1、秘魯魷魚肌肉中氧化三甲胺脫甲秘魯魷魚肌肉中氧化三甲胺脫甲基酶的分離純化及生化特性研究基酶的分離純化及生化特性研究李兆杰李兆杰 付雪艷付雪艷 薛長湖薛長湖 中國海洋大學食品科學與工程學院中國海洋大學食品科學與工程學院2006/11/26 氧化三甲胺（氧化三甲胺（TMAOase)是廣泛存在于海洋是廣泛存在于海洋水產品中的一種非蛋白氮成分，具有重要的水產品中的一種非蛋白氮成分，具有重要的生理功能。生理功能。調節滲透壓調節滲透壓調節浮力。調節浮力。穩定蛋白，防止尿素的變性作用。穩定蛋白，防止尿素的變性作用。保護蛋白，防止冷凍的變性作用。保護蛋白，防止冷凍的變性作用。保護蛋白，防止高壓的變性作用。保護蛋

2、白，防止高壓的變性作用。調節蛋白中二硫鍵的形成。調節蛋白中二硫鍵的形成。羅非魚中氧化三甲胺的合成機制羅非魚中氧化三甲胺的合成機制CBP，2002，131(B):371-386lizardfishRed hakeWalleye pollackWalleye pollacksquid TMAO DMA + FATMAOase肌肉蛋白質的變性肌肉蛋白質的變性這種現象的發生在鱈科類魚中和魷魚類中可能會比較嚴重。蛇鯔中，腎、脾，膽囊、腸、肝臟蛇鯔中，腎、脾，膽囊、腸、肝臟Lwt, 1998, 31(5):449-453.美洲大赤魷（Docidicus gigas)的世界產量莖柔魚是柔魚科中個體最大的種類

3、，全莖柔魚是柔魚科中個體最大的種類，全長可達長可達4米，體重可達米，體重可達50公斤以上，系公斤以上，系淺海大洋性種。主要分布于東太平洋的淺海大洋性種。主要分布于東太平洋的秘魯、哥斯達黎加海域及其外海，即北秘魯、哥斯達黎加海域及其外海，即北緯緯36度至南緯度至南緯26度、西經度、西經125度以東的度以東的美洲西岸水域。美洲西岸水域。 各產地魷魚絲的品質比較各產地魷魚絲的品質比較品名品名產地產地描述描述pH甲醛含量甲醛含量（ppm）烤魷魚絲（秘魯）烤魷魚絲（秘魯）中國青島中國青島無皮，色白，味甜無皮，色白，味甜6.0958烤魷魚絲（近?？爵滛~絲（近海)中國青島中國青島無皮，色微黃，味甜無皮，色微

4、黃，味甜6.0170烤魷魚絲（秘魯）烤魷魚絲（秘魯）中國舟山中國舟山無皮，色白，味甜無皮，色白，味甜5.9025烤魷魚絲（北太）烤魷魚絲（北太）中國舟山中國舟山無皮，色白，味甜無皮，色白，味甜5.9033干魷魚鰭（北太）干魷魚鰭（北太）中國舟山中國舟山帶皮，色紅，無味帶皮，色紅，無味-41烤魷魚絲烤魷魚絲日本，株日本，株式會社式會社帶皮絲，味甜帶皮絲，味甜6.0921烤魷魚絲烤魷魚絲日本，東日本，東京都京都帶皮絲，味酸帶皮絲，味酸5.4823烤魷魚絲烤魷魚絲日本，白日本，白石海產石海產無皮，酸甜適口無皮，酸甜適口5.6421.5熏魷魚絲熏魷魚絲日本，高日本，高橋橋煙熏味，味酸煙熏味，味酸5.2

5、841.551.TMAOase 純化純化離心離心秘魯魷魚秘魯魷魚1M NaCl 勻漿勻漿調節調節 pH 到到 4.5調節調節pH至中性至中性DE52S-300純化酶純化酶80 加加20min實驗方法實驗方法TMAOaseReaction mixture10TCAOne unit (U) of TMAOase activity was expressed as 1 mol DMA production per minute.8000 rpm, 15 min50, 1 hDMA determination2. TMAOase assaycentrifugationFe2+TMAOCysVclEff

6、ect of pH on activity and stability lEffect of temperature on activity and stabilitylEffects of chemicals on the TMAOase activity lKinetic studies魷魚中TMAOase 純化倍數StepsProtein(mg)Protease activity (U)Specific activity (U/mg)Purification foldYield(%)Myofibillarfraction4510848.70.191100Acid treatment286

7、6842.3912.680.6Heated-treatment80.4545.16.7835.764.2DE528.142652.627650.2S-3002.3135.715983916.0實驗結果與討論實驗結果與討論0NaCl(M)0.5DE52Fig. 1. Purification of the TMAOase from jumbo squid. Ion exchange chromatography on DE 52. 0.15-0.18M NaCl116.035.014.418.445.025.017.5kDa66.2kDaS300 Gel filtration on Sephac

8、ryl S-300 and SDS-PAGE of the purified TMAOase.Sbovine serum albuminegg albuminphosphorylase blysozyme狹鱈肌肉組織中TMAOase的分子量FISHERIES SCIENCE 2000; 66: 967973魷魚中TMAOase 純化倍數StepsProtein(mg)Protease activity (U)Specific activity (U/mg)Purification foldYield(%)Myofibillarfraction4510848.70.191100Acid trea

9、tment2866842.3912.680.6Heated-treatment80.4545.16.7835.764.2DE528.142652.627650.2S-3002.3135.715983916.0FISHERIES SCIENCE 2000; 66: 967973不同提取方法對不同提取方法對TMAOase提取率的影響提取率的影響AB粗提的和純化的粗提的和純化的TMAOase的溫度特性的溫度特性 FISHERIES SCIENCE，2003;69: 414420中國食品學報，中國食品學報，2006,6(3):200-203B BA AA A，TMAOaseTMAOase在不同在不同p

10、HpH下的穩定性下的穩定性B,B, TMAOaseTMAOase的最適的最適pHpH . .stability 酸堿處理可以降低酸堿處理可以降低TMAOase活性活性 AdditivesConcentration (mM)Relative activity (%)control10.1FeCl2+ Cys + Vc0.2 mM FeCl2100FeSO4+ Cys+ Vc0.2 mM FeSO4100FeCl2+Cys 2 mM Cys78.9FeCl2+ Vc2 mM Vc38.3Cys+ Vc6.25EDTA+ FeCl2+Cys + Vc10 mM EDTANa2SO3+FeCl2+Cy

11、s+Vc10 mM Na2SO3NADH+ FeCl2+Cys + Vc 0.4 mM NADHDTT+ FeCl2+Cys + Vc1mM DTTCaCl2+ FeCl2+Cys + Vc10 mM CaCl2MgCl2+ FeCl2+ Cys + Vc 10mM MgCl2化學試劑對酶活性的影響化學試劑對酶活性的影響 2-fold !InhibitorsConcentration(mM)Inhibition (%)control0tea polyphenol195.61098.6phytic acid175.41095.6acetic acid178.31097.1抑制劑對抑制劑對TMAOaseTMAOase的影響的影響Fig. 5. Kinetic analysis of TMAOase. The purified TMAOase was added into standard ass