1、基因的克隆與表達基因基因(gene)這個名詞是1909年由遺傳學家約翰森(W.L.Johannsen,18571927)提出來的.他用基因這一名詞來表示遺傳的獨立單位,相當于孟德爾在豌豆試驗中提出的遺傳因子.顧名思義,基因不僅是一個遺傳物質在上下代之間傳遞的基本單位,也是一個功能上的獨立單位.基因是DNA分子上具有遺傳效應的特定核苷酸序列的總稱,是具有遺傳效應的DNA(脫氧核糖核酸)分子片段.基因不僅可以通過復制把遺傳信息傳遞給下一代,還可以使遺傳信息得到表達,反映在蛋白質的分子結構上,從而使后代表現出與親代相似的性狀.1.結構基因(structural gene)是指某些能決定某種多肽鏈(蛋

2、白質)或酶分子結構的基因.結構基因的突變可導致特定蛋白質(或酶)一級結構的改變或影響蛋白質(或酶)量的改變.2. 調控基因(regulator and control gene)是指某些可調節(jié)控制結構基因表達的基因.調控基因的突變可以影響一個或多個結構基因的功能,或導致一個或多個蛋白質(或酶)的改變.簡言之,基因就是編碼一段功能蛋白質的DNA序列及其調控序列.克隆是英文(clon)clone的音譯 :指通過無性繁殖過程所產生的與親代完全相同的子代群體.無性繁殖是指不經過雌雄兩性生殖細胞的結合,只由一個生物體產生后代的生殖方式,常見的有孢子生殖,出芽生殖和分裂生殖.由植物的根,莖,葉等經過壓條或

3、嫁接等方式產生新個體也叫無性繁殖. 克隆就是一種以DNA重組技術為基礎的人工誘導的無性繁殖方式.也稱為分子克隆(molecular cloning)或基因克隆.DNA重組技術是在分子水平對基因進行體外操作.克隆分,切,接,轉,篩分,切,接,轉,篩分:目的基因的獲得1,PCR(RT-PCR)2,酶切PCR技術PCR:聚合酶鏈式反應 ( Polymerase Chain Reaction),是指利用耐熱DNA聚合酶的反復作用,通過變性-復性-延伸的循環(huán)操作,在體外迅速將DNA模板擴增數百萬倍的一種操作技術.一,PCR基本原理:變性-復性-延伸1.變性:通常采用加熱變性,即將模板DNA或延伸后的雙鏈

4、DNA加熱到940C,使雙螺旋DNA解開成為單鏈.2.復性:通過降低反應溫度至500C- 650C ,使兩種引物能與兩條解開的DNA互補鏈的3端粘合,以提供DNA聚合酶催化聚合所需的3-OH.3.延伸:將反應溫度提高到約720C,在耐熱DNA聚合酶的催化下,根據模板DNA提供的堿基順序,合成兩條互補鏈,從而使模板DNA擴增一倍.PCR技術特點1,高度的敏感性.2,高度的特異性.3,操作簡便快速.4,樣品適用廣泛.5,有一定程度的單核苷酸錯誤摻入.引物要擴增模板DNA,首先要設計兩條寡核苷酸引物,所謂引物,實際上就是兩段與待擴增靶DNA序列互補的寡核苷酸片段,兩引物間距離決定擴增片段的長度;兩引

5、物的5'端決定擴增產物的兩個5'末端位置.由此可見,引物是決定PCR擴增片段長度,位置和結果的關鍵,引物設計也就更為重要.引物的設計引物設計的必要條件是與引物互補的靶DNA序列必須是已知的,兩引物之間的序列未必清楚,這兩段已知序列一般為1821個堿基,可以用DNA合成儀合成與其對應互補的二條引物. (1)引物長度:18-21bp (2)(G+C)%含量:引物的組成應均勻,盡量避免含有相同的堿基多聚體.兩個引物中(G+C)%含量一般以40%60%為佳.(3)引物的結構:無明顯的次級結構(4)引物之間:不應發(fā)生互補(5)引物3'端配對精確和嚴格1,dNTP: PCR常用的濃

6、度為50200mol/L,不能低于1015mol/L.四種dNTP的濃度應相同.2, 緩沖液:10 mM Tris.HCl pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2.3,模板DNA:純度與含量.4,反應參數.PCR的影響因素1. 變性-考慮酶的失活問題.一般為反應開始時用95oC×2- 5 min,在后續(xù)循環(huán)中設為94oC× 30 s - 1 min;2. 退火-退火溫度取決于引物的堿基組成,長度及引物與模板的匹配程度,一般在Tm 20-25oC左右;時間一般為30 s - 2 min;3. 延伸溫度一般為72oC;時間取決于待擴增片段的長度.在通常情

7、況下,Taq酶的延伸速率約為2 kb/min,而pfu為1 kb/min .4. 在最后一個循環(huán)結束后,需再在72oC下延伸10 min,以產物完整.單,雙鏈DNA或RNA都可以作為PCR的樣品.若起始材料是RNA,須先通過逆轉錄得到第一條cDNA.為了保證反應的特異性,還應用ng級的克隆DNA,g水平的單拷貝染色體DNA或102-105拷貝的待擴增片段作為起始材料.模板可以是粗品,但不能混有任何蛋白酶,核酸酶,Taq DNA聚合酶抑制劑以及結合在DNA上的蛋白.模板的純度,含量測定260nm 1 OD 雙鏈DNA 50g /ml單鏈DNA 40g /mlOD 260nm/ OD280nm 1

8、.8ddH2O 37.60 L10 × Buffer 5 LdNTP mixture(2.5mM) 4 L引物上(20pmol/ L) 1 L引物下(20pmol/ L) 1 L MgCl2(25mM) 4 L模板(102-105 拷貝) 0.5 LDNA Polymerase 0.4 L總體積 50 L95變性處理3min94 30S56 30S72 1min30個循環(huán)72延伸7min PCR產物純化從凝膠上盡量小的切下目的片段,放在一個干凈的EP管中,稱取凝膠的重量,并加入3倍體積的Buffer S1 (即100mg膠加300 L Buffer S1);盛膠EP管于50水浴10m

9、in,每2-3min搖動一次,至膠徹底融化;溶液加入到吸附柱內,13000rpm離心1min,棄去收集管中的液體;加入0.5mL的Buffer W1洗滌DNA,13000rpm離心15sec;棄去收集管中的液體,再加入0.5mL的W1 Buffer,靜置1min,13000rpm離心15sec;棄去收集管中的液體, 13000rpm離心1min;把吸附柱放在一個干凈的EP管內,在柱子膜中央加入30 L Buffer T1, 室溫放置1min,13000rpm 離心1min.凝膠回收后的目的基因,各取5 L電泳檢測,并測定濃度以確定連接體系(此步必做).分,切,接,轉,篩切:限制性核酸內切酶酶切

10、目的基因和載體.限制性核酸內切酶的分類限制性內切酶分為3種類型:I,型. I型RE:識別位點復雜,特異性差.通常在識別位點的4007000bp范圍內切割DNA.現已報道19種.型RE:切割位點靠近識別序列但較難預測.一般在2527bp范圍內切割.現已報道4種.I,型RE酶同時具有限制(剪切)與修飾(甲基化)兩種功能和依賴ATP限制,切割DNA鏈的位置遠離識別序列,因此I型和型酶在DNA重組技術中都不常用.型限制性內切酶實際應用價值最大:型酶只具有限制性活性,無甲基化修飾活性;對DNA的切割要求嚴格的序列作為靶位點,切割精確;此類酶作用時只需要Mg2+參與.無需ATP.型RE酶:被分子生物學家廣

11、泛研究應用,現已發(fā)現600多種.型RE:MW=60KD的單鏈多肽,最適pH:68,NaCl有抑制作用,Mg2+ 激活,巰基有保護作用;熱不穩(wěn)定.作用特點1._有嚴格的識別,切割的DNA序列,并以內切的方式水解雙鏈DNA分子中的磷酸二酯鍵,產生的DNA片段5'端為P,3'端為OH.SpeI 5'- A CTAGT- 3' 3'-TGATC A - 5'SwaI 5'- ATTT AAAT- 3' 3'-TAAA TTTA - 5'2. 識別序列一般為46個堿基對,并以切割序列的正中作為軸心,成180°反向重

12、復(inverted repeat).這種結構也稱為回文結構(palindrom).MspI 5'-C CGG - 3' 3'-GGC C- 5'SbfI 5'-CCTGCA GG - 3' 3'-GG ACGTCC- 5'3._型酶切割靶序列的大小決定了切割DNA鏈后產生的DNA片段的長短,即識別序列短,則DNA鏈中可能存在的切點多,產生DNA片段短;識別序列長,則DNA鏈上存在的切點少,產生DNA片段長.4.切割后產生平端或粘性末端.平頭末端(blunt end): 即在識別序列的對稱軸上進行切割.MscI 5'-TG

13、G CCA - 3' 3'-ACC GGT - 5'HpaI 5'-GTT AAC - 3' 3'-CAA TTG - 5'粘性末端(cohesive end) 即在識別序列的兩個對稱點切開DNA雙鏈,產生末端帶有單鏈尾巴的切口.ClaI 5'-AT CGAT - 3' 3'-TAGC TA - 5'KpnI 5'-GGTACC - 3' 3'-CCATGG - 5'Hpy188I 5'-TCN GA - 3' 3'-AG NCT- 5'Hga

14、I 5'-GACGC(N)5 - 3' 3'-CTGCG(N)10 - 5'三類特殊性質的型限制性內切酶(1)同裂酶(isoschizomer):又稱異源同工酶,即從不同原核生物中分離出來的不同的型酶有相同的識別特點,但切割位點可以相同,也可以不同,例如Sam I(CCCGGG)和Xma I(CCCGGG) (2)同尾酶(isocaudarmer):不同來源的酶其識別和切割序列有一定的相關性,作后能產生相同的粘性末端,例如BamH I(GGATCC).同尾酶產生的DNA片段能通過粘性末端之間的互補作用而彼此連接起來,這在分子克隆中有一定的作用.但應當注意有時用兩

15、種同尾酶產生的末端,重組后形成的序列再也不能被原來的任何一種同尾酶所識別.例如:同尾酶可用于克隆載體的改造和構建中,用以消除某些限制酶切點,但如果要回收重組克隆中的插入片段時,則要慎重選擇適當的同尾酶.Sau3A I BamH IGATC GGATCCCTAG CCTAGGSauI Xho IGTCGAC CTCGAGCAGCTG GAGCTC(3)可變酶:此種酶所識別DNA序列中的一個或幾個堿基是可變的,并且識別序列往往超過6個堿基對,例如Bstp I識別序列為:GGTNACC,其中N為一可變堿基.RE識別序列呈反轉對稱結構,可分為四種類型1._回文結構:(Palindrome)2.間斷回文

16、結構(interrupted Palindrome)如:BgI:5,-GCCNNNN NGGC-3, 3,-CGGN NNNNCCG-5,3. 簡并序列(degenerate sequence)又稱"松弛"特異識別,即識別位點中某些核苷酸可以被其他核苷酸替換.4.非回文結構:HgaI 5'-GACGC(N)5 - 3' 3'-CTGCG(N)10 - 5'_ RE使用時的注意事項1._要求較純的底物DNA.2._Mg2+和Tris-HCI緩沖體系,并且大多數內切酶活性pH范圍在7.27.6之間;3. 同時反應體系中不能含有酚,氯仿,乙醚,SD

17、S以及大于10mmol/L的EDTA;4._ 對離子強度的要求分為3個級別,高鹽 (100mmol/L NaCl),中鹽(50mmol/L NaCl),低鹽(010mmol/L NaCl).5. 在酶反應緩沖體系中均添加有二硫蘇糖醇或-巰基乙醇,以穩(wěn)定酶活性防止氧化.6. 在具體試驗操作時應在低溫或冰浴條件下完成. 目的片段 5 L(1 g)10×buffer(E) 4 L10×BSA 4 LBamHI 1 L(10u) HindIII 1 L(10u)ddH2O 25 L37作用1h,取5 L進行電泳檢測,其余的進行凝膠回收后直接用于連接. 分,切,接,轉,篩接:目的片段

18、與載體的連接DNA連接酶催化雙鏈DNA中相鄰堿基的5'磷酸和3'羥基間磷酸二酯鍵形成的酶,稱為DNA連接酶(DNA ligase).DNA連接酶主要有兩種:T4噬菌體DNA連接酶大腸桿菌DNA連接酶T4噬菌體DNA連接酶T4DNA連接酶最早是從T4噬菌體感染的大腸桿菌中發(fā)現并分離的,分子量68kDa.主要功能及用途_連接雙鏈DNA中一條鏈上的缺口催化 Km=1.5pmol/L鏈間存在的互補粘性末端的DNA片段 Km=0.6umol/L.(連接反應通常在1215下進行) DNA分子間的平頭末端 Km=50umol/L(平端的連接通常在室溫下進行)有報道T4DNA連接酶可以用于RN

19、A連接,但效率低. 5× T4 DNA ligase buffer 4 L外源DNA 0.3pmol載體DNA 0.03pmolT4 DNA Ligase 1 LddH2O up to 20 L 23-26連接1h或16過夜連接產物馬上轉化可多做幾個連接梯度,同時設立對照,如載體的雙酶切自連以檢測是否酶切完全,載體的單酶切產物連接以檢測連接體系和連接酶.外源DNA與載體DNA的摩爾比為3-10,連接效果較好.1:1 3:1 6:1 目的片段:1kb 25ng 75ng 150ng載體質粒:4kb 100ng 100ng 100ng分,切,接,轉,篩轉:連接產物轉入宿主細胞.于1.5m

20、L離心管中加入100 L感受態(tài)細胞,取10 L重組質粒緩慢加入并且邊加邊攪拌,置冰浴30min,42 90Sec,迅速冰浴35min,加入0.5mL LB培養(yǎng)基,振蕩培養(yǎng)1h.每個抗性平板中加入200-300 L轉化菌,搖動淌勻,自然表面干燥后,37培養(yǎng)12-16h.同時將連接對照組也轉化細胞,再設立對照:(1)質粒+感受態(tài)細胞;(2)無菌水+感受態(tài)細胞.培養(yǎng)完畢后,從實驗組中篩選出陽性菌落.從37培養(yǎng)16-20小時的新鮮平板中挑取一個單菌落(直徑2-3mm),轉到一個含有100ml LB或LB培養(yǎng)基的1L燒瓶中.于37劇烈振搖培養(yǎng)約3小時(旋轉搖床,300轉/分).為得到有效轉化,活細胞數不

21、應超過108細胞/ml,可每隔20-30分鐘測量OD600值來監(jiān)測培養(yǎng)物的生長情況. 培養(yǎng)物冷卻至0;4用Sorvall GS3轉頭以4000轉/分離心10分鐘,以回收細胞;倒出培養(yǎng)液,將管倒置1分鐘以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡;以10ml用冰預冷的0.1mol/L CaCl2重懸每份沉淀,放置于冰浴上,于4以4000轉/分離心10分鐘,以回收細胞;倒出培養(yǎng)液,將管倒置1分鐘以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡;每50ml初始培養(yǎng)物用2ml用冰預冷的0.1mol/LCaCl2,重懸每份細胞沉淀;可將細胞分裝成小份,放于-70凍存.熱擊法:42 90Sec電擊法:1200mv-2400mv 1-5ms分

22、,切,接,轉,篩篩:篩選含有正確序列重組質粒的細菌.非轉化子(不含質粒)連接產物轉化入不含外源基因的重組子受體細胞轉化子(含質粒) 不含正確序列基因的重組子含外源基因的重組子含正確序列基因的重組子第1步第2步第3步第1步和第2步為遺傳表型篩選,屬被動篩選過程,包括抗生素平板篩選,互補篩選,插入表達篩選,噬菌斑篩選.第3步為主動篩選鑒定過程,主要方法有菌落原位雜交鑒定,小劑量制備質粒限制性內切酶分析鑒定,PCR鑒定,DNA序列測定等. 根據遺傳表型篩選1.抗生素平板篩選2. 互補篩選3.插入表達篩選4.噬菌斑篩選1.抗生素平板篩選大多數克隆載體均帶有抗生素抗性基因,常見的有抗氨芐青霉素基因(Am

23、pr),抗四環(huán)素基因(Tetr),抗卡那霉素基因(Kanr)等.如果外源DNA片段插入載體的位點在抗藥性基因之外,不導致抗藥性基因的插入失活,仍能編碼抗藥性基因,這種含有重組子的轉化細胞能夠在含有相應藥物的瓊脂平板上生長成菌落.但是除陽性重組子以外, 自身環(huán)化的載體,未酶解完全的載體以及非目的基因插入載體形成的重組子均能轉化細胞而能生長,故本法僅是陽性重組子的初步篩選.互補篩選-半乳糖苷酶 ( -galactosidase)是一種把乳糖分解成葡萄糖和半乳搪的酶,最常用的 -半乳糖酶基因來自大腸桿菌的Lac操縱子,它們使載體中帶有大腸桿菌Lac操縱子的調節(jié)序列和編碼 -半乳糖苷酶N末端146個氨

24、基酶的序列.用異丙基- -D- 硫代半乳糖苷(IPTG)可誘導這個氨基末端片段的合成,合成的片段能與宿主編碼的 -半乳糖苷酶缺陷型進行基因內互補,恢復該酶的活性,這一過程稱 -互補.因此當載體帶有LacZ調節(jié)序列和編碼半乳糖苷酸N末端146個氨基酸的序列,而宿主中該部分序列缺陷,其他部分完整時,雖然宿主編碼的或質粒編碼的片段本身都沒有活性,但它們互相協(xié)助則可在大腸桿菌內形成一個具有酶活性的蛋白質.故在誘導物IPTG存在下,細菌在含色素底物5-溴-4-氯-3-吲哚- -D-半乳糖苷(X-gal)培養(yǎng)基的平板上可形成藍色菌落.當在質粒多克隆位點中插入外源DNA時,可使 -半乳糖苷酶的氨基末端失活,

25、從而不能進行互補,因此帶有重組質粒的細菌產生白色菌落.插入表達篩選有些載體設計時,在篩選標志基因前面連接一段負調控序列,當插入失活該負調控序列時,其下游的篩選標志基因才能表達,如pTR262質粒其Tetr基因上游存在CI基因的負調控序列,CI基因可以抑制Tetr基因的表達,當外源DNA片段插入CI基因的Hind或Bgl I位點時,Tetr基因阻礙解除而表達,陽性重組子為Tetr表型,而質粒本身為Tetr表型,故轉化細菌在Tetr平板中,只有含外源DNA插入片段的陽性重阻子的轉化菌才能生長成菌落.噬菌斑篩選對于以噬菌體載體系統(tǒng),外源DNA插入噬菌體載體后,重組DNA分子大小必須在野生型DNA長度

26、的78%105%范圍內,才能在體外包裝成具有感染活力的噬菌體顆粒,感染細菌后,形成清晰的噬菌斑.沒有外源DNA片段插入的載體不能包裝成噬菌體顆粒,不能感染細胞并形成噬菌斑,從而達到初步篩選的作用. 應用限制性內切酶酶切分析篩選對于初步篩選鑒定具有重組子的菌落,應小量培養(yǎng)后,再分離出重組質粒或重組噬菌體DNA,用相應的內切酶(1種或2種)切割重組子釋放出插入片段,對于可能存在雙向插入的重組子還要內切酶消化鑒定插入方向,然后凝膠電泳檢測插入片段和載體的大小. Marker DNA 空載體單酶切重組質粒單酶切重組質粒雙酶切以重組質粒為模板的PCR(目的片段) 菌落原位雜交技術迄先將轉化菌直接鋪在硝酸

27、纖維素薄膜或瓊脂平板上,再轉移至另一硝酸纖維素薄膜上,用核素標記的特異DNA或RNA探針進行分子雜交,然后挑選陽性克隆菌落.本方法能進行大規(guī)模操作,一次可篩選5×1055×106個菌落或噬菌斑,對于從基因文庫中挑選目的重組子,是一項首選的方法.核酸探針篩選為了進一步確定DNA插入片段的正確性,在內切酶消化重組子凝膠電泳分離后,通過Southern印跡轉移將DNA移至硝酸纖維膜上,再用放射性核素或非放射性標記的相應外源DNA片段作為探針,進行分子雜交,鑒定重組于中的插入片段是否是所需的靶基因片段. PCR篩選PCR技術具有高度的靈敏度和特異性,能在極短的時間內將目的基因擴增至

28、數百萬倍,通過電泳,可直接觀察到產物的存在._一些載體的外源DNA插入位點兩側,存在恒定的序列,通過與插入片段兩側的SP6及T7啟動子互補的引物,對小量抽提的質粒DNA進行PCR分析,不但可迅速擴增插入片段,而且可以直接進行DNA序列分析.對于原核或真核系統(tǒng)表達型重組子,其插入片段的序列正確性是非常關鍵的,故有必要對重組子進行序列測定.也可利用已知的外源DNA的核酸序列,設計特異的引物直接用PCR進行擴增,并檢測產物. 檢測陽性的重組質粒送出測序;序列比對.Sequence 0 1 ATGATTAAATTAAAATTTGGTGTTTTTTTTACAGTTTTACTATCTTCAGCATATGC

29、ACATGG 62Sequence 1 1 ATGATTAAATTAAAATTTGGTGTTTTTTTTACAGTTTTACTATCTTCAGCATATGCACATGG 62_Sequence 0 63 AACACCTCAAAATATTACTGATTTGTGTGCAGAATACCACAACACACAAATACATACGCTAA 124Sequence 1 63 AACACCTCAAAATATTACTGATTTGTGTGCAGAATACCACAACACACAAATACATACGCTAA 124_Sequence 0 125 ATGATAAGATATTTTCGTATACAGAATCTCTAGCTG

30、GAAAAAGAGAGATGGCTATCATTACT 186Sequence 1 125 ATGATAAGATATTTTCGTATACAGAATCTCTAGCTGGAAAAAGAGAGATGGCTATCATTACT 186_Sequence 0 187 TTTAAGAATGGTGCAACTTTTCAAGTAGAAGTACCAGGTAGTCAACATATAGATTCACAAAA 248Sequence 1 187 TTTAAGAATGGTGCAACTTTTCAAGTAGAAGTACCAGGTAGTCAACATATAGATTCACAAAA 248_Sequence 0 249 AAAAGCGATT

31、GAAAGGATGAAGGATACCCTGAGGATTGCATATCTTACTGAAGCTAAAGTCG 310Sequence 1 249 AAAAGCGATTGACAGGATGAAGGATACCCTGAGGATTGCATATCTTACTGAAGCTAAAGTCG 310_Sequence 0 311 AAAAGTTATGTGTATGGAATAATAAAACGCCTCATGCGATTGCCGCAATTAGTATGGCAAAT 372Sequence 1 311 AAAAGTTATGTGTATGGAATAATAAAACGCCTCATGCGATTGCCGCAATTAGTATGGCAAAT 372

32、_Sequence 0 373 TAA 375Sequence 1 373 TAA 375 Sequence 0 1 MIKLKFGVFFTVLLSSAYAHGTPQNITDLCAEYHNTQIHTLNDKIFSYTESLAGKREMAIIT 62Sequence 1 1 MIKLKFGVFFTVLLSSAYAHGTPQNITDLCAEYHNTQIHTLNDKIFSYTESLAGKREMAIIT 62_Sequence 0 63 FKNGATFQVEVPGSQHIDSQKKAIERMKDTLRIAYLTEAKVEKLCVWNNKTPHAIAAISMAN 124Sequence 1 63 FKN

33、GATFQVEVPGSQHIDSQKKAIDRMKDTLRIAYLTEAKVEKLCVWNNKTPHAIAAISMAN 124_克隆基因的表達克隆的基因只有通過表達才能探索和研究基因的功能以及基因表達調控的機理,克隆基因表達出所編碼的蛋白質可供作結構與功能的研究.有些具有特定生物活性的蛋白質在醫(yī)學上,以至在工業(yè)上都是很有應用價值的,可以克隆其基因使之在宿主細胞中大量表達而獲得. 體外表達:無細胞表達系統(tǒng)原核表達系統(tǒng):大腸桿菌表達系統(tǒng)體內表達: 酵母表達系統(tǒng)真核表達系統(tǒng)昆蟲細胞表達系統(tǒng)哺乳動物細胞表達系統(tǒng)動物/植物表達系統(tǒng)(轉基因動物/植物) 大腸桿菌表達系統(tǒng)特點:產量高,生長速度快,操作容易,

34、成本低. 缺點:翻譯后加工修飾體系不完善:無糖基化,酰基化等. 一般表達獲得的蛋白常常以變性狀態(tài)存在,不具有生物學活性. 目前較常用的表達載體是具有可誘導的T7啟動子的表達載體,大部分蛋白均可獲得表達而且表達量較高,表達量可占細菌總蛋白的25%以上.T7-RNA聚合酶的活性高于大腸桿菌RNA聚合酶,它只識別自己的啟動序列,不能啟動大腸桿菌DNA的轉錄,對抑制大腸桿菌RNA聚合酶的抗生素如利福平有抗性,因而可在利福平存在的條件下,使目的基因得到大量擴增.還有受溫度變化誘導的具有噬菌體PL啟動子調控的載體等. 大腸桿菌表達系統(tǒng)常見的商業(yè)化表達系統(tǒng)有:1,pET system and pETBlue

35、 system(Novagen公司),是原核蛋白表達中應用最多的系統(tǒng).具有可溶性蛋白生產,二硫鍵形成,蛋白外運和多肽生產等專用載體和宿主菌.目前共有包括40多種載體,15種不同宿主菌和配套齊全的用于有效檢測和純化目標蛋白的相關產品. 2,pBAD表達系統(tǒng)(Invitrogen公司),可控制蛋白質的生產水平低于其成為不溶性蛋白的域值.通過與硫氧還蛋白的融合來增加溶解度3,QIAexpress Expression System(Qiagen公司 ).外源基因在原核細胞中的表達形式按表達蛋白的部位分:分泌表達;外周質及膜上表達 ;胞內表達.外源基因在原核細胞中的表達形式在原核細胞中表達外源基因時,

36、可產生融合型,非融合型.原則上應能夠使外源基因表達效率高,蛋白質產量高,不易被細菌分解,而且產物易被提取,純化.融合基因的表達外源基因在大腸桿菌中表達的一種簡便方法是使其表達為融合蛋白,也就是說要表達的外源基因連接在一段原核基因的下游,蛋白質的N末端由原核DNA序列或其他DNA序列編碼,C端由外源DNA的完整序列編碼,這樣的蛋白質由1條短的原核多肽或具有其他功能的多肽和外源蛋白質結合在一起,故稱為融合蛋白.融合蛋白的特點轉錄和翻譯起始從正常的大腸桿菌序列開始,故通常可以產生高水平的融合蛋白;融合蛋白往往比天然的外源蛋白更加穩(wěn)定;產生的融合蛋白較大,容易從蛋白質凝膠電泳中區(qū)別出夾,而且融合蛋白帶

37、可以從凝膠上切下,經冷凍于燥,磨成粉末后即可作為抗原;有些融合蛋白帶有信號肽,可以分泌到細胞外.這有助于蛋白質的分離和純化.融合方式6×His Tag融合半乳糖苷酶融合trpE融合蛋白谷胱甘肽S-轉移酶(GST)融合硫氧還蛋白(Trx)融合麥芽糖結合蛋白(MBP)融合堿性磷酸酶(phoA)啟動子和信號序列融合表達的蛋白,在分離純化過程中往往需要去除表達時額外引入的融合片段.因此需要用不同方法將其裂解,通常有:1,化學裂解法:特異識別特定的氨基酸殘基或一組氨基酸殘基.但化學裂解法裂解位點的特異性低,有時可能對目標蛋白產生不必要修飾. 2,酶解法:反應條件溫和,具有高度的特異性.常用的酶

38、有Xa因子,凝血酶,腸激酶,凝乳酶,膠原酶等.但酶解法成本高 ,反應時間長,更重要的是蛋白酶本身不可避免地混入目標蛋白中,造成新的污染,提高純化的復雜性. 3,IMPACT系統(tǒng)(intein mediated purification with an affinity chitin-binding Tag) 該系統(tǒng)是由枯草桿菌來源的幾丁質結合域(5kD,chitin binding domain,用于親和純化)和酵母蛋白質剪接元件 intein組成一個雙效的融合標簽. intein在較低的溫度和還原條件下發(fā)生自身介導的N端裂解,釋放出與之相連的目的蛋白.因此融合蛋白無需蛋白酶裂解即可實現目的蛋

39、白與fusion tag的精確切割.但含有較多二硫鍵的蛋白不適合這一系統(tǒng). 分泌型表達為減少所需蛋白質在宿主體內被蛋白酶降解.或者使蛋白質能夠在體外正確折疊和便于提純,經常需要將被表達的蛋白質分泌到細胞外,因此要用分泌型載體.分泌型載體的優(yōu)點一些在胞內被蛋白酶降解的蛋白質在細胞周質中很穩(wěn)定;一些在胞內無活性的蛋白質在分泌后便具有活性,分泌可能使蛋白質能夠正確折疊;產生的蛋白質沒有氨基末端甲硫氨酸,因為切割位點在信號肽與編碼序列之間,甲硫氨酸會影響許多蛋白質的活性.蛋白質能夠在大腸桿菌中進行分泌,至少要具備3個要素:有一段信號肽;在成熟蛋白質內有適當的與分泌相關的氨基酸序列;細胞內有相應的轉運機

40、制.信號肽長度一般為1530個氨基酸殘基.真核生物和原核生物的信號肽在結構上都有以下特征:信號肽一般都不長,在氨基末端有一段帶正電荷的氨基酸序列,往往是精氨酸或賴氨酸殘基,其數目為13個;有一個高度疏水的核心區(qū),含亮氨酸或異亮氨酸殘基,位置可以從帶正電荷的氨基酸延伸到含切割位點的區(qū)域;含有能被信號肽酶水解的切割位點,這個位點常常在丙氨酸之后,有的是在甘氨酸或絲氨酸之后.分泌型載體也有缺點,例如目的蛋白質的產量往往很低,以及信號肽不能被切除或切在錯誤位置上等.非融合蛋白的表達指在細菌內表達的蛋白質以真核蛋白質mRNA的AUG為起始,在其氨基端不含任何細菌多肽序列.優(yōu)點:表達產物的生物學功能接近于

41、生物體內天然蛋白質.缺點:容易被細菌蛋白酶破壞.包含體(包涵體) 表達的蛋白質經常是不溶的,會在細菌內與細菌雜蛋白,核酸等成分形成不溶性聚合體即包含體(inclusion body),尤其當表達目的蛋白量超過細菌體總蛋白量10%時,就很容易形成包涵體.生成包涵體的原因可能有是蛋白質合成速度太快,多肽鏈相互纏繞,影響了多肽鏈的正確折疊,導致疏水基團外露等.包含體的形成有利于防止蛋白酶對表達蛋白的降解,并且非常有利于分離表達產物.但包含體形成后,表達蛋白不具有生物活性,因此必須溶解包含體并對表達蛋白進行復性.包含體的制備可通過常規(guī)方法如超聲波,勻漿等使菌體破碎后,離心就可得到.密度梯度離心后則可得

42、到高純度的包含體.包含體通常不溶于水,加入強蛋白質變性劑后方可溶解.根據包含體中蛋白質種類的不同,通常用68mol/L鹽酸胍或910mol/L尿素溶解包含體.采用pH 2.04.5的酸性溶液也可使包含體溶解.形成包含體的表達蛋白恢復其活性的過程稱為包含體蛋白質復性,其基本原理是隨著變性劑濃度的降低,表達蛋白恢復其天然構型.常用的復性方法有逐步稀釋法或透析法等.酵母表達系統(tǒng)1,基因背景了解清楚,上游操作簡單,生長迅速,非常適于大規(guī)模發(fā)酵.2,具有一定的加工及修飾能力:如二硫鍵的正確形成,前體蛋白的水解加工.表達產物與天然蛋白相同或類似.3,可將異源蛋白基因與N-末端前導肽等信號肽融合,指導新生肽

43、的分泌,在分泌中可對表達的蛋白進行糖基化修飾,但其修飾糖鏈與高等真核細胞并不相同. 4,可移去起始甲硫氨酸,避免了作為藥物使用可能引起的免疫反應問題. 缺點:產糖量過多因而損壞蛋白質的生物活性,安全性等;糖基化修飾與高等真核細胞并不相同. 載體:均為大腸桿菌和酵母菌的"穿梭"質粒.有附加體型載體和整合體型載體兩種.常用啟動子:GAL1,AOX1,AUG1,TEF1 等.酵母表達系統(tǒng)載體有:1,整合型載體: 導入酵母宿主細胞后與酵母細胞染色體基因組DNA整合,穩(wěn)定性高,但基因拷貝數低. 2,附加體型載體:在酵母宿主中拷貝數量大,但在傳代過程中易丟失,影響重組菌的穩(wěn)定性和表達量

44、. 常見宿主有:釀酒酵母,裂殖酵母,克魯維酵母,巴氏畢赤酵母等. 釀酒酵母表達系統(tǒng)多為附加型載體,巴氏畢赤酵母,多形漢遜酵母表達系統(tǒng)為整合型載體.克魯維酵母表達系統(tǒng)則兼而有之.釀酒酵母表達系統(tǒng)缺乏強有力的啟動子,分泌效率差,表達質粒易于丟失.目前,畢赤酵母表達系統(tǒng)是應用最廣泛的酵母表達系統(tǒng).它以甲醇作為唯一的碳源.產量較高.翻譯后的加工更接近哺乳動物 .如日本綠十字公司利用該系統(tǒng)可以達到公斤級水平的人血清白蛋白的生產.商品化酵母表達系統(tǒng)有畢赤酵母(Pichia)系統(tǒng) (invitrogen)和Saccharomyces釀酒酵母表達系統(tǒng)(invitrogen).畢赤酵母系統(tǒng)重組蛋白表達量可高達1

45、2 g /L,表達量最高.昆蟲細胞表達系統(tǒng)昆蟲細胞表達系統(tǒng)是以桿狀病毒為載體,昆蟲細胞為宿主的表達系統(tǒng). 1,表達效率高.重組蛋白的表達水平最高可達到細胞總蛋白的50%.2,屬于真核表達系統(tǒng).有糖基化作用,脂肪酸酰基化作用,氨基末端乙酰化作用以及磷酸化,有利于表達產物形成天然的高級結構,保持原有的生物活性與功能.3,桿狀病毒能容納較大的外源基因而不影響其本身的增殖.4,桿狀病毒屬于昆蟲病毒.具有高度特異的宿主范圍,對脊椎動物和植物均無致病性.病毒重組因失去多角體保護,在自然界的生存能力很弱,因此比較安全.5,應用晚期多角體蛋白基因啟動子表達外源基因可表達毒性蛋白. 6,桿狀病毒表達載體通用性廣

46、.可表達來自病毒,細菌,真菌,植物和動物幾乎所有的蛋白,并且能表達帶有內含子的外源基因. 7,重組桿狀病毒除在體外昆蟲培養(yǎng)細胞表達外源基因外,還能感染昆蟲活體,在體內高效表達外源蛋白.宿主細胞生長慢, 培養(yǎng)基昂貴, 含有免疫宿主蛋白, 桿狀病毒感染會導致宿主死亡,因此每一輪蛋白合成均需重新感染,昆蟲細胞內的糖基化方式與脊椎動物細胞內的糖基化方式有一定的差異,其糖蛋白的糖鏈結構多為簡單的不分支結構. 啟動子采用多角體蛋白啟動子.宿主細胞通常來源于雙翅目昆蟲,包括果蠅,蚊子.來源于草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)的Sf9細胞系是最常用的宿主細胞.商品化系統(tǒng):BaculoDir

47、ect 桿狀病毒表達系統(tǒng)(invitrogen),典型的桿狀病毒表達系統(tǒng)是利用大腸桿菌中位點特異的轉座或昆蟲細胞中的同源重組來產生重組桿狀病毒. DES -Drosophila expression system 結合了昆蟲細胞高表達水平和哺乳動物細胞的穩(wěn)定表達的優(yōu)點. 哺乳動物細胞表達系統(tǒng)哺乳動物細胞表達系統(tǒng)是生產天然蛋白的理想表達系統(tǒng),是目前應用最廣泛的動物細胞表達系統(tǒng).其優(yōu)點和缺點都極其顯著.產物的抗原性,免疫原性和功能與天然蛋白質最接近,糖基化等后加工最精確.一般會產生正確加工的,有活性的蛋白.但該表達系統(tǒng)的表達水平較低,培養(yǎng)基昂貴,生長緩慢,含有過敏物質等缺點在實際應用過程中較難避免

48、.哺乳動物細胞表達系統(tǒng)通常用來生產用常規(guī)方法無法獲得的真核細胞蛋白.如EPO,TNF受體,基因工程單抗等.CHO(中國倉鼠卵巢)是目前重組糖蛋白生產的首選體系. 載體:1,病毒性載體系統(tǒng),包括逆轉錄病毒載體及其它DNA病毒載體.優(yōu)點:能夠高效導入外源基因.缺點:包裝時對其基因組的長度有嚴格的限制,插入外源基因一般較短.2,質粒性載體系統(tǒng).優(yōu)點:適用于多種細胞;安全.缺點:導入外源基因的效率不如逆轉錄病毒. 商品化系統(tǒng):ViraPower 慢病毒表達系統(tǒng),是第一次實現在不分裂的哺乳動物細胞中進行穩(wěn)定的高水平基因表達.Adeno-X 表達系統(tǒng)-最有效的腺病毒系統(tǒng)之一.BD Adeno-X Expr

49、ession System (Clontech)可以在2周內獲得高效價的腺病毒,其效率遠高于其他腺病毒系統(tǒng).BD Adeno-X Tet-On & Adeno-X Tet-Off Expression Systems (Clontech) 可表達毒性蛋白質.BD RevTet-On & RevTet-Off Gene Expression Systems (Clontech) 表達效率高. 體外表達系統(tǒng)(無細胞表達系統(tǒng))體外翻譯系統(tǒng)又稱無細胞蛋白質合成系統(tǒng),是一種相對胞內表達系統(tǒng)而言的開放型表達系統(tǒng). 優(yōu)點:內源型mRNA干擾很小,操作程序簡單,獲得重組蛋白周期很短.主要用于蛋

50、白質快速分析鑒定;基因轉錄和翻譯調控機理研究;分子間的相互作用的研究. 缺點:昂貴;操作要求高;表達量不夠高. 1,兔網織紅細胞系統(tǒng),由新西蘭大白兔制備.2,麥胚提取物系統(tǒng),可穩(wěn)定地表達一些在兔網織紅細胞中翻譯受到抑制的DNA. 3,原核體外翻譯系統(tǒng)(S30原核體外翻譯系統(tǒng)), E.coli S30提取物由OmpT內切酶和Lon蛋白酶缺陷的E.coli B菌株制備,所以在S30系統(tǒng)中表達基因可以增加產物的穩(wěn)定性.目前多家公司有商業(yè)化產品,常見的有:RTS E.Coli 系統(tǒng);RTS100 wheat germ CECF系統(tǒng) (Roche)TNT 快速偶聯轉錄/翻譯系統(tǒng) (Promega);Go

51、ld TNT T7 Express 96系統(tǒng) (Promega),該系統(tǒng)有SP6和T7兩種類型,適合在96孔板上進行大規(guī)模高通量篩選分析; TNT T7 Quick for PCR DNA (promega),PCR DNA 的TNT T7快速系統(tǒng)從PCR反應液中直接取樣,無需純化DNA,直接用于偶聯的轉錄/翻譯反應; TNT 偶聯小麥胚芽抽提系統(tǒng) (promega).動物/植物表達系統(tǒng)(轉基因動物/植物) 轉基因動物指用人工方法將外源基因導入動物受精卵或早期胚胎細胞,使外源基因與動物本身的基因組整合,并隨細胞的分裂而增殖,從而將外源基因穩(wěn)定的遺傳給下一代的工程化動物.1981年,第一次成功地

52、將外源基因導入動物胚胎,創(chuàng)立了轉基因的動物技術1982年獲得轉基因小鼠,目前已有轉基因兔,綿羊,豬,魚,昆蟲,牛,雞,山羊,大鼠等轉基因動物. 優(yōu)點:1,高效性.2,表達產物具有與高等動物表達相一致的免疫原性和生物活性,表達產物可糖基化,酰胺化,磷酸化.3,來源廣,可進行大量田間栽培,成本低. 抗蟲棉,彩色棉,抗蟲玉米,大豆等,都已進入產業(yè)化和商品化階段.表達產物包括疫苗,抗體及其片斷,細胞因子,酶及其它藥用蛋白和生物活性肽等. 重組蛋白質表達的基本程序包括:1,目標基因克隆入表達載體,獲得表達質粒.2,表達質粒導入宿主細胞.3,目標基因在宿主中的表達.4,目標蛋白的分離,純化. 重組表達系統(tǒng)

53、一般包含表達載體和表達宿主.表達載體包含基因/外源DNA序列,表達載體,強啟動子,核糖體結合位點(SD序列),終止子,選擇標記,復制子等構件. 外源基因在原核細胞中的表達克隆菌:BL21,JM109表達菌:BL21(DE3),JM109 (DE3)1.重組質粒轉化:重組質粒各1 l,加入到100 l感受態(tài)大腸桿菌中,設空質粒為陽性對照和感受態(tài)大腸桿菌為陰性對照.37,培養(yǎng)16h.2.細菌擴增:用無菌接種環(huán)從平板上挑取5個克隆,分別接種到3ml含50 g/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中,并設陰性對照,300r/min振搖3hrs以上.3.誘導表達:當振搖至OD值=0.4.每管菌液各取出1ml加入I

54、PTG至終濃度為1mmol/L,另吸出1ml不加IPTG作對照.37,300r/min,培養(yǎng)4h.4,12000r/min離心1min,棄上清.每管加1ml PBS,混勻,同法離心.棄上清,每管加入50 l PBS,50 l 2×loading buffer,重懸沉淀,100煮沸5min,置-20備用.基因表達產物的檢測Northern雜交檢測細胞中是否含有特定的mRNA,測定特定mRNA在總RNA中的比例,由此獲得目的mRNA的轉錄情況.斑點雜交用特異性探針檢查mRNA,并估計表達過程中mRNA的轉錄強度.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分析誘導前后細胞中目的蛋白質的表達水平.如表達水平很

55、低,可用同位素作為放射性標記,如35S-甲硫氨酸或35S-半胱氨酸進行代謝標記,然后進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和放射自顯影,或在Western雜交中用特異性單克隆抗體或多克隆抗體分析目的蛋白質存在與否及其含量.免疫學方法利用特異性抗體與目的蛋白質進行反應,經免疫沉淀,ELISA等免疫學方法,檢測表達蛋白質.例如,免疫沉淀法可用于檢測并定量分析多種蛋白質混合物中的靶抗原.這種方法很敏感,可檢測出lOOpg的放射性標記蛋白質.當與SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳并用時,即可用于分析外源基因在原核和真核宿主細胞中的表達情況放射性標記靶蛋白的免疫沉淀以及其后的分析包括下列幾個步驟:靶蛋白的放射性標記;裂

56、解細胞;特異性免疫復合物的形成;免疫復合物的收集及純化;放射性標記蛋白質的免疫沉淀分析.SDS-PAGESodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE : 鑒定蛋白質的相對分子量磷酸鈉緩沖液(PBS):1mol/L Na2HpO4 68.4ml 1mol/L NaH2PO4 31.6ml.2. 2 ×loading buffer :0.1M Tris-HCl pH6.8,4% SDS,20% Glycerol,0.2 M DTT,0.2% Bromophenol Blue.3. Tris-甘氨酸緩沖

57、液:25mmol/L Tris, 250mmol/L甘氨酸,0.1%SDS.4.聚丙烯酰胺(Acrylamide;,N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺(Bisacrylamide);十二烷基硫酸鈉;N,N,N',N'-四甲基乙烯酰胺(TEMED;過硫酸胺;考馬斯亮藍R250 .1.洗凈玻璃板,按說明書安裝電泳裝置.2.配膠:8%分離膠組分為:ddH2O 2.3ml,30% Acrylamide 1.3ml,1.5mol/L Tris (pH 8.8)1.3ml,10% SDS 0.05ml,10% 過硫酸氨 0.05ml,TEMED 0.004ml.混合后,注入已安裝玻璃板的間

58、隙中,上覆純水隔離空氣.5%積層膠5ml組份為:ddH2O 3.4ml,30% Acrylamide 0.83ml,1.0mol/L Tris (pH6.8) 0.63ml,10% SDS 0.05ml,10%APS 0.05ml,TEMED 0.005ml.混合后,加入已凝聚的分離膠上,插入電泳梳子. 3.凝膠電泳:分別將各樣品10 l加入凝膠梳孔中,留取一孔加入蛋白Marker10 l,空孔加入10 l 1 ×loading buffer置于垂直電泳槽內,向上下槽分別加入電泳緩沖液,56V穩(wěn)壓電泳至溴酚藍指示劑泳動至積層膠與分離膠結合處(約20min左右),調整電壓至105V,電泳至指示劑泳動至分離膠下端邊緣(約50min左右)停止電泳.4.染色:將5倍體積染色液考馬斯亮藍R250加入染色缸中,搖床輕搖1h,至凝膠全部著色.5.脫色:反復更換脫色液至本底透明,成像儀攝片.原理:抗原抗體反應.酶聯抗體,底物顯色.Western Blot: 檢測蛋白質的免疫反應性質譜檢測;兩端氨基酸測序;生物學活性測定. 表達載體(expression vector)要使克隆基因在宿主細胞中表達,就要將它放入帶有基因表達所需要的各種元件的載體中,這種載