1、-測量不確定度在ELISA檢測中的評定和應用摘要：目的對測量不確定度在ELISA檢測中的評定和應用作出探討，提供一種表示ELISA檢測結果質量的方法，并尋找改進ELISA檢測質量的途徑。方法分別使用GUM法和自上而下評定法對ELISA檢測中的測量不確定度進展評定。結果應用GUM法舉例評定測量不確定度得出：人血漿清HIV抗原抗體反響吸光度與cutoff比值B=4.335；U=1.3；k=2。應用自上而下評定法舉例評定測量不確定度得出：人血漿清HCV抗體反響吸光度與cutoff比值=3.747；U=32.8；k=2。結論ELISA檢測引入測量不確定度后，會更科學地判定檢測結果，解決了“灰區設定“難

2、的問題。通過分析各分量的相對奉獻，可有效改進檢測工作質量，提升實驗室檢測水平。通過設立目標不確定度，可嚴格控制檢測結果質量，以到達預期的質量要求。關鍵詞：不確定度 ELISA 評定Evaluation and application of measurement uncertainty in ELISA detection【Abstract】Objective：To evaluate the role of measurement uncertainty in ELISA assay that provides a way of representation for the quality o

3、f results and improves the quality of the detection. Methods：Evaluate measurement uncertainty in ELISA test by using GUM and Top-down approach, respectively. Results：By GUM method, the absorbance value and cutoff value of the ratio in HIV antigen-antibody reaction of human plasma was 4.335，U=1.3 (k=

4、2). Relatively, Using Top-down approach absorbance value and cutoff value of the ratio in HCV antibody reaction of human plasma was 3.747，U=32.8 (k=2). Conclusion：Measurement uncertainty is introduced to ELISA what makes results more scientifically and Solves the problems of “gray zone. Analyzing re

5、lative contribution of various ponents of uncertainty on measurement results can improve work quality and enhance the level of laboratory testing. Setting the target uncertainty is help to quality control to achieve the ideal requirements.【Key words】Measurement uncertainty; ELISA; EvaluationELISA酶聯免

6、疫吸附試驗是指以酶作為標記物、以抗原和抗體之間免疫結合反響為根底的固相吸附測定方法。測定中，抗原與抗體在固相支持物上結合反響，酶與其底物作用后，利用顯色、產生熒光或發光強度與樣本中待測物濃度的呈正比或反比關系進展結果判定。由于ELISA在方法上的特異性、靈敏性較高，操作上的簡便性、試劑穩定性理想，目前已成為臨床免疫檢驗中的主導技術，在血站血液檢測中更是得到了廣泛的應用。但是，ELISA檢測中不精細性CV%較大且難于控制、設定“灰區又難尋標準、檢測結果的質量難以評價等問題一直困擾著檢測人員。本文對測量不確定度在ELISA檢測中的評定和應用作出探討，尋找解決相關問題的方法，以提高ELISA檢測的質

7、量。1 理論和方法測量不確定度是對測量結果質量的定量表征，測量結果的可信程度在很大程度上取決其不確定度的大小，測量結果必須附有不確定度說明才是完整并有意義的。為了使用統一的準則對測量結果及其質量進展評定、表示和比較，1995年由ISO、IEC和IFCC等7個國際化組織聯合修改公布了?測量不確定度表示指南?GUM1。1.1 不確定度的A類評定用對觀察列進展統計分析的方法，來評定標準不確定度。例如：評定基于以下信息：(a) 重復性測量。(b)期間精細度測量。(c) 復現性測量。1.2 不確定度的B類評定用不同于對觀察列進展統計分析的方法，來評定標準不確定度。例如：評定基于以下信息：(a) 權威機構

8、發布的量值。(b) 有證標準物質的量值。(c) 校準證書。(d) 儀器的漂移。(e) 經檢定的測量儀器的準確度等級。(f) 根據人員經歷推斷的極限值等。1.3 標準不確定度以標準差表示的測量不確定度。1.4 合成標準不確定度當測量結果是由假設干個其它量的值求得時，按其它各量的方差和協方差算得的標準不確定度。1.5 擴展不確定度確定測量結果區間的量，合理賦予被測量之值分布的大局部可望含于此區間。2 ELISA檢測中測量不確定度的評定2.1 GUM法或模型法GUM法是自下而上的評定方法，是?測量不確定度表示指南?GUM推薦的評定方法，是基于對測量的全面、系統分析后，識別出每個可能的不確定度來源后并

9、加以評定。本章參照JJF1059-1999?測量不確定度評定與表示?2，以評定ELISA法檢測人血漿清HIV抗原抗體反響吸光度與cutoff比值的測量不確定度為實例，介紹ELISA法檢測中測量不確定度評定的GUM法。 建立被測量的數學模型本文根據BIO-RAD公司的人類免疫缺陷病毒抗原抗體診斷試劑盒酶聯免疫法說明書3 提供的檢測結果計算和判定方法，建立被測量數學模型為： 1樣本反響吸光度與cutoff的比值；檢測樣本反響吸光度值；cutoff值，即臨界值指數。 2陰性對照的吸光度值均值。合并公式1和公式2得到： 3 不確定度來源分析分析不確定度來源時，應從設備、人員、環境、方法、材料及被測量對

10、象幾個方面全面考慮，不可遺漏，也不可重復。根據建立的數學模型，認為樣本反響吸光度與cutoff的比值的不確定度來源主要包括：a檢測樣本反響吸光度值(S)的不確定度：usb陰性對照吸光度值均值的不確定度：uN.1 檢測樣本反響吸光度值(S) 的不確定度uS來源根據檢測原理、試劑盒說明書和試劑確認試驗分析，檢測樣本反響吸光度值(S)不確定度主要由以下分量奉獻：a試劑孔間吸光度值的不確定度：uS1b樣本加樣量引入的不確定度：uS2c樣本加樣時間引入的不確定度：uS3d酶標儀的測量不確定度：uS4.2陰性對照吸光度值均值的不確定度uN的來源a陰性對照的吸光度值重復性引入的不確定度：uN1b酶標儀的測量

11、不確定度：uS4 評定測量不確定度分量.1 評定檢測樣本反響吸光度值(S)的不確定度檢測樣本反響吸光度值(S)的不確定度us分量見表1：表1 檢測樣本反響吸光度值(S)的不確定度評定一覽表符號來源類型概率分布包含因子標準不確定度靈敏系數us1試劑孔間吸光度值的不確定度合成-0.0821us2樣本加樣量引入的不確定度合成-0.413ul0.016us3樣本加樣時間引入的不確定度B均勻 8.66分鐘0.008us4酶標儀的測量不確定度合成- 0.0051 由于各標準不確定度分量互不相關，故檢測樣本反響吸光度值(S)的合成標準不確定度為：.2 評定陰性對照吸光度值均值的標準不確定度陰性對照吸光度值均

12、值的不確定度us分量見表2：表2 陰性對照吸光度值均值()的不確定度評定一覽表符號來源類型概率分布包含因子標準不確定度靈敏系數UN1陰性對照的吸光度值重復性引入的不確定度合成-0.0061us4酶標儀的測量不確定度合成- 0.0051 由于各標準不確定度分量互不相關，故陰性對照吸光度值均值()的合成標準不確定度為：=0.008評定樣本反響吸光度與cutoff比值B的不確定度根據公式3，樣本反響吸光度與cutoff的比值B的函數的表現形式為： 4本次檢測樣本的吸光度值為1.192，陰性對照的均值為0.075，cutoff值為0.275，S/C.O.值為4.335。將檢測數據和各標準不確定度分量代

13、入公式4，得到樣本反響吸光度與cutoff的比值B的合成標準不確定度為：=0.61 擴展不確定度評定取k=2，則本例樣本反響吸光度與cutoff的比值的擴展不確定度為：=1.3k=2=0.3 檢測結果本例樣本的檢測結果和不確定度為：人血漿清HIV抗原抗體反響吸光度與cutoff比值B=4.335；U=1.3；k=2。2.2自上而下評定法自上而下評定法是在控制不確定度來源或程序的前提下，評定測量不確定度，即運用統計學原理直接評定特定測量系統之受控結果的測量不確定度。典型方法是依據特定方案正確度評估和校準方案的試驗數據、QC數據或方法驗證試驗數據進展評定，正確度/偏移b和精細度/實驗室復現性s(R

14、w )是兩個主要的分量。本章參照AS-TRL-001:2021?醫學實驗室測量不確定度的評定與表達?4，以評定ELISA法檢測人血漿清HCV抗體反響吸光度與cutoff比值的測量不確定度為實例，介紹自上而下法評定ELISA法檢測中測量不確定度的方法。利用室質控數據評定實驗室測量復現性引入的測量不確定度如果室質控所使用的質控品，經過完整的測量過程并表達與常規樣本類似的基體，則根據質控數據計算出來的標準偏差就是實驗室測量復現性；如果實驗室室質控方案是每一批次實驗前后均測量*一特定濃度的質控品一次，分別計算測量平均值、標準偏差和變異系數，此時的標準偏差和變異系數在數值上與實驗室測量復現性引入的測量不

15、確定度和實驗室測量復現性引入的相對測量不確定度相等。 本實驗室用ELISA法檢測1NCU/ml的HCV抗體質控品，2012年11月12日至2013年3月21日共收集83個檢測值，經計算得出：平均值為：3.87標準偏差：0.59變異系數：15.3%實驗室測量復現性引入的測量不確定度為：0.59實驗室測量復現性引入的相對測量不確定度為：15.3 通過PT 數據評定由偏移引入的測量不確定度利用PT 數據評定不確定度簡便經濟，但是對于無計量溯源性的工程，應慎用。實際工作中，由于每次 PT 的公認值很難一致，所以通過PT 數據評定由偏移引入的測量不確定度時多采用相對值進展計算，需要的參數包括PT 組織者

16、給出的公認值、每個參加實驗室測量值 和由全部PT 數據得出的測量復現性或。2021年至2021年本實驗室參加衛生部臨床檢驗中心的5次ELISA法檢測HCV抗體PT結果及相關數據見表3。表3 5次ELISA法檢測HCV抗體PT結果及相關數據一覽表PT 次數單次 PT的公認值實驗室PT的測量值單次 PT的偏移量值單次 PT 相對偏移量值%單次 PT 的實驗室數量單次 PT 的相對測量復現性%111.613.21.65.171615.3211.813.31.54.241615.3314.114.70.64.261715.3414.114.90.85.671715.35117.8-3.22.73171

17、5.3按照AS-TRL-001:2021?醫學實驗室測量不確定度的評定與表達?4提供的公式計算得出：a)相對的方法和實驗室偏移：4.53b)屢次PT 公認值的測量復現性引入的相對測量不確定度：3.76c)由偏移引入的相對測量不確定度：5.88樣本反響吸光度與cutoff的比值B的擴展不確定度由實驗室測量復現性引入的相對測量不確定度為15.3，由偏移引入的相對測量不確定度為5.88，樣本反響吸光度與cutoff的比值B合成的擴展不確定度為：16.4取k=2，則本例樣本反響吸光度與cutoff的比值的擴展不確定度為：=32.8k=2 檢測結果本次檢測樣本的吸光度值為0.562，S/C.O.值為3.

18、747。本例樣本的檢測結果和不確定度為：人血漿清HCV抗體反響吸光度與cutoff比值=3.747；U=32.8；k=2。3 應用和討論3.1 更科學地判定檢測結果，防止“灰區設定的難題ELISA檢測的定性判斷中，一般試劑盒說明書對樣本反響吸光度與cutoff的比值B1的結果判定為陽性，樣本反響吸光度與cutoff的比值B1的結果判定為陰性。實際檢測中，經常會發現接近cutoff值的“灰區樣本，這樣的樣本對于血站血液檢測、特殊體檢如：征兵體檢等檢驗活動非常重要，判定其結果屬性是需要承擔很大風險的。但是目前國的傳染性病原體抗原抗體ELISA檢測試劑盒根本都沒有涉及“灰區問題。既是局部進口試劑設置

19、了“灰區，也是試劑生產企業在特定試驗條件下的設定值，不能代表本實驗室按此設置就一定可靠。引入測量不確定度的概念后，給ELISA的檢測值賦予分散性，將檢測值由原來的“點變為“段，則有：B±B×1結果判定為陽性，B±B×1結果判定為陰性，這意味著在B±B×區間包含了檢測結果的絕大多數局部，因此吸光度值低于但接近cutoff值的樣本BB×1被判定為陽性，可有效降低假陰性出現的風險。另外，真實反映了本實驗室的檢測質量與水平，比設定固定的“灰區圍更合理，也更實用。3.2分析各分量的相對奉獻，有效改進檢測質量影響檢測質量的因素很多，有些

20、因素可以消除，有些因素可以通過一些控制方法使其對測量的影響降低。評定測量不確定度就是改進實驗室檢測質量的有效途徑。通過分析各分量對測量結果不確定度的相對奉獻大小，可以分析出影響檢測質量的主要因素，并有針對性地改善或控制*些影響因素后，能更有效地掌控試驗條件，提高檢測質量。本文在GUM法評定測量不確定度中，可以使用每個分量的標準不確定度除以檢測結果的合成標準不確定度，得到每個分量不確定度的相對奉獻見圖1。通過圖1可發現本實驗室影響人類免疫缺陷病毒抗原抗體ELISA檢測結果質量的主要分量是試劑孔間吸光度值的不確定度和樣本加樣時間引入的不確定度。實驗室可通過選用精細性更好的檢測試劑進一步減小試劑孔間

21、吸光度值的不確定度，可通過使用全自動液體處理系統來縮短加樣時間來減小加樣時間引入的不確定度。這樣可有效降低檢測結果的測量分散性，提高檢測質量。. z-圖示：uS1：試劑孔間吸光度值不確定度uS2：樣本加樣量引入的不確定度uS3：樣本加樣時間引入的不確定度uS4：酶標儀的測量不確定度uN1：陰性對照的吸光度值重復性引入的不確定度. z-圖1 不確定度分量奉獻3.3 建立目標不確定度，控制檢測結果的質量目標不確定度是根據測量結果的預期用途，規定作為上限的測量不確定度。醫學實驗室有責任與臨床共同設立檢驗結果的目標不確定度，血站則更應該設立較為嚴格的目標不確定度。實驗室在報告檢驗結果前，應判斷檢測結果

22、的測量不確定度是否到達目標不確定度的要求。如果未到達要求，說明該實驗室的檢測結果尚未控制在期望的質量水平圍。血站的實驗室不能將超過目標不確定度的檢測結果發布使用。IFCC、ILAC、IUPAC和NMIS推薦應用合成標準不確定度作為“分析目標，因為有通用、部一致、可轉換等優點。但是，目前習慣分別為測量變異、偏移設立目標，其根底是測量變異應小于給定值的個體和/或個體變異4。血站的ELISA檢測試劑要求其批CV15%，結合實驗室設備、試劑批次、人員操作、環境等引入的變異，血站推薦設定ELISA檢測工程的目標擴展不確定度40%，最大不能超過50%，否則失去控制檢測結果質量的意義。3.4 自上而下評定法評定測量不確定度在ELISA檢測中的局限性自上而下評定法在ELISA檢測中評定測量不確定度的優點是簡單、經濟、實用，但也發現了一些使用的局限性，如：(1) 室質控品往往不能包含所有被測量。如：ELISA法檢測HIV抗原抗體時，一般的實驗室僅選擇HIV-1型抗體作為室質控品，所獲得的數據不能涵蓋全部被測量。因此不