1、研究蛋白互作的方法蛋白互作的研究一直以來(lái)都受到重視，是研究細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等非常重要的方面。我就我現(xiàn)在做過(guò)的方法給大家介紹一下，拋磚引玉了，大家多補(bǔ)充糾正一下吧常用的體外互作研究方法：1、酵母雙雜交（yeast two-hybrid,Y2h)酵母雙雜交作為最經(jīng)典的蛋白互作方法一直沿用至今，并且仍然保持著自己的優(yōu)勢(shì)。酵母雙雜交系統(tǒng)能在體內(nèi)測(cè)定蛋白質(zhì)的結(jié)合作用， 具有高度敏感性。酵母雙雜交系統(tǒng)的最主要的應(yīng)用是快速、直接分析已知蛋白之間的相互作用及分離新的與已知蛋白作用的配體及其編碼基因。優(yōu)點(diǎn)在于:優(yōu)點(diǎn): 作用信號(hào)是在融合基因表達(dá)后， 在細(xì)胞內(nèi)重建轉(zhuǎn)錄因子的作用而給出的， 省去了純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。

2、檢測(cè)在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行， 可以在一定程度上代表細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)情況。 檢測(cè)的結(jié)果可以是基因表達(dá)產(chǎn)物的積累效應(yīng)， 因而可檢測(cè)存在于蛋白質(zhì)之間的微弱的或暫時(shí)的相互作用。 酵母雙雜交系統(tǒng)可采用不同組織、器官、細(xì)胞類(lèi)型和分化時(shí)期材料構(gòu)建cDNA文庫(kù)， 能分析細(xì)胞漿、細(xì)胞核及膜結(jié)合蛋白等多種不同亞細(xì)胞部位及功能的蛋白。但是酵母雙雜交有自己的缺點(diǎn)： 雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用定位于細(xì)胞核內(nèi)， 而許多蛋白間的相互作用依賴(lài)于翻譯后加工如糖基化、二硫鍵形成等， 這些反應(yīng)在核內(nèi)無(wú)法進(jìn)行。 另外有些蛋白的正確折疊和功能有賴(lài)于其他非酵母蛋白的輔助， 這限制了某些細(xì)胞外蛋白和細(xì)胞膜受體蛋白等的研究。 酵母雙雜交系統(tǒng)的一個(gè)重

3、要的問(wèn)題是"假陽(yáng)性"。由于某些蛋白本身具有激活轉(zhuǎn)錄功能或在酵母中表達(dá)時(shí)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用， 使DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域雜交蛋白在無(wú)特異激活結(jié)構(gòu)域的情況下可激活轉(zhuǎn)錄。另外某些蛋白表面含有對(duì)多種蛋白質(zhì)的低親和力區(qū)域， 能與其他蛋白形成穩(wěn)定的復(fù)合物， 從而引起報(bào)告基因的表達(dá)， 產(chǎn)生"假陽(yáng)性"結(jié)果。“假陽(yáng)性”對(duì)策：即使根據(jù)嚴(yán)格的對(duì)照實(shí)驗(yàn)證明確實(shí)發(fā)生了蛋白間的相互作用，還應(yīng)對(duì)以下方面進(jìn)行分析： (1)這種相互作用是否會(huì)在細(xì)胞內(nèi)自然發(fā)生,即這一對(duì)蛋白在細(xì)胞的正常生命活動(dòng)中是否會(huì)在同一時(shí)間表達(dá)且定位在同一區(qū)域。 （2)某些蛋白如是依賴(lài)于遍在蛋白的蛋白酶解途徑的成員,它們具有普遍

4、的蛋白間的相互作用的能力。 （3)一些實(shí)際上沒(méi)有任何相互作用的但有相同的模體(motif)如兩個(gè)親a-螺旋的蛋白質(zhì)間可以發(fā)生相互作用。所以對(duì)于做出來(lái)有互作的結(jié)果還應(yīng)該繼續(xù)通過(guò)別的方法來(lái)驗(yàn)證。“假陰性”的產(chǎn)生：一是融合蛋白的表達(dá)對(duì)細(xì)胞有毒性。這時(shí)應(yīng)該選擇敏感性低的菌株或拷貝數(shù)低的載體。二是蛋白間的相互作用較弱，應(yīng)選擇高敏感的菌株及多拷貝載體。目前假陰性現(xiàn)象雖不是實(shí)驗(yàn)中的主要問(wèn)題,但也應(yīng)予以重視。2、免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）用抗體將相應(yīng)特定分子沉淀的同時(shí)，與該分子特異性結(jié)合的其他分子也會(huì)被帶著一起沉淀出來(lái)的技術(shù)。這種技術(shù)常用于驗(yàn)證蛋白質(zhì)之間相互特異性結(jié)合。是確定兩

5、種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。 其原理是：當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來(lái)。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來(lái)。這種方法常用于測(cè)定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。優(yōu)點(diǎn)在于：（1）相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的，處于天然狀態(tài)； （2）蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的，可以避免人為的影響； （3）可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。缺點(diǎn)在于：（1）可能檢測(cè)不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用； （2）兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合，而

6、可能有第三者在中間起橋梁作用； （3）必須在實(shí)驗(yàn)前預(yù)測(cè)目的蛋白是什么，以選擇最后檢測(cè)的抗體，所以，若預(yù)測(cè)不正確，實(shí)驗(yàn)就得不到結(jié)果，方法本身具有冒險(xiǎn)性。所以可以作為酵母雙雜交的進(jìn)一步的驗(yàn)證，達(dá)到互補(bǔ)的效果。體內(nèi)互作的研究1、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)：當(dāng)一個(gè)熒光分子(又稱(chēng)為供體分子)的熒光光譜與另一個(gè)熒光分子(又稱(chēng)為受體分子) 的激發(fā)光譜相重疊時(shí)，供體熒光分子的激發(fā)能誘發(fā)受體分子發(fā)出熒光，同時(shí)供體熒光分子自身的熒光強(qiáng)度衰減。FRET 程度與供、受體分子的空間距離緊密相關(guān)，一般為710 nm 時(shí)即可發(fā)生FRET; 隨著距離延長(zhǎng)，F(xiàn)RET呈顯著減弱。由于只有在蛋白之間的

7、距離達(dá)到10nm一下才會(huì)發(fā)生FRET，而10nm要小于蛋白互作要求的距離，所以FRET是衡量體內(nèi)互作的強(qiáng)有力的證據(jù)。2、雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)是由Hu等在2002年最先報(bào)道的一種直觀、快速地判斷目標(biāo)蛋白在活細(xì)胞中的定位和相互作用的新技術(shù)。該技術(shù)巧妙地將熒光蛋白分子的兩個(gè)互補(bǔ)片段分別與目標(biāo)蛋白融合表達(dá)，如果熒光蛋白活性恢復(fù)則表明兩目標(biāo)蛋白發(fā)生了相互作用.其后發(fā)展出的多色熒光互補(bǔ)技術(shù)(multicolor BiFC)，不僅能同時(shí)檢測(cè)到多種蛋白質(zhì)復(fù)合體的形成，還能夠?qū)Σ煌鞍踪|(zhì)間產(chǎn)生相互作用的強(qiáng)弱進(jìn)行比較.目前，該技術(shù)已用于轉(zhuǎn)錄因子，G蛋白亞基的二聚體形式，不同蛋白質(zhì)間產(chǎn)生相互作用強(qiáng)弱的比較以及

8、蛋白質(zhì)泛素化等方面的研究工作上。由于BiFC的直觀，而且在最接近活細(xì)胞生理狀態(tài)的條件下觀察到其相互作用發(fā)生的時(shí)間、位置、強(qiáng)弱、所形成蛋白質(zhì)復(fù)合體的穩(wěn)定性，以及細(xì)胞信號(hào)分子對(duì)其相互作用的影響等，這些信息對(duì)研究蛋白質(zhì)相互作用有一定意義。所以，BiFC越來(lái)越受到研究人員的青睞。酵母雙雜交的相關(guān)知識(shí)時(shí)間：2009-12-29 16:45:17 來(lái)源： 作者： 點(diǎn)擊： 153次 結(jié)構(gòu)組成：酵母雙雜交系統(tǒng)可應(yīng)用于確定兩已知有生理作用的蛋白間的作用位點(diǎn)或結(jié)構(gòu)域。利用此系統(tǒng)已分析和測(cè)定了多種重要結(jié)構(gòu)域， 如p85三磷酸肌醇激酶和p110亞單位作用的結(jié)構(gòu)域v， p21cip1蛋白與增殖細(xì)胞膜抗原(prolife

9、rating-cell nuclear antigen， PCNA) 的結(jié)合序列vi等。 此外酵母雙雜交系統(tǒng)還應(yīng)用于闡明蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)構(gòu)域，繪制蛋白質(zhì)聯(lián)系圖譜，在藥物設(shè)計(jì)等許多方面。特點(diǎn)與優(yōu)點(diǎn)：酵母雙雜交系統(tǒng)的最主要的應(yīng)用是快速、直接分析已知蛋白之間的相互作用及分離新的與已知蛋白作用的配體及其編碼基因。酵母雙雜交系統(tǒng)檢測(cè)蛋白之間的相互作用具有以下優(yōu)點(diǎn): 作用信號(hào)是在融合基因表達(dá)后，在細(xì)胞內(nèi)重建轉(zhuǎn)錄因子的作用而給出的，省去了純化蛋白質(zhì)的繁瑣步驟。 檢測(cè)在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，可以在一定程度上代表細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)情況。 檢測(cè)的結(jié)果可以是基因表達(dá)產(chǎn)物的積累效應(yīng)，因而可檢測(cè)存在于蛋白質(zhì)之間的微弱的或暫時(shí)的相互

10、作用。 酵母雙雜交系統(tǒng)可采用不同組織、器官、細(xì)胞類(lèi)型和分化時(shí)期材料構(gòu)建cDNA文庫(kù)，能分析細(xì)胞漿、細(xì)胞核及膜結(jié)合蛋白等多種不同亞細(xì)胞部位及功能的蛋白。例如已報(bào)道成功分析了RAP1與RIF1ii、P21cip1與CDK2iii、 p16與CDK4iv等之間的相互作用。局限性和存在的問(wèn)題酵母雙雜交系統(tǒng)是分析蛋白-蛋白間相互作用的有效和快速的方法，有多方面的應(yīng)用，但仍存在一些局限性。 雙雜交系統(tǒng)分析蛋白間的相互作用定位于細(xì)胞核內(nèi)，而許多蛋白間的相互作用依賴(lài)于翻譯后加工如糖基化、二硫鍵形成等， 這些反應(yīng)在核內(nèi)無(wú)法進(jìn)行。另外有些蛋白的正確折疊和功能有賴(lài)于其他非酵母蛋白的輔助，這限制了某些細(xì)胞外蛋白和細(xì)胞

11、膜受體蛋白等的研究。 酵母雙雜交系統(tǒng)的一個(gè)重要的問(wèn)題是"假陽(yáng)性"。由于某些蛋白本身具有激活轉(zhuǎn)錄功能或在酵母中表達(dá)時(shí)發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用，使DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域雜交蛋白在無(wú)特異激活結(jié)構(gòu)域的情況下可激活轉(zhuǎn)錄。另外某些蛋白表面含有對(duì)多種蛋白質(zhì)的低親和力區(qū)域，能與其他蛋白形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而引起報(bào)告基因的表達(dá)，產(chǎn)生"假陽(yáng)性"結(jié)果。許多研究者對(duì)雙雜交系統(tǒng)進(jìn)行了改進(jìn)和發(fā)展。例如采用假陽(yáng)性顯示分析法和雙篩選系統(tǒng)以減少"假 陽(yáng)性"的發(fā)生；發(fā)展哺乳動(dòng)物雙雜交系統(tǒng)更好地研究蛋白將的相互作用。其中雙篩選系統(tǒng)用二種不同的報(bào)告基因(常用lacZ和HIS3)有以下優(yōu)勢(shì)

12、vii: 用不同的啟動(dòng)子表達(dá)位于酵母二個(gè)染色體上的報(bào)告基因，可明顯減少假陽(yáng)性。 通過(guò)營(yíng)養(yǎng)型篩選增強(qiáng)了篩選能力，尤其適用于對(duì)較大的庫(kù)容量而被選蛋白較少情況下的篩選。 哺乳動(dòng)物雙雜交系統(tǒng)也是一種基因水平上以重建轉(zhuǎn)錄因子功能為基礎(chǔ)的體內(nèi)分析方法。在此系統(tǒng)中，一種感興趣的蛋白與Gal4-DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域構(gòu)成融合蛋白，另一種蛋白與單純皰疹病毒VP16蛋白的激活結(jié)構(gòu)域以融合蛋白表達(dá)。表達(dá)這些融合蛋白的載體與一個(gè)報(bào)道載體（CAT）共同轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。報(bào)道質(zhì)粒含一個(gè)Gal4結(jié)合位點(diǎn)下游的cat基因。假如兩個(gè)融合蛋白相互作用則cat報(bào)道基 因表達(dá)水平明顯增高。用此系統(tǒng)證實(shí)了P53蛋白與大T抗原的相互作用，

13、得到了酵母雙雜交系統(tǒng)相同的結(jié)果。且較酵母雙雜交系統(tǒng)更為快速，在轉(zhuǎn)染48h內(nèi)得到結(jié)果。并且在哺乳動(dòng)物細(xì)胞能更好模仿體內(nèi)的蛋白-蛋白相互作用。因而，哺乳動(dòng)物雙雜交系統(tǒng)可作為酵母雙雜交系統(tǒng)的輔助手段。酵母雙雜交基本原理時(shí)間：2009-12-29 16:32:07 來(lái)源： 作者： 點(diǎn)擊： 170次 酵母雙雜交系統(tǒng)由Fields和Song等首先在研究真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中建立 。典型的真核生長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄因子，如GAL4、GCN4、等都含有二個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域: DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-binding domain)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)(transcription-activating domain)。前者可識(shí)別DNA上的

14、特異序列，并使轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域定位于所調(diào)節(jié)的基因的上游，轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可同轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的其他成分作用，啟動(dòng)它所調(diào)節(jié)的基因的轉(zhuǎn)錄。二個(gè)結(jié)構(gòu)域不但可在其連接區(qū)適當(dāng)部位打開(kāi)，仍具有各自的功能。而且不同兩結(jié)構(gòu)域可重建發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用。酵母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因通過(guò)激活報(bào)道基因的表達(dá)探測(cè)蛋白蛋白的相互作用。主要有二類(lèi)載體: a 含DNA -binding domain的載體; b 含DNA-activating domain的載體。上述二類(lèi)載體在構(gòu)建融合基因時(shí)，測(cè)試蛋白基因與結(jié)構(gòu)域基因必須在閱讀框內(nèi)融合。融合基因在報(bào)告株中表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物只有定位于核內(nèi)才能驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。例如GAL4-bd具有核定位序列

15、(nuclear-localization sequence)， 而GAL4-ad沒(méi)有。因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端應(yīng)克隆來(lái)自SV40的T-抗原的一段序列作為核定位的序列。目前研究中常用binding-domain基因有： GAL4(1-147); LexA (E coli轉(zhuǎn)錄抑制因子)的DNA-bd編碼序列。常用的activating-domain基因有： GAL4(768-881)和皰疹病毒VP16的編碼序列等。雙雜交系統(tǒng)的另一個(gè)重要的元件是報(bào)道株。報(bào)道株指經(jīng)改造的、含報(bào)道基因(reporter gene)的重組質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。最常用的是酵母細(xì)胞， 酵母細(xì)胞作為報(bào)道株的酵母雙雜交系

16、統(tǒng)具有許多優(yōu)點(diǎn): 1易于轉(zhuǎn)化、便于回收擴(kuò)增質(zhì)粒。2具有可直接進(jìn)行選擇的標(biāo)記基因和特征性報(bào)道基因。3酵母的內(nèi)源性蛋白不易同來(lái)源于哺乳動(dòng)物的蛋白結(jié)合。一般編碼一個(gè)蛋白的基因融合到明確的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(如GAL4-bd， LexA-bd)； 另一個(gè)基因融合到轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(如GAL4-ad，VP16)。激活結(jié)構(gòu)域融合基因轉(zhuǎn)入表達(dá)結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合基因的酵母細(xì)胞系中，蛋白間的作用使得轉(zhuǎn)錄因子重建導(dǎo)致相鄰的報(bào)道基因表達(dá)(如lacZ)，從而可分析蛋白間的結(jié)合作用。酵母雙雜交系統(tǒng)能在體內(nèi)測(cè)定蛋白質(zhì)的結(jié)合作用，具有高度敏感性。主要是由于：采用高拷貝和強(qiáng)啟動(dòng)子的表達(dá)載體使雜合蛋白過(guò)量表達(dá)。信號(hào)測(cè)定是

17、在自然平衡濃度條件下進(jìn)行，而如免疫共沉淀等物理方法為達(dá)到此條件需進(jìn)行多次洗滌，降低了信號(hào)強(qiáng)度。雜交蛋白間穩(wěn)定度可被激活結(jié)構(gòu)域和結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物而增強(qiáng)，后者又與啟動(dòng)子DNA結(jié)合，此三元復(fù)合體使其中各組分的結(jié)合趨于穩(wěn)定。通過(guò)mRNA產(chǎn)生多種穩(wěn)定的酶使信號(hào)放大。 同時(shí)， 酵母表型，X-Gal及HIS3蛋白表達(dá)等檢測(cè)方法均很敏感。研究蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)平臺(tái)酵母雙雜交系統(tǒng)的發(fā)展和應(yīng)用時(shí)間：2010-03-08 15:40:01 來(lái)源： 作者： 點(diǎn)擊： 339次 隨著對(duì)多種重要生物的大規(guī)模基因組測(cè)序工作的完成，基因工程領(lǐng)域又迎來(lái)了一個(gè)新的時(shí)代-功能基因組時(shí)代。它的任務(wù)就是對(duì)基因組中包含的

18、全部基因的功能加以認(rèn)識(shí)。生物體系的運(yùn)作與蛋白質(zhì)之間的互作密不可分，例如：DNA合成、基因轉(zhuǎn)錄激活、蛋白質(zhì)翻譯、修飾和定位以及信息傳導(dǎo)等重要的生物過(guò)程均涉及到蛋白質(zhì)復(fù)合體的作用。能夠發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證在生物體中相互作用的蛋白質(zhì)與核酸、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)是認(rèn)識(shí)它們生物學(xué)功能的第一步。酵母雙雜交技術(shù)作為發(fā)現(xiàn)和研究在活細(xì)胞體內(nèi)的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用的技術(shù)平臺(tái)，在近幾年來(lái)得到了廣泛運(yùn)用。酵母雙雜交系統(tǒng)是在真核模式生物酵母中進(jìn)行的，研究活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用，對(duì)蛋白質(zhì)之間微弱的、瞬間的作用也能夠通過(guò)報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物敏感地檢測(cè)得到，它是一種具有很高靈敏度的研究蛋白質(zhì)之間關(guān)系的技術(shù)。大量的研究文獻(xiàn)表明，酵母雙雜

19、交技術(shù)既可以用來(lái)研究哺乳動(dòng)物基因組編碼的蛋白質(zhì)之間的互作，也可以用來(lái)研究高等植物基因組編碼的蛋白質(zhì)之間的互作。因此，它在許多的研究領(lǐng)域中有著廣泛的應(yīng)用。本文就酵母雙雜交的技術(shù)平臺(tái)和應(yīng)用加以介紹。酵母雙雜交系統(tǒng)的建立是基于對(duì)真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程的認(rèn)識(shí)。細(xì)胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。反式轉(zhuǎn)錄激活因子，例如酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4在結(jié)構(gòu)上是組件式的（modular），往往由兩個(gè)或兩個(gè)以上結(jié)構(gòu)上可以分開(kāi)，功能上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域（domain）構(gòu)成，其中有DNA結(jié)合功能域(DNA binding domain,DNA-BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（activation domain，DNA-A

20、D）。這兩個(gè)結(jié)合域?qū)⑺鼈兎珠_(kāi)時(shí)仍分別具有功能，但不能激活轉(zhuǎn)錄，只有當(dāng)被分開(kāi)的兩者通過(guò)適當(dāng)?shù)耐緩皆诳臻g上較為接近時(shí)，才能重新呈現(xiàn)完整的GAL4轉(zhuǎn)錄因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence,UAS）的下游啟動(dòng)子，使啟動(dòng)子下游基因得到轉(zhuǎn)錄。根據(jù)這個(gè)特性，將編碼DNA-BD的基因與已知蛋白質(zhì)Bait protein的基因構(gòu)建在同一個(gè)表達(dá)載體上，在酵母中表達(dá)兩者的融合蛋白BD-Bait protein。將編碼AD的基因和cDNA文庫(kù)的基因構(gòu)建在AD-LIBRARY表達(dá)載體上。同時(shí)將上述兩種載體轉(zhuǎn)化改造后的酵母，這種改造后的酵母細(xì)胞的基因組中既不能產(chǎn)生GAL

21、4，又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE，因此，酵母在缺乏這些營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)基上無(wú)法正常生長(zhǎng)。當(dāng)上述兩種載體所表達(dá)的融合蛋白能夠相互作用時(shí)，功能重建的反式作用因子能夠激活酵母基因組中的報(bào)告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1，從而通過(guò)功能互補(bǔ)和顯色反應(yīng)篩選到陽(yáng)性菌落。將陽(yáng)性反應(yīng)的酵母菌株中的AD-LIBRARY載體提取分離出來(lái)，從而對(duì)載體中插入的文庫(kù)基因進(jìn)行測(cè)序和分析工作。在酵母雙雜交的基礎(chǔ)上，又發(fā)展出了酵母單雜交、酵母三雜交和酵母的反向雜交技術(shù)。它們被分別用于核酸和文庫(kù)蛋白之間的研究、三種不同蛋白之間的互作研究和兩種蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)和位點(diǎn)。基于酵母雙雜交技術(shù)平臺(tái)的特點(diǎn)，它已經(jīng)被應(yīng)用在許多

22、研究工作當(dāng)中。1、利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的新功能酵母雙雜交技術(shù)已經(jīng)成為發(fā)現(xiàn)新基因的主要途徑。當(dāng)我們將已知基因作為誘餌，在選定的cDNA文庫(kù)中篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白，從篩選到的陽(yáng)性酵母菌株中可以分離得到AD-LIBRARY載體，并從載體中進(jìn)一步克隆得到隨機(jī)插入的cDNA片段，并對(duì)該片段的編碼序列在GENEBANK中進(jìn)行比較，研究與已知基因在生物學(xué)功能上的聯(lián)系。另外，也可作為研究已知基因的新功能或多個(gè)篩選到的已知基因之間功能相關(guān)的主要方法。例如：Engelender等人以神經(jīng)末端蛋白alpha-synuclein 蛋白為誘餌蛋白，利用酵母雙雜交CLONTECH MATCHMAR

23、KER SYSTEM 3為操作平臺(tái)，從成人腦cDNA文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)了與alpha-synuclein相互作用的新蛋白Synphilin-1，并證明了Synphilin-1 與alpha-synuclein 之間的相互作用與帕金森病的發(fā)病有密切相關(guān)。為了研究?jī)蓚€(gè)蛋白之間的相互作用的結(jié)合位點(diǎn)，找到影響或抑制兩個(gè)蛋白相互作用的因素，Michael等人又利用酵母雙雜交技術(shù)和基因修飾證明了alpha-synuclein的1-65個(gè)氨基酸殘基和Synphilin-1的349-555個(gè)氨基酸殘基之間是相互作用的位點(diǎn)。研究它們之間的相互作用位點(diǎn)有利于基因治療藥物的開(kāi)發(fā)。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題時(shí)間：2010-03-

24、08 15:55:53 來(lái)源： 作者： 點(diǎn)擊： 66次 1.如果誘餌蛋白對(duì)酵母細(xì)胞是有毒的，該怎么辦？在某些情況下，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)不好的菌珠可以在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)得很好。首先重懸克隆于1ml的SD/Trp，接著將重懸液平鋪于5 個(gè)100-mm的SD/Trp平板，在30下溫浴，直至平板上的克隆相互粘在一起。用5ml 0.5X YPDA刮下每塊板上的克隆，并收集到一管中，這樣就可以使用這個(gè)細(xì)胞重懸液進(jìn)行正常的雜交反應(yīng)。2.如果誘餌蛋白能直接激活報(bào)告基因的表達(dá)，該如何處理？該蛋白很可能有轉(zhuǎn)錄激活域，是個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。可以通過(guò)基因重組切掉轉(zhuǎn)錄激活域，然后重新檢測(cè)其是否自激活，但要注意重組也有可能破壞蛋

25、白之間的互作。3.轉(zhuǎn)化效率太低怎么辦？可以采用以下方法解決：1)檢測(cè)一下DNA的純度，如果可以的話，重新用乙醇純化。2)DNA-BD/誘餌蛋白很可能是有毒的。3)不適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基，重新配制培養(yǎng)基，并做對(duì)照轉(zhuǎn)化。4)檢測(cè)pGBT9對(duì)照載體的轉(zhuǎn)化效率，放置于SD/Trp平板上，轉(zhuǎn)化效率應(yīng)該在1 x105 colonies/mg DNA以上。4.雜交效率不高，該如何處理？在雜交中，預(yù)轉(zhuǎn)化的誘餌細(xì)胞的數(shù)量可能不夠。當(dāng)對(duì)誘餌菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)過(guò)夜時(shí)，應(yīng)挑選大的、新鮮的克隆進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)離心和重懸后，再使用血球計(jì)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。密度應(yīng)該在1 x109/ml。一個(gè)甚至兩個(gè)融合蛋白對(duì)酵母細(xì)胞有毒。你可以通過(guò)重組方

26、法來(lái)減輕毒性，同時(shí)又能保證蛋白的相互作用。或者使用表達(dá)水平較低的載體。也可以在瓊脂平板或?yàn)V膜上進(jìn)行雜交。但同時(shí)必須作雜交對(duì)照實(shí)驗(yàn)。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)疑難解答時(shí)間：2011-01-10 11:48:02 來(lái)源： 作者： 點(diǎn)擊： 29次 問(wèn)：如果誘餌蛋白對(duì)酵母細(xì)胞是有毒的，該怎么辦？答：在有些情況下，在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)不好的菌株可以在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)得很好。重懸克隆于1ml的SD/Trp，接著將重懸液平鋪于5 個(gè)100-mm的SD/Trp平板。在30下溫浴，直至平板上的克隆互相粘在一起。用5ml 0.5X YPDA刮下每塊板上的克隆，并收集到一管中。接著就使用這個(gè)細(xì)胞重懸液進(jìn)行正常的雜交反應(yīng)。問(wèn)：

27、我的誘餌蛋白能直接激活報(bào)告基因的表達(dá)，該如何處理？答：該蛋白很可能有轉(zhuǎn)錄激活域，是個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。這可以通過(guò)基因重組切掉轉(zhuǎn)錄激活域，然后重新檢測(cè)其是否自激活。但重組也有可能破壞蛋白之間的互作。問(wèn)：轉(zhuǎn)化效率太低，怎么辦？答：1、檢測(cè)一下DNA的純度，如果可以的話，重新用乙醇純化。    2、DNA-BD/誘餌蛋白很可能是有毒的。    3、不適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基，重新配制培養(yǎng)基，并做對(duì)照轉(zhuǎn)化。    4、檢測(cè)pGBT9對(duì)照載體的轉(zhuǎn)化效率，放置于SD/Trp平板上，轉(zhuǎn)化效率應(yīng)該在1 x 105 colonies/mg D

28、NA以上。問(wèn)：雜交效率不高，該如何處理？答：在雜交中，預(yù)轉(zhuǎn)化的誘餌細(xì)胞的數(shù)量可能不夠。當(dāng)你對(duì)誘餌菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)過(guò)夜時(shí)，應(yīng)挑選大的，新鮮的克隆進(jìn)行培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)離心和重懸后，使用血球計(jì)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。密度應(yīng)該在1 x 109/ml。  一個(gè)甚至兩個(gè)融合蛋白對(duì)酵母細(xì)胞有毒。你可以通過(guò)重組方法來(lái)減輕毒性，同時(shí)又能保證蛋白的相互作用。或者使用表達(dá)水平較低的載體。也可以在瓊脂平板或?yàn)V膜上進(jìn)行雜交。但同時(shí)必須作雜交對(duì)照實(shí)驗(yàn)。酵母選擇營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基-酵母SD-SC/Dropout-酵母營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記酵母表達(dá)質(zhì)粒啟動(dòng)子與標(biāo)記基因默認(rèn)分類(lèi) 2010-08-26 08:34:26 閱讀44 評(píng)論5 &

29、#160; 字號(hào)：大中小 訂閱 一、全合成選擇缺陷型培養(yǎng)基Yeast selective media(一缺或單缺,二缺培養(yǎng)基/三缺,四缺培養(yǎng)基/五缺培養(yǎng)基) 酵母缺陷培養(yǎng)基種類(lèi)：(1).一缺:  -Trp,-Leu,-His,-Ura,-Met,-Ade(2).二缺:  -Trp-Leu, -Trp-His,-Trp-Ade,-Leu-Ade,-His-Ade,-Leu-His,-Trp-Ura,-Leu-Ura,            

30、0;     -His-Ura(3).三缺:  -Trp-Leu-His ,-Trp-Leu-Ade等等 (4).四缺:  -Trp-Leu-His-Ade(5).五缺:  -Trp-Leu-His-Ade-Met, -Trp-Leu-His-Ade-Ura對(duì)于上述酵母篩選標(biāo)記的解釋可參見(jiàn)博文【神奇的酵母遺傳學(xué)與高等生物基因功能研究講座三】包裝：40g/瓶?jī)r(jià)格：500元/瓶（外地3瓶以上免運(yùn)費(fèi)）；北京市內(nèi)：450元/瓶泛基諾溫馨提示: 上述培養(yǎng)基含有各種所需成分(葡萄糖除外, 因?yàn)橛行┭芯空哂闷渌穷?lèi)如半乳糖做誘導(dǎo)表達(dá)),

31、為各種氨基酸和酵母含氮堿/氮源的混合物干粉，按照8g/L稱(chēng)取, 加水后即可配制成相應(yīng)的培養(yǎng)液, 無(wú)需再添加任何其他成分。高壓滅菌后加無(wú)菌葡萄糖至終濃度為2(或棉子糖)或?qū)嶒?yàn)所需的特定誘導(dǎo)物(如半乳糖用于GAL1啟動(dòng)子的誘導(dǎo)表達(dá))即可,適用于酵母蛋白質(zhì)的表達(dá)，酵母單雜交(yeast one-Hybrid)和酵母雙雜交(yeast two-Hybrid)系統(tǒng)等的選擇缺陷型培養(yǎng), 篩選含特定標(biāo)志基因的酵母表型. 有關(guān)酵母表型與選擇標(biāo)記基因的理論問(wèn)題可發(fā)電子郵件到 進(jìn)行詳細(xì)咨詢(xún)。 最小包裝：40克/瓶零售價(jià)：500元/40g/瓶（促銷(xiāo)期優(yōu)惠價(jià)）批發(fā)價(jià)：協(xié)商二、無(wú)酵母氮源的氨基酸混合物(Dropout)

32、 一缺、二缺、三缺、四缺、五缺等三、普通培養(yǎng)基1).YPD          450元/瓶2).YPDA        450元/瓶3).YPD-plus   450元/瓶四、酵母基因克隆與表達(dá)載體(一).功能型骨架載體-用于不同用途的功能研究和載體改造1、酵母基因組整合質(zhì)粒(Yeast integrating plasmid, YIP)(1).Trp篩選標(biāo)志 (2).Ura篩選標(biāo)志 (3).Leu篩選標(biāo)志 (4).

33、His篩選標(biāo)志 (5).G418篩選標(biāo)志此類(lèi)質(zhì)粒經(jīng)酶切線性化后可整合到酵母細(xì)胞基因組中用途: a.基因取代或基因刪除   b.穩(wěn)定型表達(dá)元件的整合(integration)和敲入(knock in)2、酵母中心粒-自主復(fù)制質(zhì)粒(Yeast CEN-ARS plasmid, YCP)(1).Trp篩選標(biāo)志 (2).Ura篩選標(biāo)志 (3).Leu篩選標(biāo)志 (4).His篩選標(biāo)志 (5).G418篩選標(biāo)志此類(lèi)質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)可自主復(fù)制,且由于含有中心粒復(fù)制序列,因此每個(gè)細(xì)胞近乎只有一個(gè)拷貝。用途: 由于每個(gè)細(xì)胞平均只有一個(gè)拷貝,避免了目的基因的盈余表達(dá),因而特別適用于基因功能的研究3

34、、酵母附加體質(zhì)粒(Yeast episomal plasmid, YEP)(1).Trp篩選標(biāo)志 (2).Ura篩選標(biāo)志 (3).Leu篩選標(biāo)志 (4).His篩選標(biāo)志 (5).G418篩選標(biāo)志此類(lèi)質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)以附加體的形式高度復(fù)制, 每個(gè)細(xì)胞高達(dá)200-400個(gè)拷貝貝用途: 用于外源基因的表達(dá)(二). 表達(dá)載體1、GAL1啟動(dòng)子表達(dá)載體-半乳糖誘導(dǎo)的表達(dá)載體(1).Trp篩選標(biāo)志 (2).Ura篩選標(biāo)志 (3).Leu篩選標(biāo)志 (4).His篩選標(biāo)2、Cup1啟動(dòng)子表達(dá)載體-硫酸銅誘導(dǎo)的表達(dá)載體(1).Trp篩選標(biāo)志 (2).Ura篩選標(biāo)志 (3).Leu篩選標(biāo)志 (4).His篩選標(biāo)志 (

35、5).G418篩選標(biāo)志3、ADH啟動(dòng)子表達(dá)載體-ADC1組成型表達(dá)載體(1).Trp篩選標(biāo)志 (2).Ura篩選標(biāo)志 (3).Leu篩選標(biāo)志 (4).His篩選標(biāo)志 (5).G418篩選標(biāo)志五、酵母轉(zhuǎn)化試劑及試劑盒1)      10X無(wú)菌PEG4000-液體2)     10X LiAc-無(wú)菌液體3)      運(yùn)載體DNA (Carrier DNA,10mg/ml )六、酵母質(zhì)粒回收試劑盒(KGN010)簡(jiǎn)介：從酵母細(xì)胞中回收質(zhì)粒是酵母遺傳學(xué)

36、重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù), 在酵母單、雙、三雜交實(shí)驗(yàn)中更是不可或缺。很多實(shí)驗(yàn)者按照出版的技術(shù)資料如分子克隆和現(xiàn)代分子生物學(xué)操作手冊(cè)等往往都回收不到質(zhì)粒, 該試劑盒提供的操作程序是酵母細(xì)胞質(zhì)粒回收的最佳選擇, 具有高效性和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。七、常用酵母細(xì)胞表型資料(僅供參考)YPH499        MATa: ade2-101ochre his3-200 leu-1 lys2-801amber trp11-63 ura3-52-YHP500        MAT:

37、ade2-101ochre his3-200 leu-1 lys2-801amber trp11-63 ura3-52-W303-1A       MATa: leu2-3, -112; his3-11, -15; trp1-1; ura3-1; ade2-1; can1-100W303-1B       MAT: ade2-1 leu2-3,112 his311 his3-15 trp1-1 ura3-1)BY4741    

38、0;   MATa:his3?1 leu2?0 met15?0 ura3?0BY4742        MAT:his3?1 leu2?0 met15?0 ura3?0JRY2726       MATa:his4JRY2728       MAT:his4FGN2749       蛋白酶缺陷株-用于易降解或不穩(wěn)定蛋白的高效表

39、達(dá)與純化需要索取更多的酵母菌株及其表型資料請(qǐng)發(fā)電子郵件咨詢(xún)或直接電話聯(lián)系北京泛基諾科技有限公司酵母遺傳學(xué)與分子生物學(xué)研究的專(zhuān)業(yè)公司 聯(lián)系電話#160;   電子郵件： fungenome   技術(shù)支持：神奇的酵母遺傳學(xué)技術(shù)與高等生物基因功能研究系列講座(二)酵母雙雜交系統(tǒng)的前世今生酵母遺傳學(xué)方法與 2010-08-02 15:39:40 閱讀181 評(píng)論11   字號(hào)：大中小 訂閱       酵母雙雜交系統(tǒng)的原理、應(yīng)用與進(jìn)展&

40、#160;     作者: 泛基諾技術(shù)總監(jiān)   胡恩泛【編輯部按：無(wú)論是新手上路還是導(dǎo)師專(zhuān)家，花幾分鐘的時(shí)間參閱下面由泛基諾技術(shù)總監(jiān)撰寫(xiě)的內(nèi)容，相信您還是能得到一些非常有用的信息，并在實(shí)際科研工作中有一定的借鑒作用】      酵母遺傳學(xué)對(duì)二十世紀(jì)九十年代以來(lái)的生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)研究產(chǎn)生了極大地推動(dòng)作用，其威力之巨大、影響之深遠(yuǎn)、應(yīng)用之廣泛使得其他任何一種模式生物都不能望其項(xiàng)背。這一節(jié)主要講述酵母雙雜交系統(tǒng)原理的最新詮釋和實(shí)驗(yàn)操作精要。酵母實(shí)驗(yàn)操作在國(guó)內(nèi)研究型實(shí)驗(yàn)室廣為傳播的主要原因還是酵

41、母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用和發(fā)展，關(guān)于酵母雙雜交系統(tǒng)的原理，這方面的文章俯拾皆是，但無(wú)論是新手上路還是導(dǎo)師專(zhuān)家，花幾分鐘的時(shí)間參閱下面由泛基諾技術(shù)總監(jiān)撰寫(xiě)的內(nèi)容，相信您還是能得到一些非常有用的信息，并在實(shí)際科研工作中有一定的借鑒作用。【正文】酵母雙雜交系統(tǒng)首先由Stanley Fields實(shí)驗(yàn)室建立的，其原始出處參見(jiàn)1987年Cell雜志上的論文。該系統(tǒng)的理論基礎(chǔ)是建立在對(duì)于酵母半乳糖代謝調(diào)控的兩個(gè)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Gal80負(fù)調(diào)控因子和Gal4正調(diào)控因子的功能解析上。GAL4基因是酵母糖代謝中的一個(gè)重要基因，其編碼的蛋白質(zhì)Gal4（備注: GAL4表示基因，Gal4表示蛋白）具有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：位于N末端的D

42、NA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-binding domain,簡(jiǎn)稱(chēng)BD)和位于C末端的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(transcription-activating domain,簡(jiǎn)稱(chēng)AD)。DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（BD）能識(shí)別GAL1基因啟動(dòng)子的上游激活序列（Upstream Activating sequence,UAS），轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（AD）可同轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的其他成分作用，啟動(dòng)GAL1基因的轉(zhuǎn)錄。GAL1基因上游含4個(gè)特殊序列UASg (upstream activator sequence-galactose)。每個(gè)UASg由17bp序列構(gòu)成，當(dāng)加入半乳糖作為誘導(dǎo)物后，Gal4可全方位的與GAL1的UASg結(jié)合，從而使GAL