml 氨芐青霉素） ，葡萄糖 /Tris/EDTA（GTE） 溶液（溶液I） ， NaOH/SDS 溶液 （溶液 II） ， KAc 溶液（ pH4.8 ） （溶液 III） ，RNaseA ， 95% 乙醇， 70% 乙醇， TEbuffer （ pH8.0 ） 。16 實驗準備氨芐青霉素儲存液（無菌水配制 5mg/ml ，分裝后 -20 C 保存） ，配制 LB 培養(yǎng)基（胰化蛋白胨 10g ， 酵母提取物 5g ， NaCl10g 加 200mLddwate

5、r 攪拌完全溶解， 用約 200 L5NNaOH 調(diào) pH 至 7.0 ，加 ddwater 至 1L ， 121 C20min 滅菌） ；溶液 I （50mmol/L 葡萄糖， 25mmol/LTrisHClpH8.0 ， 10mmol/LEDTApH8.0 ） ；溶液 II （ 0.2mol/LNaOH ， 1%SDS ） ； 溶液 III（ 60mL5mol/LKac ， 加冰乙酸調(diào)pH4.8 ， 補 ddwater 至 100ml ） ， 70% 乙醇 （-20 C保存） ， TEbuffer （ 10mmol/LTrisHClpH8.0 ， 1mmol/LEDTApH8.0 ） ；

6、10mg/mLRNaseA（ RNA 酶 A 溶于 10mmol/LTrisHClpH7.5 ， 15mmol/LNaCl 中） ；搖菌試管洗凈且蓋上棉花塞、 1.5ml 離心管裝入鋁制飯盒、移液器吸頭裝入相應的吸頭盒， 壹起高壓滅菌 （ 121 C30min ） 。17 操作步驟（ 1 ）在超凈工作臺中取5mlLB （ Amp + ） ，加入滅菌的搖菌管中。（ 2）從超低溫冰箱中取出保存pMD-18T-F 的菌種（操作完后迅速把菌種放回超低溫冰柜中，切不可將菌融化！ ） ，在超凈工作臺上用燒紅的接種環(huán)刮壹下，再把接種環(huán)于無菌 LB 培 養(yǎng)液（含 100ug/ml 氨芐青霉素）中攪拌壹下， 3

7、7 C 搖床中搖 20h 。（ 3） 取 1.5ml 的菌液于 1.5ml 離心管中， 15000rpm 離心 1min ， 棄上清液 （盡量棄干凈） ， 留沉淀備用。（4）在沉淀中加入 100 l溶液I,蓋上蓋后立即在渦旋混合器上混勻，室溫下靜置 5min。（等待的同時，取壹個塑料盒，裝上適量的冰塊備用。 ）（ 5）加入 200 l 溶液 II ，蓋上蓋后上下顛倒幾次混勻，插入冰中，放置5min 。（6）加入 150 l 溶液 III ，蓋上蓋后上下顛倒幾次混勻，插入冰中，放置5min 。（ 7） 15000rpm 離心 5min ，小心吸取400 l 上清液于另壹個干凈的 1.5ml 離心

8、管中， （不要將白色沉淀物帶入！ ） ，加入 800 l95% 乙醇，蓋上蓋后立即在渦旋混合器上混勻，室溫下 靜置 5min 。（ 8） 15000rpm 離心 10min ，小心棄掉上清液，加入 500 l70% 乙醇，蓋上蓋后立即在渦旋混合器上混勻。 15000rpm 離心 10min ，小心棄掉上清液，盡量倒置棄干凈（ 9） 再加入 500 l70% 乙醇， 蓋上蓋后立即在渦旋混合器上混勻。 15000rpm 離心 10min ， 小心棄掉上清液，盡量倒置棄干凈（10）離心管倒置于37 C培養(yǎng)箱中（或室溫）空氣干燥。（管底的沉淀質(zhì)粒 DNA用肉眼幾乎見不見！ ） 。（ 11 ） pMD1

9、8-T-F 加入 30 l 無菌蒸餾水或TE 緩沖液，用記號筆標記后放入冰箱中備用。（12 ）在剩余的菌液中倒入少許84 消毒液，待溶液變清亮后隨廢液和剩余的冰塊壹起倒入下水池。清理桌面，清洗儀器，撰寫實驗報告7 思考（ 1 ）影響本實驗結(jié)果的因素有哪些？實驗二、質(zhì)粒DNA 的酶切1 目的學會用限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒 DNA 。2 原理II 型限制性內(nèi)切酶能識別雙鏈DNA 內(nèi)部的特殊序列且在識別位點處將雙鏈切斷，形成粘性末端或齊平末端，通過電用酶切后的 DNA 混合物能夠確認和分離酶切片段。3 器材旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭， 1.5ml 微量離心管，雙面微量離心管架，水漂，恒溫水浴

10、。4 試劑pMD18-T-F 質(zhì)粒，EcoRI, BamHI ,內(nèi)切酶緩沖液（10 x）, 10 x電泳加樣緩沖液5 實驗準備配制 TAE 電泳緩沖液（ 50 儲存液） ， 1000 溴化乙錠儲存液（ 0.5mg/ml ） ， 10 加樣緩沖液，1.5ml 離心管裝入鋁制飯盒（滅菌）、移液器吸頭裝入相應的吸頭盒（滅菌）6 操作步驟（ 1 ）混合下列溶液于壹個無菌的1.5ml 微量離心管中：pMD18-T-FDNA（或 pUCm-T-F）6 510 X酶切緩沖液（用 EcoRI的緩沖液）2 dLddwater30 科 LEcoRIIBamHII總體積40 L（ 2 ）先準備壹個冰盒且放入壹定量的

11、冰塊。從-20 冰柜中取出限制性內(nèi)切酶，立即插入冰塊中。（ 3 ）用壹只手的手指捏在盛放酶的微量離心管的上部（以免手指的給酶液加溫） ，另壹只手持微量移液器，小心翼翼地吸取1 wL限制性內(nèi)切酶。（ 4 ）在酶切樣品混合液中加入限制性內(nèi)切酶后（立即把內(nèi)切酶原液送回冰柜！ ） ，輕輕震動微量離心管使管中的溶液混勻。再在離心機中 1000rpm 離心 10 秒。取出后插到水漂的孔中，在推薦的最適酶切溫度水浴中溫育1-3h （壹般是 37 ） 。（ 5 ）酶切后取少量酶切產(chǎn)物和合適的已知分子量的 DNA （如先前的 PCR 產(chǎn)物）對比電泳，以確認切下的片斷是否為自己想要的片斷。（ 6 ）酶切后的質(zhì)粒能

12、夠回收備用。（ 7 ）清理桌面垃圾，清洗實驗儀器。撰寫實驗報告。7 思考（ 1 ）酶切反應混合物的體積是否對酶切效果有影響？為什么？（ 2 ）如何估計DNA 用量和酶的用量？(3)在吸取內(nèi)切酶的時候如何操作才能別免浪費?實驗三、質(zhì)粒DNA的PCR擴增1 .目的學會PCR操作的基本技術。2 .原理是將待擴增的DNA模板加熱變性，和其倆側(cè)互補的寡聚核甘酸引物復性，然后經(jīng)過耐熱的DNA聚合酶延伸。再進入下壹輪變性一復性一延伸的循環(huán)，n次循環(huán)后DNA可被擴增(1+X)叱言。其中25nt的引物退火溫度 Tm=2 (A+T ) +4 (G+C)。3 .器材旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，0.2ml

13、PCR微量管，雙面微量離心管架，PCR儀，臺式離心機，瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)，水漂，恒溫水浴。4 .試齊IJ3U/ 科 ITaqDNA聚合酶，PCR 緩沖?夜(10X, MgCl 2free ), 25mMMgCl 2, dNTP，引物， 模板質(zhì)粒 pMD18-T-F ,無菌ddwater 。5 .實驗準備dNTP混合液(每種25mM ), TAE電泳緩沖液，1000澳化乙錠儲存液(0.5mg/ml ), 10加樣緩沖液，1.5ml離心管裝入鋁制飯盒(滅菌)、移液器吸頭裝入相應的吸頭盒(滅菌)。合成的引物：Senseprimer5'-GGATCCGCGCAATCTGTTCCTTATGGC-

14、3'Antisenseprimer5'-GAATTCTTGTGCAGCTGCTTGTACGTTG-3'目的基因模板質(zhì)粒：已經(jīng)克隆在pMD18-T-F 載體上的781bpNDV-F 基因。待擴增的F片段長度：837bp 。6 .操作步驟(1)在0.2mlPCR微量離心管中配制 50科反應體系。ddwater32 科 110 xPCRbuffer (不含 MgCl 2) 5 口25mMMgCl 23 口2.5mmol/LdNTP4 科 l (每dNTP 終濃度 0.2mM )10mol/LPrimer12 12.5 十 25pmoles )10(imol/Lprimer22

15、 (12.5 25pmoles )模板質(zhì)粒 1(1 X10-3pmoles )3U/ /Taq 酶 1 / (3u)總體積50 /(2)根據(jù)廠商的操作手冊設置 PCR儀的循環(huán)程序： 94 C5min 94 C 1min 60 C 1min 72 C 1min50s goto 29times 72 C 10min（3） PCR結(jié)束后，取10科產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。觀察膠上是否有預計的主要產(chǎn)物帶。 （ 4 ）清理桌面，撰寫實驗報告。7 思考（ 1 ）復性溫度如何確定？（ 2 ）為什么要在最后延伸 10min ？（ 3 ）是否有非特異性擴增產(chǎn)物（或引物二聚體） ，如何才能消除？實驗四、 DNA 電

16、泳鑒定1 目的學會常用的 DNA 瓊脂糖凝膠電泳、 。2 原理DNA 雙螺旋分子骨架倆側(cè)帶有含負電荷的磷酸根，在電場中會向正極方向移動。不同長度的 DNA 由于受到凝膠介質(zhì)的阻力不同，表現(xiàn)為不同的遷移率而被分開。3 器材電泳儀，水平凝膠電泳槽和梳子及其制膠模塊， 250ml 三角瓶，微波爐，臺式離心機，旋渦混合器，凝膠成像系統(tǒng)，分光光度計，微量移液取樣器， 1.5ml 離心管，雙面微量離心 管架，試管架等。4 試劑pMD18-T-F 載體， TAE 電泳緩沖液， 1000 溴化乙錠儲存液，電泳級瓊脂糖粉， 10 加樣緩沖液（或 6 加樣緩沖液） ， DNA 分子量標準（ DNAHindIII:

17、23130 ， 9420 ， 6560 ， 4360 ， 2320 ， 2030 ， 560 ， 130bp ） 。5 實驗準備配制 TAE 電泳緩沖液（ 50 儲存液， pH 約 8.5 ： Tris 堿 242g ， 57.1ml 冰乙酸，37.2gNa 2EDTA.2H 2O ， ddwater 定容至 1L） ， 1000 溴化乙錠儲存液（ 0.5mg/ml ： 50mg 溴化乙錠溶于100mLddwater ， 4 C 避光儲存） ， 10 加樣緩沖液（ 20%Ficoll400 ，0.1mol/LNa 2EDTApH8.0 ， 1.0%SDS ， 0.25% 溴酚藍） ； 6 加樣

18、緩沖液（ 0.25% 溴酚藍， 40%蔗糖水溶液） ； 1.5ml 離心管裝入鋁制飯盒（滅菌） 、移液器吸頭裝入相應的吸頭盒（滅菌） 。6 操作步驟（ 1 ）稱取 0.5g 瓊脂糖粉，放入三角瓶，加入 50mlTAE 電泳緩沖液（1 ） ，放入微波爐中燒開（ 1min ） 。 50ml 正好倒倆塊小膠。（ 2 ）注意觀察燒瓶中的瓊脂糖粉末，待完全熔化后停止微波爐（切不可讓膠溶液溢出到微波爐中！ ） 。（ 3 ）戴上線手套，從微波爐中取出三角瓶，置桌面上冷卻致不燙手（約 50-60 C ） 。（ 4 ）把梳子插到凝膠灌制模具的正確位置后緩緩倒入膠溶液。膠溶液倒至和模具的矮邊緣相平即可，不要把膠溶液溢到外面。在桌面上靜置10-20 分鐘待膠完全凝固。 （剩下的膠溶液封口后留待以后再熔化使用） 。（ 5 ）在水平電泳槽中加滿1 TAE 電泳緩沖液。根據(jù)電泳槽的長度把電泳儀的電壓調(diào)至170V（10V/cm） ，注意正負電極的位置連接正確。（ 6 ）待膠完全凝固后（ 15-20 分鐘） ，小心拔出梳子。用手指捏住模具倆