1、.1Next Generation Sequencing(NGS) 技術簡介.2Sanger Sanger 測序測序Sanger 測序法仍然為基因測序行業內的金標準，但鳥槍測序法在技術上存在瓶頸。（價格昂貴、步驟繁瑣、效率低）.3NGS = Next Generation SequencingNGS = Next Generation SequencingNGS也稱為高通量測序High-throughput Sequencing (HTS)第一代測序：Sanger Sequencing （Sanger測序）第二代測序： NGS = Massively Parallel Sequencing （

2、大規模平行測序）第三代測序： NGS = HTS, SingleMolecule Sequencing （高通量、單分子測序）.4目前目前NGSNGS的主要三種測序儀器的主要三種測序儀器三種測序儀在高通量水平、測序準確度、存儲格式和技術方法上均有差異。.5羅氏/454基因組測序儀FLX系統焦磷酸測序法光學230-400在第二代中最高讀長；比第一代的測序通量大樣品制備較難；難于處理重復和同種堿基多聚區域；試劑沖洗帶來錯誤累積；儀器昂貴illuminaHiSeq2000/miSeq可逆鏈終止物和合成測序法熒光/光學2x150很高測序通量儀器昂貴；用于數據刪節和分析的費用很高ABI/SOLiD550

3、0 xlSOLiD系統連接測序法熒光/光學25-35很高測序通量；在廣為接受的幾種第二代平臺中，所要拼接出人類基因組的試劑成本最低測序運行時間長；讀長短，造成成本高，數據分析困難和基因組拼接困難；儀器昂貴公司公司平臺名平臺名稱稱測序方法測序方法檢測方檢測方法法大約讀大約讀長長(堿基堿基數數)優點優點相對局限性相對局限性三大測序平臺的技術特點和差異三大測序平臺的技術特點和差異.6Roche 454Roche 454測序原理測序原理Roche 454焦磷酸測序原理.7Roche 454Roche 454測序步驟測序步驟樣品處理主要是針對大片段的DNA分子，如基因組DNA、Fosmid或BAC質粒等

4、，利用超聲或氮氣打斷將這些DNA分子片段化，然后采用瓊脂糖凝膠電泳回收或磁珠純化，選擇500-800bp的DNA片段。對于非編碼RNA或PCR產物，則不需要這一步驟。一、樣品處理一、樣品處理.8Roche 454Roche 454測序步驟測序步驟二、文庫制備二、文庫制備文庫制備包括接頭連接和磁珠純化兩步，454的文庫接頭分A、B兩種，各44bp，由20bp的PCR引物、20bp的測序引物及4bp（TCAG）的“key”堿基構成，其中B接頭的5端帶有生物素（Biotin）標記，用于磁珠純化步驟。.9Roche 454Roche 454測序步驟測序步驟三、連接微珠三、連接微珠將富集到的文庫與測序磁

5、珠、各反應物混合，加入特定的礦物油和表面活性劑，再利用振蕩器劇烈振蕩，使反應體系形成油包水（water-in-oil）的穩定乳濁液。在理想條件下，每一個液滴，或稱微反應器（microreactor）中將只包含一個磁珠和一條單鏈DNA，通過控制條件，1mL乳液中可以形成至少10的6次方個理想的微反應器。.10Roche 454Roche 454測序步驟測序步驟四、四、emRCRemRCRPCR擴增后，每一個磁珠上將形成密集的DNA簇，這些DNA序列完全相同，即可用于后續的步驟。.11乳液乳液PCRPCR（emRCRemRCR）.12Roche 454Roche 454測序步驟測序步驟五、反應板準

6、備、上機測序五、反應板準備、上機測序454測序的反應板稱為PTP（Pico Titer Plate），含有350萬個由光纖組成的小孔，每個孔的直徑為29m，而測序磁珠的直徑為20m，因此每個孔中僅能容納一個磁珠。.13.14Roche 454Roche 454測序步驟測序步驟六、測序和分析六、測序和分析將磁珠與測序試劑加入PTP中，使之可用于上機測序。.15在454測序儀中，A、T、G、C四種堿基是分別存儲在單獨的試劑瓶中的，每步反應四種堿基依次加入反應池，當堿基配對結合，就會釋放出一個焦磷酸（PPi），而這個焦磷酸在酶的作用下，將熒光素氧化成氧化熒光素，并發出光信號，從而讀取出這一位置的堿基

7、信息。.16IlluminaIllumina測序原理測序原理Illumina合成測序原理.17IlluminaIllumina測序流程測序流程.18橋式PCR.19合成法測序.20數據讀取.21ABI SOLiDABI SOLiD測序原理測序原理ABI SOLiD連接測序原理.22ABI SOLiDABI SOLiD測序流程測序流程制備DNA文庫乳液PCR/微珠富集連接酶測序:SOLiD連接反應的底物是8堿基單鏈熒光探針混合物。連接反應中，這些探針按照堿基互補規則與單鏈DNA模板鏈配對。這樣經過五輪測序反應后便可以得到所有的堿基序列SOLID的雙堿基編碼矩陣.23ABI SOLiD連接測序原理

8、探針的5末端標記了1種顏色的熒光染料。探針3端15位為隨機堿基，其中第1、2位構成的堿基對表征探針染料類型，而35位的“n”為隨機堿基，68位的“z” 是可以和任何堿基配對的特殊堿基。SOLiD測序反應的每一輪測序反應會連接第15位的堿基，同時切除第68位的堿基，同時記錄下第12位堿基決定的熒光顏色。.24ABI SOLiD連接測序原理.25ABI SOLiD連接測序原理兩個堿基共同決定一個顏色，可以極大的提高測序的準確率。.26ABI SOLiD連接測序原理五輪測序反應反應后，按照第0、1位，第1、2位. 的順序把對應于模板序列的顏色信息連起來，就得到由“0，1，2，3”組成的SOLiD原始

9、顏色序列。.27454平臺的突出優勢是讀長。目前454系統的序列讀長已超過400 bp。雖然454平臺的測序成本比其他平臺要高很多，不過對于那些需要長讀長的應用，如從頭拼接和環境微生物組學，它仍是最理想的選擇。 各個測序平臺的特點總結Roche 454Illumina1. 可擴展的超高通量可擴展的超高通量Genome Analyzer系統目前每次運行后可獲得超過20 GB的高品質過濾數據。經優化后通量還有望上升到95 GB，相當于人類基因組的30倍覆蓋度。2. 需要樣品量少需要樣品量少Genome Analyzer系統需要的樣品量低至100ng，能應用在很多樣品有限的實驗（比如免疫沉淀、顯微切

10、割等）中。3. 簡單、快速、自動化簡單、快速、自動化Genome Analyzer系統提供了最簡單和簡潔的工作流程。制備樣品文庫可以在幾小時內完成，一個星期內就能得到高精確度的數據。自動化的流程不減少了手工操作誤差和污染可能性，也不需要機器人操作或潔凈室。.281. 無以倫比的通量無以倫比的通量 目前SOLiD 3系統單次運行能產生50 GB的人基因組序列數據，相當于基因組的17倍覆蓋度，這顯然是其他任一臺新一代測序系統都無法達到的2. 準確性。準確性。 新的超精確檢測模塊（ECC模塊）將提供高達99.99%的精確性；多達98%的可定位堿基的質量值高于45；更多標簽以提高靈敏度和動態范圍；高準

11、確性的原始讀序，支持無參考序列的數據分析。 各個測序平臺的特點總結ABI SOLiD.29公司公司平臺名平臺名稱稱測序方法測序方法檢測方檢測方法法大約讀大約讀長長(堿基堿基數數)優點優點相對局限性相對局限性太平洋生物科學公司（PacBio）PacBio RS實時單分子DNA測序熒光/光學1000高平均讀長，比第一代的測序時間降低；不需要擴增；最長單個讀長接近3000堿基并不能高效地將DNA聚合酶加到測序陣列中；準確性一次性達標的機會低（81-83%）；DNA聚合酶在陣列中降解；總體上每個堿基測序成本高（儀器昂貴）；Complete GenomicsGeXP遺傳分析系統復合探針錨雜交和連接技術熒

12、光/光學10在第三代中通量最高；在所有測序技術中，用于拼接一個人基因組的試劑成本最低；每個測序步驟獨立，使錯誤的累積變得最低低讀長； 模板制備妨礙長重復序列區域測序；樣品制備費事；尚無商業化供應的儀器Ion Torrent/Life Technology個人基因組測序儀（PGM） 合成測序法以離子敏感場效應晶體管檢測pH值變化100-200對核酸堿基的摻入可直接測定；在自然條件下進行DNA合成（不需要使用修飾過的堿基）一步步的洗脫過程可導致錯誤累積；閱讀高重復和同種多聚序列時有潛在困難；第三代測序平臺的比較差異.30太平洋生物科學公司（PacBios）實時單分子測序方案示意圖。A. 單個零點啟動模式波導納米結構的側面圖， 每個納米結構含一個DNA聚合酶分子，固定于底部的玻璃面上。波導納米結構和共焦成像系統確保只對底部進行熒光檢測。 B. 顯示了熒光標記的核苷酸底物摻入測序模板的過程。相應的瞬時熒光探測分為5個步驟。太平洋生物科學公司.31Life Technology公司IonTorrent半導體測序芯片技術圖示。A. 該芯片結構設計的逐層顯示圖。上層為單個的DNA聚合反應的微池，底部兩層構成場效應晶體管離子傳感器。每個微池有其相對應的場效應晶體管探頭，以鑒別每一個pH值的變化。B. 側面圖：微池中，DNA聚合酶將兩個重復的TTP核苷酸摻入測序片段中。