1、坦布蘇病毒簡介1、坦布蘇病毒病概述2010 年 4 月以來在我國大部分養(yǎng)鴨地區(qū)發(fā)生了一種以傳播迅速、突發(fā)性的產蛋急劇下降為主要特點的新鴨病。臨床主要表現為：產蛋鴨產蛋嚴重下降，產蛋率從90降至 10以內，甚至絕產，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了嚴重的經濟損失 (李玉峰， 2011)。該病最初命名為“鴨出 血性卵巢炎”，“鴨病毒性腦炎”，“鴨產蛋下降綜合癥”，“鴨傳染性卵巢炎”(黃欣，2011；李玉峰， 2011；廖敏等， 2011)等。蘇敬良等從病鴨中分離出了一種新型黃病毒，并 命 名為 BYD 病 毒 ， 屬 于 在 鴨 上 首 次 發(fā) 現 。 2012 年 該 病 被 確 診 是 鴨 坦 布 蘇 病毒 (

2、DuckTembusuvirus, DTMUV)。到目前為止，更有報道本病在蛋雞、雞群及鵝群(傅光華等，2011；黃欣梅， 2011)中發(fā)現。關于本次在鴨上傳播的鴨黃病毒，病毒學家，法國馬賽第二 大學的訪問學者 ErnestGould 表示，由蚊子造成的傳播不應該是一種必然的結果，并指出這種病毒傳播期間的溫度變化與由蚊子傳播的其他黃病毒并不一致。(鴨子在早春的寒冷氣 候中開始患病，而推測起來，蚊子種群在此時還很虛弱，而疾病的暴發(fā)則會一直持續(xù)到秋 季。)鑒于該病為鴨群新發(fā)生的疫病，除該病的病原學外，其致病機理、免疫機理、快速診 斷技術和防制措施等，都有待進一步深入研究。2、病原學鴨出血性卵巢炎的

3、病原與恩他耶病毒群的坦布蘇病毒(Tem-busuvirus, TMUV)印尼和泰國病毒株的核苷酸同源性為 87%91%，氨基酸同源性為 98%99%;而與同群的 Ntaya 病 毒、Sitiawan 病毒、Theilersmurineencephalomye-litisvirus(TMEV) Bagaza 病毒的核苷酸同 源性大于70%，國際上對黃病毒屬成員的分類標準為NS5 基因 3端長約 1kb 的區(qū)域中同種病毒的核苷酸序列同源性大于 84%。因此確定該病原為黃病毒科黃病毒屬恩他耶病毒群的 TMUV。鴨坦布蘇病毒(DuckTembusuvirus DTMUV)屬于黃病毒科(Flavivir

4、idae)、黃病 毒屬(Flavivirus)。TMUV 的病毒粒子直徑 405Onm,有脂質囊膜(胡旭東等，2011)。 病毒基因組為單股正鏈 RNA,大小為。病毒基因組結構鴨坦布蘇病毒基因組為不分節(jié)段的單股正鏈 RNA，分子量約為X106(Shustov,AVetal.,2007)由 10990 個核苷酸構成(Yun,Tetal.,2012)b 病毒基因組由 3非編 碼區(qū)(3 untranslatedregion，UTR)， 5非編碼區(qū)(5 non-codingregion，NCR 及一個開放性閱讀框（openreadingframe, ORF 組成。3非編碼區(qū)由 618 個核苷酸構成，與

5、其 他黃病毒不同，3非編碼區(qū)還含有一個 poly（A）尾，包括起始、調節(jié)基因組復制和轉錄 的保守二級或三級 RNA 元件。5非編碼區(qū)由 94 個核苷酸構成，在黃病毒屬中該結構保守 性較差，其主要功能是在 RNA 復制過程中作為正鏈合成的起始位點。病毒基因組的開放性 閱讀框（ORF）包含 10230nt,編碼一個大多聚蛋白，由 3426 個氨基酸構成，可以裂解為 3 個結構蛋白（C、M、E 蛋白）和 7 個非結構蛋白（NS1, NS2A NS2B NS3, NS4A NS4B NS5）（Mukhopadhyay,Setal.,2005K E、NS1、NS3 NS5 蛋白具有保守性和抗原性。 C

6、蛋白的 氨基酸同源性低，含有大量的堿性氨基酸，參與病毒組裝過程。E 蛋白是 DFV 主要表面蛋白，具有促使病毒與宿主細胞結合及膜融合功能，能誘導產生中和抗體。DFV 的非結構蛋白 NS1 是黃病毒中最大的，是病毒感染過程中產生的主要免疫原，但NS1 免疫不能誘導無明顯的抗病毒抗體產生，發(fā)生抗體增強效應的可能性較小（TangY, etal.,2011）。NS3 蛋白具有絲氨酸蛋白酶、核苷三磷酸酶/RNA 解旋酶活性，參與蛋白質水解加工及病毒復制，與病 毒的致病性密切相關（鄭杰，2007）。NS3 與 NS2 組成病毒復制體，感染動物可產生抗 NS2-3 抗體，但抗 NS2-3 抗體不具有病毒中和

7、活性（鄭杰，2007）。基因組 RNA 就是 DTMUV 特異性 RNA,具有感染性、攜帶全部遺產信息、在病毒增殖過程中，直接起mRNA 作用，既可復制子代 RNA 又可翻譯出病毒蛋白。生物學特性TMUV 對乙醚及去氧膽酸鹽敏感。56C加熱 15 分鐘滅活。最適 pH 為，pH10 以上使其 滅活。對酸敏感。 TMUV 在胰酶處理后，感染性喪失。鴨坦布蘇病毒可以在鴨胚、雞胚、 鴨胚成纖維細胞及部分傳代細胞系如 Vero 細胞中繁殖。將鴨坦布蘇病毒經尿囊腔接種雞胚 和鴨胚，3-5d 后可致雞胚和鴨胚死亡。接種 CEF 盲傳 5 代不會產生病變，而將鴨源胚毒第 1 代接種 DEF 就在 48h出現

8、了明顯 CPE 適應 DEF 后的病毒， 通常在 36-48h 就會產生 CPE 隨時間延長， CPE 會更加明顯，表現為細胞圓縮和脫落，細胞折光性增強，細胞變圓以及 細胞融合，最終崩解死亡。通過 .染色便可見細胞破碎，并有大量紅染顆粒。通過RT-PCR檢測，接種病毒的 CEF 為陰性，而接種 DEF 后檢測為陽性（李玉峰等，2011）。3 鴨坦布蘇病毒的研究現狀1997 年，溫立斌等（溫立斌，2001）從石家莊、邢臺、邯鄲等地發(fā)現康貝爾鴨產蛋下降，有神經癥狀，分離到有囊膜 RNA 病毒，經初步鑒定，疑似黃病毒，初步命名為“鴨病毒性 腦炎”。曹貞貞等（曹貞貞， 2010）于 2010 年將種鴨

9、和蛋鴨發(fā)病死亡病例暫命名為“鴨出血 性卵巢炎”。2011 年，蘇敬良、高福等 （蘇敬良等， 2011）經過大量的研究工作，測序分析 將其命名為白洋淀（BYD 病毒。李玉峰等（李玉峰，2011）發(fā)現，除種鴨外，商品肉鴨也發(fā) 病。黃欣梅等（黃欣梅，2011）報道鴨鵝均發(fā)病，將其命名為“腦炎-卵巢炎綜合征”。隨后， 傅光華等（傅光華等，2011；黃欣梅，2011）報道本病在蛋雞、雞群中發(fā)現。截至2011年12月15 日， GenBank數據庫收錄了 9株鴨源、 1株鵝源、 1株雞源共11 株DTMUV的基因序列。毒株名稱GenBank 登錄號分離來源YY5 株(HQ641390.1)鴨BYD-1 株

10、(JF312912.1)鴨duck/SD/CHN/2010株(JF738022.1)鴨Fen gxia n株(HQ833331.1)鴨Huabei 株(JF523187.1)鴨CJD05/CHN/2010株(JF795477.1)鴨HBJL 株(JF423123.1)鴨JS804 株(NC015843.1)鵝JM 株(JN811559.1)鴨FS 株(JN811558.1)鴨muscovy/SD/Ch in a/2011株(JN232077.1)鴨11 株鴨坦布蘇病毒的多聚蛋白、 NS5E 基因核苷酸序列同源性均大于98%。其中 BYD-1JS804 FS JM、muscovy/SD/Chin

11、a/2011、CJD05 等 6 株病毒完成了全基因組或聚蛋白基因 序列分析。E 基因遺傳進化分析發(fā)現，11 株鴨坦布蘇病毒分屬于 2 個分支，其中 CJD05Fengxian JS804 muscovy/SD/China/2011 等 4 株的親緣關系相近，與泰國蚊源株 THCar 同 屬一個分支；而 BYD-1、FS JM、duck/SD/CHN/2010 等 4 株的親緣關系相近，屬于另一個 分支。NS5基因遺傳進化分析結果表明， 11 株 DFV 分屬于 2 個分支， 其中 Huabei 與其它 10 株親緣關系較遠，與 TembusuvirusnoteN2revived14/6/82

12、 同屬一個分支；而其它 10 株的 親緣關系相近，與泰國蚊源株 THCar 同屬于一個分支。NS5 和 E 基因進化分析結果提示我 國的 DFV 源頭可能來東南亞，而不同地區(qū)流行病毒株存在遺傳變異情況（李玉峰，2012）。4 流行特點鴨坦布蘇病毒在自然爆發(fā)時可感染除番鴨外的所有品種產蛋鴨，包括蛋鴨（如金定鴨、紹興鴨、山麻鴨、縉云麻鴨、臺灣白改鴨、康貝爾鴨）、肉種鴨（如北京鴨和櫻桃谷鴨）及野鴨等（滕巧泱等，2010）。也有相關報道產蛋雞（傅光華、陳仕龍等，2011）、鵝自然感染發(fā) 病（黃欣梅，2011）。在病毒的復制研究中，也有相關報道稱人工肌肉注射或滴鼻接種分離的 病毒在雛鴨、雛雞、蛋鴨、雛鵝

13、中成功復制出該病并回收到病毒（李玉峰等，2011 ;廖敏等,2011 ;曹貞貞，2010； SuJing-liangandHuXu-dong 2011；黃欣梅，2011）。到目前為止，有相關領域的研究人員從泄殖腔棉拭子中分離到病毒，表明該病毒可經 糞便排毒；另一方面，相關領域的研究人員從鴨場內死亡麻雀體內檢出鴨坦布蘇病毒，提 示病毒可經鳥類傳播；帶毒蚊子和麻雀可導致病原在不同鴨場間的傳播。在病鴨組織樣品 中進行病毒分離，卵泡膜的檢出率最高，達93%，近期該病毒在種鴨和種鵝上的垂直傳播也有報道。5 診斷目前可用于鴨坦布蘇病毒病原分離與鑒定的方法主要有SPF 雞胚和鴨胚病原分離法（Cao,Zeta

14、l.,2011）常規(guī) RT-PCR 檢測方法（Yan,Petal.,2011） 步法 RT-PCR 檢測方法（張帥 等,2012） 、 套式 PCF 檢測方法（顏丕熙等,2011） 、 Real-timeRT-PC 檢測方法 （Yan,Letal.,2011）一步法 Real-timeRT-PCF 檢測方法（Yun,Tetal.,2012） RT-LAMP 檢測方法（Tang,Yetal.,2012和 間接 ELISA 法（姬希文等,2011）等。實驗室診斷鑒于對鴨坦布蘇病毒病的研究還不夠深入，目前實驗室用于檢測鴨坦布蘇病毒病的病 原的方法不是很多，但是每一種都有自身的優(yōu)缺點。常規(guī)的檢測方法主

15、要是血清學方法， 包括中和試驗、血凝試驗、瓊脂免疫擴散試驗、熒光抗體技術、酶聯免疫吸附試驗以及分 子生物學實驗等。血清中和試驗 （Virus-neutralizationtest,VN）中和試驗是目前最常用、最可靠的方法，是公認的一種權威方法。通常在雞胚上以固 定血清 -稀釋病毒法進行，也有人在鴨胚、雛鴨或病毒適應細胞中進行試驗。就目前而言，此病的中和試驗的孵育溫度、病毒量等的最佳條件的研究，還未見報道。利用中和抗體進 行的空斑減少試驗，微量中和試驗也未見報道。中和試驗雖是普遍認為的權威診斷方法， 但其繁瑣、費時、成本高，不能用于快速診斷，難以在基層中推廣應用。在診斷其他鴨病 上被認為是一種最

16、可靠的方法，但用該方法診斷鴨坦布蘇病毒病的研究還未見報道，相信 在不久的時間內該方法的研究報道將接踵而來。酶聯免疫吸附試驗酶聯免疫吸附試驗（Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA 是當前酶免疫測定技術中 應用最廣泛的技術， 姬希文等（姬希文等， 2011） 首次建立了間接 ELISA 法以檢測鴨坦布蘇病 毒 （DTV）抗體，利用純化的 DTV 奉賢株（FX2010 作為包被抗原，建立了檢測 DTV 血清抗體 的間接 ELISA方法，并且對各種檢測條件進行了優(yōu)化。優(yōu)化后確定的抗原最適包被濃度為卩g/孔，抗原最佳包被條件為 37C放置 2h 后，4C下過夜，血清

17、的最佳稀釋度為 1 : 200,酶 標二抗的最佳作用時間為 45min，酶標抗體最適稀釋度為 1 : 2000。在優(yōu)化條件下，陰陽性 臨界值判定標準為。用建立的間接 ELISA 方法對禽流感病毒、新城疫病毒、網狀內皮增生病 病毒、 I 型鴨肝炎病毒、呼腸孤病毒、禽白血病病毒陽性血清進行了檢測，均無交叉反應，表明該方法具有良好的特異性。批內和批間重復試驗的最大變異系數分別為%和%，顯示該方法具有很好的穩(wěn)定性。用間接 ELISA 方法對 140 份疑似鴨坦布蘇病血清樣品進行檢測， 有 108份樣品呈現陽性， 而瓊擴試驗只有 32 份呈陽性結果， 而且用該方法檢測的陽性樣品 包括了瓊擴試驗的陽性樣品

18、，證明該方法具有較高的敏感性和特異性。間接 ELISA 方法雖然具有靈敏度高，操作簡便、特異性強的優(yōu)點，很多學者也建立了用 以診斷 DTV 的這種方法，但因所用的檢測試劑（包被液、封閉液、酶標抗體等）尚未標準 化，病毒的純化和 DTV 陰性血清的制備等均存在一定難度，該方法在鴨坦布蘇病毒的檢測 診斷方面還未能得到廣泛的應用 （姬希文等， 2011）。分子生物學實驗 近兩年來，隨著分子生物學技術的飛速發(fā)展，專家學者對鴨坦布蘇病毒的研究不斷地 深入，已經建立起檢測鴨坦布蘇病毒的分子生物學方法。曹貞貞、張存等在對不同地區(qū)的 15 份樣品進行病毒分離后，RT-PCR 僉測結果顯示禽流感、鴨瘟病毒、水禽

19、細小病毒、鴨呼 腸孤病毒、鴨甲肝病毒、鴨形狀病毒、鴨圓環(huán)病毒、鴨冠狀病毒、雞傳染性支氣管炎呈陰 性， 15 份樣品中，1 份樣品新城疫病毒陽性， 為自然病例的混合感染現象； 僅黃病毒 RT-PCR 檢測呈陽性。這對于鴨坦布蘇病毒的準確分類以及建立快捷的診斷方法奠定了基礎（曹貞 貞等， 2010）。顏丕熙等根據鴨坦布蘇病毒 E 基因序列，設計了 2 對重疊引物，建立了檢測鴨坦布蘇 病毒的套式 RT-PCR 方法，該套式 RT-PCF 比一般 PCR 敏感性高 10 倍，且具有良好的特異性。 應用該套式 RT-PCF 對臨床病料進行檢測驗證，結果表明該套式 RT-PCF 是檢測鴨坦布蘇病 毒的有效

20、手段，可用于鴨坦布蘇病毒的臨床診斷和分子流行病學調查。采用該方法對安徽 省、河北省、山東省、浙江省、上海市等地發(fā)病鴨場的 63 份樣品進行了檢測，陽性檢出率 為 48/63（%），而病毒分離率僅為 13/63（%）。由此表明，與其他方法相比較，所建立 的套式 RT-PCR 方法具有快速、敏感、特異優(yōu)點，可用于鴨坦布蘇病毒的流行病學調查及病 毒的檢測 （顏丕熙， 2011）。云濤等建立的一步法實時熒光定量 RT-PCR 僉測方法，利用 MGB 探針，在 3非編碼區(qū)設計一對引物和探針，最低能檢出10Copies/yL 的體外轉錄 RNA 量，在保證快速、準確、 特異的基礎上，大大提高了檢測的敏感性，有利于，為鴨坦布蘇病毒病的疫病監(jiān)測和控制 提供技術支持(云