1、基因工程酶學基礎限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶連接酶連接酶DNADNA聚合酶聚合酶 限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶 （restriction endonucleaserestriction endonuclease）這類酶又簡稱為限制性內切酶或限制酶這類酶又簡稱為限制性內切酶或限制酶 。 是一類能夠識別雙鏈是一類能夠識別雙鏈DNADNA分子中的某種特定核苷酸分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割序列，并由此切割DNADNA雙鏈結構的核苷酸內切酶。雙鏈結構的核苷酸內切酶。 寄主控制的限制（寄主控制的限制（restrictionrestriction） 與修飾與修飾 (modification

2、) (modification) 現象：現象： 人們發現侵染大腸桿菌的噬菌體都存在著人們發現侵染大腸桿菌的噬菌體都存在著一些功能性障礙。即所謂的寄主控制的限制與一些功能性障礙。即所謂的寄主控制的限制與修飾現象簡稱（修飾現象簡稱（R/MR/M體系）。體系）。 細菌的細菌的R/MR/M體系類似于免疫系統，能辨別體系類似于免疫系統，能辨別自身的自身的DNADNA與外來的與外來的DNADNA，并能使后者降解掉。，并能使后者降解掉。 R/MR/M體系：體系： 寄主是由兩種酶活性配合完成的寄主是由兩種酶活性配合完成的 一種是修飾的甲基轉移酶一種是修飾的甲基轉移酶 另一種是核酸內切限制酶另一種是核酸內切限制

3、酶 E.E.colicoliB B含有含有EcoBEcoB核酸酶和核酸酶和EcoBEcoB甲基化酶甲基化酶 當當(k)(k)噬菌體侵染噬菌體侵染E.E.colicoliB B時，由于時，由于其其DNADNA中有中有EcoBEcoB核酸酶特異識別的堿基核酸酶特異識別的堿基序列，被降解掉。而序列，被降解掉。而E.E.colicoliB B的的DNADNA中雖中雖然也存在這種特異序列，但可在然也存在這種特異序列，但可在EcoBEcoB甲甲基化酶的作用下，催化基化酶的作用下，催化S- S-腺苷甲硫氨酸腺苷甲硫氨酸（SAMSAM）將甲基轉移給限制酶識別序列）將甲基轉移給限制酶識別序列的特定堿基，使之甲基

4、化。的特定堿基，使之甲基化。 EcoB EcoB核酸酶核酸酶不能識別已甲基化的序列。不能識別已甲基化的序列。 R/MR/M體系的作用：體系的作用： 保護自身的保護自身的DNADNA不受限制；不受限制； 破壞外源破壞外源DNADNA使之迅速降解使之迅速降解 限制性內切酶本是微生物細胞中用于專門水解限制性內切酶本是微生物細胞中用于專門水解外源的一類酶，其功能是避免外源外源的一類酶，其功能是避免外源的干擾或噬菌體的感染，是細胞中的一種防的干擾或噬菌體的感染，是細胞中的一種防御機制。由于御機制。由于R/MR/M現象的發現使得核酸內切酶現象的發現使得核酸內切酶成為基因工程重要的工具酶。成為基因工程重要的

5、工具酶。 根據酶的功能、大小和反應條件，及切割根據酶的功能、大小和反應條件，及切割的特點，可以將限制性內切酶分為三類：的特點，可以將限制性內切酶分為三類： 型酶、型酶、型酶、型酶、 型酶型酶型酶：型酶： 1968 1968年，年，M.MeselsonM.Meselson和和R.YuanR.Yuan在在E. E.colicoliB B和和E. E.colicoliK K中分離出的核酸內切酶。中分離出的核酸內切酶。 分子量較大，反應需分子量較大，反應需MgMg+、S- S-腺苷酰腺苷酰-L-L-甲硫氨甲硫氨酸（酸（SAMSAM）、）、ATPATP等。這類酶有特異的識別位點等。這類酶有特異的識別位點

6、但沒有特異的切割位點，而且切割是隨機的，所但沒有特異的切割位點，而且切割是隨機的，所以在基因工程中應用不大。以在基因工程中應用不大。 型酶型酶 19701970年，年，H.O.SmithH.O.Smith和和K.W.WilcoxK.W.Wilcox在流感嗜在流感嗜血血RdRd株中分離出來的限制酶。株中分離出來的限制酶。 分子量較小（分子量較小（10105 5DaDa），只有一種多肽，），只有一種多肽，通常以同源二聚體的形式存在。反應只需通常以同源二聚體的形式存在。反應只需MgMg+的存在，并且具有以下兩個特點，使這的存在，并且具有以下兩個特點，使這類酶在基因工程研究中，得到廣泛的應用。類酶在基

7、因工程研究中，得到廣泛的應用。 識別位點是一個回文對稱結構，并且切割位識別位點是一個回文對稱結構，并且切割位點也在這一回文對稱結構上。點也在這一回文對稱結構上。 許多許多型酶切割后，可在上形型酶切割后，可在上形成粘性末端，有利于片段的重組。成粘性末端，有利于片段的重組。 型酶型酶 這類酶可識別特定堿基順序，并在這這類酶可識別特定堿基順序，并在這一順序的一順序的3 3端端2426bp2426bp處切開，處切開，所以它的切割位點也是沒有特異性的。所以它的切割位點也是沒有特異性的。 型酶的基本特性型酶的基本特性 1. 1. 在在DNADNA雙鏈的特異性識別序列部位，雙鏈的特異性識別序列部位，切割切割

8、DNADNA分子，產生鏈的斷裂。分子，產生鏈的斷裂。 2. 2. 兩個單鏈斷裂部位在兩個單鏈斷裂部位在DNADNA分子上的分分子上的分布，通常不是彼此直接相對的布，通常不是彼此直接相對的 3. 3. 因此，斷裂的結果形成的因此，斷裂的結果形成的DNADNA片斷，片斷，也往往具有互補的單鏈延伸末端。也往往具有互補的單鏈延伸末端。核酸內切酶作用后的斷裂方式核酸內切酶作用后的斷裂方式 粘性末端粘性末端 ：兩條鏈上的斷裂位置是交錯地、但又是圍繞：兩條鏈上的斷裂位置是交錯地、但又是圍繞著一個對稱結構中心，這樣形式的斷裂結果形成具有粘著一個對稱結構中心，這樣形式的斷裂結果形成具有粘性末端的性末端的DNAD

9、NA片斷。片斷。 具有具有3 3-OH-OH（ Pst1 Pst1 ），或），或5 5-OH(EcoR1)-OH(EcoR1)的粘性末端。的粘性末端。 Pst1 EcoR1 Pst1 EcoR1 5 5CTGCAG 3CTGCAG 3 5 5GAATTC 3GAATTC 3 3 3GACGTC 5GACGTC 5 3 3CTTAAG 5CTTAAG 5 平末端平末端 兩條鏈上的斷裂位置是處在一個對兩條鏈上的斷裂位置是處在一個對稱結構的中心這樣形式的斷裂是形成稱結構的中心這樣形式的斷裂是形成具有平末端的具有平末端的DNADNA片斷。不易重新環片斷。不易重新環化。化。 同裂酶（同裂酶（isosch

10、izomers) isoschizomers) 指來源不同但識別相同靶序列的核酸內切酶。指來源不同但識別相同靶序列的核酸內切酶。同裂酶進行同樣的切割，產生同樣的末端。但有同裂酶進行同樣的切割，產生同樣的末端。但有些同裂酶對甲基化位點的敏感性不同。些同裂酶對甲基化位點的敏感性不同。Example:Example:限制酶限制酶HpaHpa和和MspMsp是一對同裂酶是一對同裂酶 (CCGG) (CCGG) ，當靶序，當靶序列中一個列中一個5-5-甲基胞嘧啶時甲基胞嘧啶時HpaHpa不能進行切割，而不能進行切割，而MspMsp可以。可以。同尾酶（同尾酶（isocaudamerisocaudamer）

11、 指來源不同、識別靶序列不同但產生相同的指來源不同、識別靶序列不同但產生相同的粘性末端的核酸內切酶。利用同尾酶可使切割粘性末端的核酸內切酶。利用同尾酶可使切割位點的選擇余地更大。位點的選擇余地更大。雜種位點（雜種位點（hybrid sitehybrid site）：由一對同尾酶分別產）：由一對同尾酶分別產生的粘性末端共價結合形成的位點。生的粘性末端共價結合形成的位點。 一般不能被原來的任何一種同尾酶識別。一般不能被原來的任何一種同尾酶識別。 BamH BamH G GATC C G GATC C BclBcl T GATC A T GATC A C CTAG G A CTAG T C CTAG

12、 G A CTAG T 雜種位點（雜種位點（hybrid sitehybrid site） 由一對同尾酶分別由一對同尾酶分別 產生的粘性末端共價結合形成的位點。產生的粘性末端共價結合形成的位點。 一般不能被原來的任何一種同尾酶識別。一般不能被原來的任何一種同尾酶識別。 BamH BamH G GATC C G GATC C BclBcl T GATC A T GATC A C CTAG G A CTAG T C CTAG G A CTAG T 雜種位點雜種位點 ： GATC GATC C C （ BamH BamH ） CTAG T CTAG T（ BclBcl ） 限制片斷的末端連接作用限制

13、片斷的末端連接作用 分子間的連接：不同的分子間的連接：不同的DNADNA片斷通過互片斷通過互補的粘性末端之間的堿基配對而彼此連補的粘性末端之間的堿基配對而彼此連接起來。接起來。 分子內的連接：由同一片斷的兩個互補分子內的連接：由同一片斷的兩個互補末端之間的堿基配對而形成的環形分子。末端之間的堿基配對而形成的環形分子。限制酶的特性限制酶的特性a. a.限制酶識別靶序列同限制酶識別靶序列同DNADNA的來源無關；的來源無關；b.b.限制酶識別靶序列是唯一的（對某種限制限制酶識別靶序列是唯一的（對某種限制酶只具一個限制位點的質粒）。酶只具一個限制位點的質粒）。限制性核酸內切酶的命名原則：限制性核酸內

14、切酶的命名原則： 第一個字母：大寫，表示所來自的微生物的屬名的第第一個字母：大寫，表示所來自的微生物的屬名的第一個字母。一個字母。 第二、三字母：小寫，表示所來自的微生物種名的第第二、三字母：小寫，表示所來自的微生物種名的第一、二個字母。一、二個字母。 其它字母：大寫或小寫，表示所來自的微生物的菌株號。其它字母：大寫或小寫，表示所來自的微生物的菌株號。 羅馬數字：表示該菌株發現的限制酶的編號。羅馬數字：表示該菌株發現的限制酶的編號。 例：例：EcoR I: EcoR I: 來自于來自于Escheria coliEscheria coli RY13 RY13的第一個限制酶。的第一個限制酶。影響核

15、酸內切酶活性的因素：影響核酸內切酶活性的因素：1.DNA1.DNA的純度：的純度： DNase DNase的污染的污染(Mg+)(Mg+) a. a.增加核酸內切限制酶的用量，增加核酸內切限制酶的用量， b. b.擴大酶催化反應的體系（稀釋），擴大酶催化反應的體系（稀釋）， c. c.延長酶催化反應的保溫時間。延長酶催化反應的保溫時間。 加入亞精胺提高酶的消化作用，需適當加入亞精胺提高酶的消化作用，需適當的溫度。的溫度。2. DNA2. DNA的甲基化程度的甲基化程度3. 3. 酶切消化反應的溫度：酶切消化反應的溫度： 大多數酶的標準反應溫度大多數酶的標準反應溫度 37 37度。度。4. DN

16、A4. DNA的分子結構：的分子結構： 某些核酸內切限制酶切割超螺旋的質粒某些核酸內切限制酶切割超螺旋的質粒或病毒或病毒DNADNA所需要的酶量要比消化線性所需要的酶量要比消化線性的的DNADNA高高2929倍。倍。 核酸內切限制酶標準的緩沖液核酸內切限制酶標準的緩沖液1. 1. 氯化鎂、氯化鈉或氯化鉀：氯化鎂、氯化鈉或氯化鉀： 不正確的不正確的NaClNaCl或或Mg+Mg+濃度，會降低限制酶的活性，還濃度，會降低限制酶的活性，還可能導致識別序列的改變。可能導致識別序列的改變。 2. Tris-HCl 2. Tris-HCl ： 維持最適的維持最適的pHpH值（值（ pH pH 7.47.4

17、）。）。 3. - 3. -巰基乙醇或二硫蘇糖醇（巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTTDTT） ： 維持酶的穩定性維持酶的穩定性。 4. 4. 牛血清蛋白（牛血清蛋白（BSABSA） ：維持酶的穩定性維持酶的穩定性。核酸內切限制酶對核酸內切限制酶對DNADNA的消化作用的消化作用1. 1.核酸內切限制酶以同型二聚體形式與靶核酸內切限制酶以同型二聚體形式與靶序列發生作用。序列發生作用。2.2.核酸內切限制酶對核酸內切限制酶對DNADNA的局部消化的局部消化完全的酶切消化：識別序列完全的酶切消化：識別序列n n個堿基的核酸內切限制酶，個堿基的核酸內切限制酶，對對DNADNA的切割能達到每隔的切割能達到每隔

18、4 4n n切割一次的水平。切割一次的水平。局部酶切消化：不讓核酸內切限制酶對大量的局部酶切消化：不讓核酸內切限制酶對大量的DNADNA消化消化完全，就可以獲得平均分子量大小有所增加的限制片完全，就可以獲得平均分子量大小有所增加的限制片斷產物，進行不完全的限制酶消化反應。斷產物，進行不完全的限制酶消化反應。 a. a. 縮短酶切的消化反應的保溫時間縮短酶切的消化反應的保溫時間 b. b. 降低反應的溫度（降低反應的溫度（37-437-4）結束酶的活性。）結束酶的活性。3.3.核酸內切限制酶對真核生物基因組的消化核酸內切限制酶對真核生物基因組的消化作用作用小分子量的片斷小分子量的片斷-少少 （電

19、泳（電泳- -容易分離目的片斷）容易分離目的片斷） 大分子量的片斷大分子量的片斷-多（基因文庫多（基因文庫） 連接酶（連接酶（DNA ligaseDNA ligase）與分子的體外連接與分子的體外連接末端核苷酸轉移酶（末端核苷酸轉移酶（terminal transferaseterminal transferase） 該酶全稱為末端脫氧核苷酸轉移酶（該酶全稱為末端脫氧核苷酸轉移酶（terminal terminal deoxynucleotidyl transferasedeoxynucleotidyl transferase），它是從小牛胸腺中），它是從小牛胸腺中純化出來的一種小分子量的堿性

20、蛋白質，在二甲胂純化出來的一種小分子量的堿性蛋白質，在二甲胂酸緩沖液中，能催化酸緩沖液中，能催化5 5脫氧核苷三磷酸進行脫氧核苷三磷酸進行5 53 3方向的聚合作用，逐個地將脫氧核苷酸分子加到線方向的聚合作用，逐個地將脫氧核苷酸分子加到線性性DNADNA分子的分子的3 3-OH-OH末端。末端。 它不需要模板，可以用含有的它不需要模板，可以用含有的3 3-OH-OH片段片段為引物，在為引物，在3 3-OH-OH端加入核苷酸達幾百個。端加入核苷酸達幾百個。 它作它作用的底物可以是具有用的底物可以是具有3 3-OH-OH末端的單鏈末端的單鏈DNA,DNA,也可以也可以是具有是具有3 3-OH-OH

21、突出末端的雙鏈突出末端的雙鏈DNADNA 用途：用途： 1. 1. 催化催化-3232P P-3-3- -脫氧核苷酸標記脫氧核苷酸標記DNADNA片斷的片斷的3 3 末端。可用于測序的終止，一位不含游離的末端。可用于測序的終止，一位不含游離的3 3-OH-OH末末端。端。 2. 2. 催化非放射性的標記物摻入到催化非放射性的標記物摻入到DNADNA片斷的片斷的3 3- -末末端：端： 生物素等，摻入后可產生熒光染料或抗生物素蛋生物素等，摻入后可產生熒光染料或抗生物素蛋白結合物的接受位點。白結合物的接受位點。 3. 3. 用于在平頭上合成一段寡聚核苷酸，從用于在平頭上合成一段寡聚核苷酸，從而形成

22、粘性末端。而形成粘性末端。堿性磷酸酶：堿性磷酸酶： 來自于大腸桿菌（來自于大腸桿菌（bacterial alkaline bacterial alkaline phosphatase BAPphosphatase BAP）或小牛腸（）或小牛腸（calf intestinal calf intestinal alkaline phosphatase CIPalkaline phosphatase CIP），該酶用于脫去），該酶用于脫去DNADNA（RNARNA）5 5末端的磷酸根，使末端的磷酸根，使5 5-P-P成為成為5 5-OH-OH，該過程稱核酸分子的脫磷酸作用。當需要該過程稱核酸分子的脫

23、磷酸作用。當需要5 5端同端同位素標記或為了避免位素標記或為了避免DNADNA片段自身連接（或環化）片段自身連接（或環化）時可進行脫磷酸反應。時可進行脫磷酸反應。 S1S1核酸酶：核酸酶： 來自于稻谷曲霉，該酶只水解單鏈來自于稻谷曲霉，該酶只水解單鏈DNADNA，用于將粘性末端水解成平末端及，用于將粘性末端水解成平末端及cDNAcDNA發夾式結構的處理。發夾式結構的處理。反轉錄酶（反轉錄酶（reverse transcriptasereverse transcriptase） 這類酶來自于反轉錄病毒，它可以這類酶來自于反轉錄病毒，它可以RNARNA為模板，催化合成。目前常用的為模板，催化合成。

24、目前常用的有禽源（有禽源（AMVAMV）及鼠源（）及鼠源（M-MLVM-MLV）反轉）反轉錄酶兩種。錄酶兩種。 體外連接的三種方式：體外連接的三種方式： 1. 1. 用連接酶連接具有互補粘性末端的用連接酶連接具有互補粘性末端的DNADNA片斷片斷 2. 2. 用用連接酶將平末端的連接酶將平末端的DNADNA片斷連接；片斷連接；或是用末端脫氧核苷酸轉移酶給具平末端的或是用末端脫氧核苷酸轉移酶給具平末端的DNADNA片片斷加上斷加上poly(A)- poly(T)poly(A)- poly(T)尾巴之后，再用連接尾巴之后，再用連接酶連接。酶連接。 3. 3. 先在先在DNADNA片斷末端加上化學合

25、成的銜接物或接頭，片斷末端加上化學合成的銜接物或接頭，形成粘性末端后，再用連接酶連接形成粘性末端后，再用連接酶連接 連接酶：連接酶： 能夠將能夠將DNADNA鏈上彼此相鄰的鏈上彼此相鄰的3 3- -羥基羥基（ OH OH ）和）和5 5- -磷酸基團（磷酸基團（-P-P），在），在NAD+NAD+或或ATPATP供能的作用下，形成磷酸二供能的作用下，形成磷酸二酯鍵。酯鍵。 只能連接缺口（只能連接缺口（nicknick），不能連接裂口），不能連接裂口（gapgap）。而且被連接的）。而且被連接的DNADNA鏈必須是雙鏈必須是雙螺旋螺旋DNADNA分子的一部分。分子的一部分。 酶AMP（腺苷磷酸）

26、 磷酸酰胺鍵DNADNA的腺苷酸復合物的腺苷酸復合物3 3-OH-OH對對P P原子作親核攻擊原子作親核攻擊 形成磷酸二酯鍵形成磷酸二酯鍵連接酶的作用機理連接酶的作用機理此反應是由焦磷酸此反應是由焦磷酸 (ppi) (ppi)的水解作用激發的的水解作用激發的需要花費兩個高能磷酸鍵需要花費兩個高能磷酸鍵（賴氨酸殘基） 連接酶的來源連接酶的來源 1. DNA 1. DNA連接酶：連接酶： 大腸桿菌染色體編碼的大腸桿菌染色體編碼的 2. T 2. T4 4 DNA DNA連接酶：大腸桿菌連接酶：大腸桿菌T T4 4噬菌體噬菌體DNADNA編碼的編碼的 DNA DNA連接酶連接酶 NAD+NAD+ T

27、 T4 4 DNA DNA連接酶連接酶 ATPATP連接酶（連接酶（DNA ligaseDNA ligase） 該酶常從該酶常從噬菌體的受感細胞中提取，是由噬菌體的受感細胞中提取，是由噬菌體基因組所編碼的，所以基因工程中常用的連接酶噬菌體基因組所編碼的，所以基因工程中常用的連接酶是是連接酶。它可催化中磷酸二脂鍵的形成，連接酶。它可催化中磷酸二脂鍵的形成，從而使兩個片段以共價鍵的形式結合起來。從而使兩個片段以共價鍵的形式結合起來。 DNA DNA連接酶對具有粘性末端的連接酶對具有粘性末端的DNADNA分子經退火后能分子經退火后能很好地連接，對平末端的很好地連接，對平末端的DNADNA分子也可以進

28、行連接，但分子也可以進行連接，但連接效率較低，必須加大酶的用量連接效率較低，必須加大酶的用量。 影響連接酶作用的因素影響連接酶作用的因素 1. 1. 反應溫度：反應溫度： 連接缺口的溫度：連接缺口的溫度：3737度度 連接粘性末端的最佳溫度：連接粘性末端的最佳溫度： 4 41515度度 2. 2.連接酶的用量：連接酶的用量： 平末端平末端DNADNA分子的連接反應中，最適分子的連接反應中，最適1 12 2個單位。個單位。 粘性末端粘性末端DNADNA片斷之間的連接，酶濃度片斷之間的連接，酶濃度0.10.1個單位。個單位。 ATP ATP的用量的用量10mol1mmol/L10mol1mmol/

29、L之間之間 3. 3. 提高外源片斷與載體的濃度的比值，（提高外源片斷與載體的濃度的比值，（10102020倍）倍） 粘性末端粘性末端DANDAN片斷的連接片斷的連接 由于具粘性末端的載體易發生自連。由于具粘性末端的載體易發生自連。 對載體的對載體的5 5末端進行處理，用細菌的或末端進行處理，用細菌的或小牛腸的堿性磷酸酶移去磷酸基團，使載體小牛腸的堿性磷酸酶移去磷酸基團，使載體不能自連。不能自連。 而外源片斷的而外源片斷的5 5-P-P能與載體的能與載體的3 3-OH-OH進行共價鍵的連接。這樣形成的雜種分子中，進行共價鍵的連接。這樣形成的雜種分子中，每一個連接位點中載體每一個連接位點中載體D

30、NADNA只有一條鏈與外只有一條鏈與外源片斷相連，失去源片斷相連，失去5 5-P-P的鏈不能進行連接，的鏈不能進行連接，形成形成3 3- OH - OH 和和5 5- OH - OH 的缺口。的缺口。 平末端平末端DNADNA片斷的連接片斷的連接 1. T4DNA 1. T4DNA連接酶連接酶 2. 2. 用末端核苷酸轉移酶給平末端加上同聚用末端核苷酸轉移酶給平末端加上同聚物尾巴之后，再用物尾巴之后，再用DNADNA連接酶連接。連接酶連接。 常用的連接方法：同聚物加尾法、銜接常用的連接方法：同聚物加尾法、銜接物法和接頭連接法物法和接頭連接法 同聚物加尾法同聚物加尾法用用5 5 末端特異的核酸外

31、切酶處理末端特異的核酸外切酶處理DNADNA片斷片斷在在A A和和B B分別中加入分別中加入dATPdATP和和dTTPdTTP同聚物尾巴同聚物尾巴10401040個堿基個堿基 同聚物加尾法或同聚物加尾法或T4T4連接酶的平連接酶的平末端連接法，無法用原來的限制末端連接法，無法用原來的限制酶作特異性的切割，獲得插入片酶作特異性的切割，獲得插入片斷進行進一步的研究。斷進行進一步的研究。 銜接物連接法銜接物連接法 平末端的另一種處理方式是利用銜接物（平末端的另一種處理方式是利用銜接物（linkerlinker）進）進行處理，人工加上粘性末端。銜接物是一種人工合成的行處理，人工加上粘性末端。銜接物是

32、一種人工合成的小分子小分子DNADNA，約，約10201020個核苷酸，其結構特征是含有多個核苷酸，其結構特征是含有多種限制性核酸內切酶的酶切位點的回文結構。如：種限制性核酸內切酶的酶切位點的回文結構。如： CCGGATCCGG CCGGATCCGG GGCCTAGGCC GGCCTAGGCC 將銜接物分子與平末端將銜接物分子與平末端DNADNA分子連接，再用限制性分子連接，再用限制性核酸內切酶酶切，便可產生粘性末端。核酸內切酶酶切，便可產生粘性末端。 這種方法的優點是克隆位點具有限制酶的酶切位點這種方法的優點是克隆位點具有限制酶的酶切位點。 Hpa II Hpa IIBamH I 或Sau3

33、A 銜接物（銜接物（linkerlinker）是指用化學方法合成的）是指用化學方法合成的一段由一段由10101212個核苷酸組成、具有一個個核苷酸組成、具有一個或數個限制酶識別位點的平末端的雙鏈或數個限制酶識別位點的平末端的雙鏈寡核苷酸短片段。寡核苷酸短片段。 雙銜接物：可以實現定向克隆，防止發雙銜接物：可以實現定向克隆，防止發生自連，同時對克隆片斷的再刪除也比生自連，同時對克隆片斷的再刪除也比較方便。較方便。銜接物連接法銜接物連接法雙銜接物連接法雙銜接物連接法的基本程序的基本程序cDNA鏈的合成鏈的合成通過通過DNA聚合酶合成第二鏈聚合酶合成第二鏈加入加入Sal I銜接物銜接物S I核酸酶作

34、用后的末端單鏈突出序列，核酸酶作用后的末端單鏈突出序列，由由Klenow補齊，加入第二銜接物補齊，加入第二銜接物Ecol I 在用在用DNADNA銜接物連接法時，如果待克隆銜接物連接法時，如果待克隆DNADNA的片斷或基因內部，含有與所加銜接物的片斷或基因內部，含有與所加銜接物相同的限制位點，在酶切消化銜接物產生粘相同的限制位點，在酶切消化銜接物產生粘性末端的同時，也會把克隆的基因切斷。性末端的同時，也會把克隆的基因切斷。DNADNA接頭（接頭（adapteradapter）連接法：）連接法： 1978 1978年，美國康奈爾大學生化分子生物學系年，美國康奈爾大學生化分子生物學系的教授吳瑞的教

35、授吳瑞 博士發明的。博士發明的。 它是一類人工合成的一頭具有某種限制酶它是一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核粘性末端另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片斷。苷酸短片斷。 粘性末端容易通過堿基配對形成如同銜粘性末端容易通過堿基配對形成如同銜接物一樣的二聚體分子。對接物一樣的二聚體分子。對DNADNA接頭分子末接頭分子末端，進行必要的修飾。移走粘性末端端，進行必要的修飾。移走粘性末端5 5-P-P，暴露出暴露出5 5-OH-OH，不能產生穩定的二聚體分子。，不能產生穩定的二聚體分子。DNA接頭連接法接頭連接法 熱穩定的連接熱穩定的連接 從嗜熱高溫方線菌的菌株中

36、分離出來的。從嗜熱高溫方線菌的菌株中分離出來的。能在高溫下催化兩條寡核苷酸探針發生連接能在高溫下催化兩條寡核苷酸探針發生連接用的一種核酸酶。用的一種核酸酶。1. 1.寡核苷酸連接測定寡核苷酸連接測定2.2. （oligonucletide ligation assay,OLAoligonucletide ligation assay,OLA）3.3. 用兩個寡核苷酸探針，同已知序列的靶用兩個寡核苷酸探針，同已知序列的靶DNADNA雜交，探雜交，探針在靶針在靶 DNA DNA分子的位置是相鄰的。分子的位置是相鄰的。2.2.連接酶鏈式反應（連接酶鏈式反應（lingase chain reactio

37、n,LCRlingase chain reaction,LCR）；）； 也叫連接擴增反應（也叫連接擴增反應（ lingase amplication reaction lingase amplication reaction）3.3. 用寡核苷酸探針通過用寡核苷酸探針通過DNADNA連接酶的作用擴增已連接酶的作用擴增已知序列的靶知序列的靶DNADNA的方法。需要的方法。需要4 4種引物，種引物， 寡核苷酸連接測定寡核苷酸連接測定 AGTGACCT TCACTGGA A G T G A C C T A G T T A C C T T C A C T G G A T C A C T G G A A

38、 G T G A C C T A C C T A G T G A C C T A C C T 待擴增的待擴增的DNA片斷片斷PPBBDD地高辛配基地高辛配基生物素生物素磷酸磷酸BBBBDDPP陽性信號陽性信號無信號無信號酶抗生素蛋白酶抗生素蛋白由于堿基錯配不能形成磷酸二酯鍵由于堿基錯配不能形成磷酸二酯鍵檢測單堿基的取代、插入、及缺失而引起的多態性檢測單堿基的取代、插入、及缺失而引起的多態性LCR：ligase chain reaction，連接酶，連接酶鏈式反應。鏈式反應。樣品樣品DNA、探針、探針(4) 94度變性度變性DNADNA聚合酶聚合酶 常用的常用的DNADNA聚合酶：聚合酶： 大腸

39、桿菌大腸桿菌DNADNA聚合酶、聚合酶、 大腸桿菌大腸桿菌DNADNA聚合酶的聚合酶的KlenowKlenow大片斷酶、大片斷酶、 T T4 4DNADNA聚合酶、聚合酶、 T T7 7DNADNA聚合酶、聚合酶、 反轉錄酶等。反轉錄酶等。共同點：共同點： 把脫氧核糖核苷酸連續的加到雙鏈把脫氧核糖核苷酸連續的加到雙鏈DNADNA分子引物鏈的分子引物鏈的3 3-OH-OH末端，催化核末端，催化核苷酸的聚合作用，而不發生從引物模板苷酸的聚合作用，而不發生從引物模板上解離的情況。上解離的情況。 大腸桿菌大腸桿菌DNADNA聚合酶聚合酶 DNADNA聚合酶（聚合酶（PolPol）、）、 DNA DNA

40、聚合酶聚合酶（Pol Pol ）、）、 DNA DNA聚合酶聚合酶 （Pol Pol ）、）、 PolPol和和Pol Pol 的主要功能參與的主要功能參與DNADNA的合成；的合成； Pol Pol 的功能同的功能同DNADNA的復制有關；的復制有關； Pol Pol同同DNADNA分子克隆的關系最為密切。分子克隆的關系最為密切。大腸桿菌大腸桿菌DNADNA聚合酶：聚合酶： 19571957年，美國的生物學家年，美國的生物學家A.KornbergA.Kornberg首首次證實，在大腸桿菌提取物中存在一種次證實，在大腸桿菌提取物中存在一種DNADNA聚合酶，即現在所說的聚合酶，即現在所說的DN

41、ADNA聚合酶。由聚合酶。由polpol基因編碼的一種單鏈多肽蛋白質，分子基因編碼的一種單鏈多肽蛋白質，分子量為量為1091091000dal1000dal。 DNADNA聚合酶，可以被蛋白酶切割成兩聚合酶，可以被蛋白酶切割成兩個片斷，一個具有全部的個片斷，一個具有全部的3 3 5 5的外切酶的外切酶活性和活性和5 5 3 3 的聚合酶活性，另一個具有的聚合酶活性，另一個具有全部全部 5 5 3 3的外切酶活性。的外切酶活性。 DNADNA聚合酶的酶活性：聚合酶的酶活性： 1. 51. 5 3 3的聚合酶活性；的聚合酶活性； 2. 5 2. 5 3 3的外切酶活性；的外切酶活性； 3. 3 3

42、. 3 5 5的外切酶活性（較低）。的外切酶活性（較低）。 DNADNA聚合酶發揮作用的條件：聚合酶發揮作用的條件： 1 1、底物：、底物： 四種脫氧核苷四種脫氧核苷5 5- -三磷酸三磷酸（dNTPdNTP）；）； 2 2、MgMg離子離子； 3 3、帶有、帶有3 3-OH-OH游離基團的引物鏈；游離基團的引物鏈； 4 4、DNADNA模板：單鏈，雙鏈（模板：單鏈，雙鏈（糖糖- -磷酸主鍵上有一個磷酸主鍵上有一個 或多個斷裂或多個斷裂）。）。 DNADNA聚合酶聚合酶5 5 3 3的核酸外切酶活性的核酸外切酶活性 1 1、 5 5 3 3的外切酶活性，所切割的的外切酶活性，所切割的DNADN

43、A鏈必須是位于雙螺旋的區段上；鏈必須是位于雙螺旋的區段上； 2 2、切割部位可以是末端磷酸二酯鍵，也可、切割部位可以是末端磷酸二酯鍵，也可以是在距以是在距5 5末端數個核苷酸遠的一個鍵上發末端數個核苷酸遠的一個鍵上發生；生； 3 3、DNADNA的合成可以增強的合成可以增強5 5 3 3的核酸的核酸外切酶活性；外切酶活性； 4 4、 5 5 3 3核酸外切酶的活性位點同聚合作核酸外切酶的活性位點同聚合作用的活性位點以及用的活性位點以及3 3 5 5的水解作用位點是分的水解作用位點是分開的。開的。 DNADNA聚合酶的聚合酶的3 3 5 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 能催化能催化DNADNA

44、鏈發生水解作用，從鏈發生水解作用，從DNADNA鏈鏈3 3-OH-OH末端開始向末端開始向5 5的方向水解的方向水解DNADNA，并釋，并釋放出單核苷酸分子。放出單核苷酸分子。 對酶活的影響：對酶活的影響： 反應物中缺乏反應物中缺乏dNTPsdNTPs時，大腸桿菌時，大腸桿菌DNADNA聚聚合酶的合酶的3 3 5 5核酸外切酶活性，將會發揮作核酸外切酶活性，將會發揮作用。但對于底物是雙鏈的用。但對于底物是雙鏈的DNADNA，在具有，在具有dNTPsdNTPs時，這種降解活性將會被時，這種降解活性將會被5 5 3 3 的聚合酶活的聚合酶活性所抑制性所抑制。 DNADNA聚合酶在分子克隆中的主要用

45、途：聚合酶在分子克隆中的主要用途： 通過通過DNADNA缺口轉移，制備供核酸分子雜交用的帶放射缺口轉移，制備供核酸分子雜交用的帶放射性標記的性標記的DNADNA探針。探針。 DNADNA缺口轉移（缺口轉移（nick translationnick translation） 在在DNADNA分子的單鏈缺口上，分子的單鏈缺口上，DNADNA聚合酶的聚合酶的5 5 3 3核酸核酸外切酶活性和聚合作用可以同時發生。當外切酶活性從缺口的外切酶活性和聚合作用可以同時發生。當外切酶活性從缺口的5 5一側移去一個一側移去一個5 5核苷酸之后，聚合酶作用就會在缺口的核苷酸之后，聚合酶作用就會在缺口的3 3一側補

46、上一個新的核苷酸，但一側補上一個新的核苷酸，但polpol不能在不能在3 3-OH-OH和和5 5-P-P之之間形成一個鍵，隨著間形成一個鍵，隨著5 5一側的核苷酸不斷移去，一側的核苷酸不斷移去， 3 3一側的一側的核苷酸又按序列增補，缺口便沿著核苷酸又按序列增補，缺口便沿著DNADNA分子合成的方向移動。分子合成的方向移動。 DNADNA雜交探針的制備雜交探針的制備 典型的反應體系是。在典型的反應體系是。在25l25l總體積中總體積中含有含有1 g1 g純化的特定純化的特定DNADNA片斷，并加入片斷，并加入適量的適量的DnaseDnase、PolPol、-32p-dNTPs-32p-dNT

47、Ps和未標記的和未標記的dNTPsdNTPs。 DnaseDnase：造成：造成DNADNA分子的斷裂或缺口；分子的斷裂或缺口； PolPol ： 進行缺口轉移，使反應混合物進行缺口轉移，使反應混合物中的中的32p32p標記的核苷酸取代原有的未標記標記的核苷酸取代原有的未標記的核苷酸，最終從頭到尾都被標記。的核苷酸，最終從頭到尾都被標記。 dNTP dNTP 對對PolPol酶活性的影響酶活性的影響 在低濃度在低濃度dNTPsdNTPs的條件下，的條件下， Pol Pol具具有良好的活性有良好的活性，提高提高dNTPsdNTPs濃度時，濃度時， Pol Pol則能夠更有效的合成則能夠更有效的合

48、成DNADNA。 低濃度的低濃度的 3232p-dNTPsp-dNTPs（2 mol/L2 mol/L）和高濃度的和高濃度的dNTPsdNTPs（ 20 mol/L 20 mol/L ） 一般希望有一般希望有30%30%左右的左右的3232p-dNTPsp-dNTPs參入參入DNADNA鏈（鏈（ Dnase Dnase數量）。數量）。 KlenowKlenow片斷與片斷與DNADNA末端標記末端標記 1 1、 Klenow Klenow片斷：是由大腸桿菌片斷：是由大腸桿菌DNADNA聚合聚合酶經枯草桿菌蛋白酶的處理之后，產生出酶經枯草桿菌蛋白酶的處理之后，產生出來的分子量為來的分子量為7676

49、1000dal1000dal的大片斷分子。的大片斷分子。仍具有仍具有5 5 3 3的聚合酶活性和的聚合酶活性和3 3 5 5 的外切酶活性，失去了全酶的的外切酶活性，失去了全酶的5 5 3 3 外外切酶活性。切酶活性。 KlenowKlenow片斷的主要用途：片斷的主要用途： 1 1、修補經限制酶消化的、修補經限制酶消化的DNADNA所形成的所形成的3 3隱蔽末端；隱蔽末端； 2 2、標記、標記DNADNA片斷的末端；片斷的末端； 3 3、cDNAcDNA克隆的第二鏈克隆的第二鏈cDNAcDNA的合成；的合成； 4 4、DNADNA序列的測定。序列的測定。 DNADNA片斷末端標記：片斷末端標

50、記： 具有具有 3 3隱蔽末端的帶標記得的隱蔽末端的帶標記得的DNADNA片斷片斷 5 5GATCT3GATCT3 3 3 A5 A5在反應物中加入在反應物中加入KlenowKlenow聚合酶聚合酶-32p-dGTP,-32p-dGTP,一道溫育后生成：一道溫育后生成： 5 5GATCT3GATCT3 3 3 32p32p GA5 GA5 或是同時加入或是同時加入-32p-dATP-32p-dATP dGTP dGTP5 5GATCT3GATCT33 332p32p AGA5 AGA5 DNADNA片斷末端標記可以作為用凝片斷末端標記可以作為用凝膠電泳法測定分子大小的標記樣品。因膠電泳法測定分

51、子大小的標記樣品。因為被標記的為被標記的DNADNA片斷是同它們的摩爾濃片斷是同它們的摩爾濃度成比例，而與他們的分子大小無關。度成比例，而與他們的分子大小無關。所以在限制酶消化過程產生的大小所以在限制酶消化過程產生的大小DNADNA片斷都得到了同等程度的標記。片斷都得到了同等程度的標記。 不能夠有效的標記帶有不能夠有效的標記帶有5 5突出末端突出末端的的DNADNA分子。分子。 T T4 4DNADNA聚合酶和聚合酶和 取代合成法標記取代合成法標記DNADNA片斷片斷 1 1、從、從T4T4噬菌體感染的大腸桿菌培養物中純化出的一種特噬菌體感染的大腸桿菌培養物中純化出的一種特殊的殊的DNADNA聚合酶。具有聚合酶。具有5 5 3 3的聚合酶活性和的聚合酶活性和3 3 5 5 的外切酶活性。