1、1人胃泌素釋放肽前體（ProGRP）酶聯免疫分析試劑盒使用說明書本試劑盒僅供研究使用產品編號：CSB-E09127h檢測范圍：1.56 ng/ml - 100 ng/ml最低檢測限：0.39 ng/ml特異性：本試劑盒可同時檢測天然或重組的人ProGRP,且與其他相關蛋白無交叉反應。有效期：6 個月預期應用：ELISA 法定量測定人血清、血漿、細胞培養上清或其它相關生 物液體中 ProGRP 含量。說明1.試劑盒保存：-20C（較長時間不用時）;2-8C（頻繁使用時）。2.濃洗滌液低溫保存會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。3.中、英文說明書可能會有不一致之處，請以英文說明書為準。4.剛開啟

2、的酶聯板孔中可能會含有少許水樣物質， 此為正常現象， 不會對實 驗結果造成任何影響。實驗原理用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗 ProGRP 抗體的微 孔中依次加入標本或標準品、生物素化的抗ProGRP 抗體、HRP 標記的親和素，經過徹底洗滌后用底物 TMB 顯色。 TMB 在過氧化物酶的催化下轉化成 藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的 ProGRP 呈正相關。用酶標儀在 450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。2試劑盒組成及試劑配制1. 酶聯板 (Assay plate )：一塊(96 孔)。2.標準品(Standard):2 瓶(凍干品

3、)。3.樣品稀釋液( (Sample Diluent):1 20ml/瓶。4.生物素標記抗體稀釋液(Biotin-antibody Diluent):1x10ml/瓶。5.辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 (HRP-avidin Diluent)1 xiOml/瓶。6.生物素標記抗體(Biotin-antibody):1X20瓶(1:100)。7.辣根過氧化物酶標記親和素 (HRP-avidin):1X120/瓶 (1:100)。8.底物溶液(TMB Substrate):1X0ml/瓶。9.濃洗滌液(Wash Buffer):1X20ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋 25 倍。10. 終止液(

4、Stop Solution :1X0ml/瓶(2N H2SO4)。需要而未提供的試劑和器材1.標準規格酶標儀2.高速離心機3.電熱恒溫培養箱4.干凈的試管和 Eppendof 管5.系列可調節移液器及吸頭，一次檢測樣品較多時，最好用多通道移液器6.蒸餾水，容量瓶等標本的采集及保存1.血清：全血標本請于室溫放置 2 小時或 4C過夜后于 1000g 離心 20 分鐘， 取上清即可檢測，或將標本放于-20T或-80C保存，但應避免反復凍融。2.血漿：可用 EDTA 或肝素作為抗凝劑，標本采集后 30 分鐘內于 2 - 8 C1000 g離心 15 分鐘，或將標本放于-20T或-80T保存，但應避免

5、反復凍融。3.細胞培養物上清或其它生物標本：1000g 離心 20 分鐘，取上清即可檢測， 或將標本放于-20C或-80C保存，但應避免反復凍融。3注 標本溶血會影響最后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。標本的稀釋原則：首先通過文獻檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當的稀釋倍數。 只有稀釋至標準曲線的范圍內，檢測的結果才是準確的。稀釋的過程中，應 做好詳細的記錄。最后計算濃度時，稀釋了 “N 倍，標本的濃度應再乘以“N。標準品的稀釋原則：2 瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至 1ml，蓋好 后靜置 10分鐘以上，然后反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為 100 ng/ml，做 系列倍比稀

6、釋后，分別稀釋 100 ng/ml， 50 ng/ml， 25 ng/ml， 12.5 ng/ml， 6.25 ng/ml，3.12 ng/ml，1.56 ng/ml，樣品稀釋液直接作為標準濃度 0 ng/ml，臨用 前 15 分鐘內配制。如配制 50 ng/ml 標準品：取 0.5ml （不要少于 0.5ml） 100 ng/ml 的上述標準品 加入含 0.5ml 樣品稀釋液的 Eppendof 管中，混勻即可，其余濃度以此類推。生物素標記抗體的稀釋原則：臨用前以生物素標記抗體稀釋液稀釋，稀釋前根據預先計算好的每次實驗所 需的總量配制（每孔 100 卩），實際配制時應多配制 0.1-0.2m

7、l。女口 10 卩生物素 標記抗體加 990 卩,生物素標記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前 一小時內配制。辣根過氧化物酶標記親和素的稀釋原則：臨用前以辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液稀釋，稀釋前根據預先計算好的 每次實驗所需的總量配制（每孔 100 卩），實際配制時應多配制 0.1-0.2ml。女口 10 卩 1辣根過氧化物酶標記親和素加990 卩 1 辣根過氧化物酶標記親和素稀釋液 的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制。操作步驟實驗開始前，請提前配置好所有試劑，試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻 時盡量避免起泡。每次檢測都應該做標準曲線。如樣品濃度過高時，用樣品 稀釋液進行稀釋，

8、以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。41.加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液 100 卩, 余孔分別加標準品或待測樣品 100 卩,注意不要有氣泡，加樣將樣品加于 酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜， 37C反應 120 分鐘。為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。2.棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標記抗體工作液 100 卩1（取 1 卩1生物素標記抗體加 99 卩1生物素標記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內配制），37C,60 分鐘。3.溫育 60 分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板 3 次，每次浸泡 1-2

9、分鐘， 200卩/每孔，甩干。4.每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液（同生物素標記抗體工作液）100 卩，37C，60 分鐘。5.溫育 60 分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板 5 次，每次浸泡 1-2 分鐘， 200卩/每孔，甩干。6.依序每孔加底物溶液 90 卩，37 C 避光顯色（30 分鐘內，此時肉眼可見標 準品的前 3-4 孔有明顯的梯度藍色，后 3-4 孔顯色不明顯，即可終止） 。7.依序每孔加終止溶液 50 卩，終止反應（此時藍色立轉黃色）。終止液的加 入順序應盡量與底物液的加入順序相同。 為了保證實驗結果的準確性， 底 物反應時間到后應盡快加入終止液。8.用酶聯儀在 450nm

10、 波長依序測量各孔的光密度（OD 值）。在加終止液后 15 分鐘以內進行檢測。實驗備注1.用戶在初次使用試劑盒時， 應將各種試劑管離心數分鐘， 以便試劑集中到 管底。2.每次實驗留一孔作為空白調零孔，該孔不加任何試劑，只是最后加底物溶 液及2N H2SO4。測量時先用此孔調 OD 值至零。3.為防止樣品蒸發， 試驗時將反應板放于鋪有濕布的密閉盒內， 酶標板加上 蓋或覆膜。4.未使用完的酶標板或者試劑，請于 2-8C保存。標準品、生物素標記抗體 工作液、辣根過氧化物酶標記親和素工作液請依據所需的量配置使用。 請 勿重復使用已稀釋過的標準品、 生物素標記抗體工作液、 或辣根過氧化物 酶標記親和素工

11、作液。5.建議檢測樣品時均設雙孔測定，以保證檢測結果的準確性。5洗板方法手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體；在實驗臺上 鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少 0.3ml 注入孔內，浸泡 1-2 分鐘。根據需要，重復此過程數次。 自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中。計算以標準物的濃度為橫坐標（對數坐標） ，OD 值為縱坐標（普通坐標） ，在半對 數坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的 OD 值由標準曲線查出相應的濃度； 再乘以稀釋倍數；或用標準物的濃度與 OD 值計算出標準曲線的直線回歸方 程式，將樣品的OD 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即 為樣品的實際濃度。注意事項1. 本操作說明適用于 48T 試劑盒，但 48T 試劑盒所有試劑減半。2. 當混合蛋白溶液時應盡量輕緩，避免起泡。3.洗滌過程非常重要，不