1、Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 實時熒光定量實時熒光定量PCRPCR原理及應用原理及應用上海吉泰生物科技有限公司上海吉泰生物科技有限公司Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 熒光定量PCR原理及應用 Stratagene Mx3000P熒光定量PCR儀Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gww

2、w.G Southern 雜交雜交 Northern 雜交雜交 原位雜交原位雜交 傳統(tǒng)傳統(tǒng) RT-PCR 半定量半定量 PCR存在的問題存在的問題 3靈敏度3準確性3特異性3時間Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 定義定義利用熒光信號對利用熒光信號對PCR反應的過程進行實時監(jiān)控反應的過程進行實時監(jiān)控 目的目的對起始模板進行定量對起始模板進行定量 優(yōu)點優(yōu)點 靈敏靈敏, 重復性重復性, 動態(tài)范圍寬動態(tài)范圍寬, 高通量高通量l原理原理 C(t)值與起始模板濃度的對數(shù)成反比值與起始模板濃度的對數(shù)成

3、反比Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G C(t)Threshold（域值）域值）Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G CtEndpoints96 replicates of B7 gene molecular beaconGenetimes Tec

4、hnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 1221利用電泳定量利用電泳定量11,500 counts / 5200 counts = 2.2 fold differenceGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G Ct 18 and Ct 22, 2(4 Ct shift) = 16 fold differenceGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科

5、技有限公司www.Gwww.G Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 標標 準準 曲曲 線線 未未 知知 樣樣 品品 的的 C(t) 值值 定量定量Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G SYBR Green ITM TaqMan / TaqMan-MGB Molecular Beacons MGB EclipseTM Probes Lux primers ScorpionsTM Ampli

6、fluor Q-Zyme Others.dsDNA DetectionTarget-specific DetectionGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G ssDNA = free dye(weak fluorophore)dsDNA =Binds minor groove(intense fluorophore)Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G SYBR Green I Detec

7、tionGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 未結(jié)合的探針未結(jié)合的探針探針、引物與目的片段結(jié)合，探針、引物與目的片段結(jié)合，F(xiàn)RET光發(fā)射或者以熱量形式散失光發(fā)射或者以熱量形式散失Donor dye (Reporter)Acceptor dye (Quencher)LightEnergy transferTaqTaq 水解探針，報告熒光素與淬滅熒光素分離水解探針，報告熒光素與淬滅熒光素分離TaqLight EmissionLightGenetimes TechnologyGenetimes T

8、echnology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G HCV (FAM) RNA virus65bp ampliconHIV-1 (HEX) RNA Virus74bp ampliconHBV (CY5) DNA virus 81bp ampliconTaqman 三通道實驗三通道實驗Daniel Candotti - Cambridge, UKGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 特異核酸（基因）定性、定量特異核酸（基因）定性、定量 RNA (cDNA)RNA (

9、cDNA) 基因表達差異分析基因表達差異分析 基因芯片結(jié)果驗證基因芯片結(jié)果驗證 DNADNA 病原體定性與定量病原體定性與定量 GMO (GMO (遺傳改良組織遺傳改良組織) )檢測檢測 序列特異性序列特異性 等位基因分型等位基因分型, , SNP SNP 檢測檢測Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 絕對定量（特異基因的拷貝數(shù)病原體的多少）絕對定量（特異基因的拷貝數(shù)病原體的多少）標準品（如質(zhì)粒）：梯度稀釋標準品（如質(zhì)粒）：梯度稀釋未知樣品未知樣品陰性對照（陰性對照（NTCNTC）Genet

10、imes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 應用之二：基因表達差異分析應用之二：基因表達差異分析相對定量：基因表達量上升或者表達被抑止的相對定量：基因表達量上升或者表達被抑止的倍數(shù)倍數(shù)兩種樣品：兩種樣品：CalibratorCa

11、librator（對照，如正常組織）對照，如正常組織） 與與SampleSample（待測樣品）待測樣品）兩個基因：目的基因與看家基因兩個基因：目的基因與看家基因Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G Normalizer看家基因看家基因應用之二：基因表達差異分析應用之二：基因表達差異分析CalibratorSampleGene of Interest目的基因目的基因CtCtCtCt Ct1 Ct2Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限

12、公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 應用之二：基因表達差異分析應用之二：基因表達差異分析基因表達差異基因表達差異2 /2 Ct1 Ct2 Ct1 - Ct2Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 應用之二：基因表達差異分析應用之二：基因表達差異分析RNA抽提抽提RT定量定量PCRcDNA產(chǎn)物產(chǎn)物系列稀釋系列稀釋兩個基因的擴增效率兩個基因的擴增效率Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G

13、 應用之二：基因表達差異分析應用之二：基因表達差異分析Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 4 fold down3 fold up應用之二：基因表達差異分析應用之二：基因表達差異分析Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 應用之三：應用之三：SNPSNP分析分析Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.G

14、www.G 應用之三：應用之三：SNPSNP分析分析FAMFAMTETTETFAMFAMTETTETGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 應用之三：應用之三：SNPSNP分析分析Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 目的：檢測食品等中轉(zhuǎn)基因成分的含量目的：檢測食品等中轉(zhuǎn)基因成分的含量大量的作物被遺傳改良來獲得一些性狀，大量的作物被遺傳改良來獲得一些性狀，如：抗除草劑，抗蟲，抗病等如：抗除草

15、劑，抗蟲，抗病等Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 廣泛使用的除草劑的作用成分是草甘膦。廣泛使用的除草劑的作用成分是草甘膦。草甘膦是草甘膦是EPSPSEPSPS（5-5-烯醇丙酮莽草酸烯醇丙酮莽草酸-3-3-磷酸合成酶磷酸合成酶 ）的競爭抑制物。在草甘膦存在的條件下，）的競爭抑制物。在草甘膦存在的條件下，EPSPSEPSPS的活性被抑制。的活性被抑制。植物被轉(zhuǎn)化了一種耐受草甘膦的植物被轉(zhuǎn)化了一種耐受草甘膦的EPSPSEPSPS基因，獲得基因，獲得抗性。抗性。Genetimes Techno

16、logyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 檢測策略抗性EPSPS基因的量 轉(zhuǎn)基因大豆的量 Lectin基因的量 食品中大豆總量EPSPSLectin CtGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 激發(fā)光源激發(fā)光源熱循環(huán)加熱、制冷熱循環(huán)加熱、制冷 樣品樣品檢測設備檢測設備Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 光源的光譜范圍寬廣，

17、能激發(fā)不同的熒光染料 能分開不同熒光素的激發(fā)光與發(fā)射光波長 能檢測的靈敏度與動態(tài)檢測范圍 準確的溫度控制和良好的孔間溫度均一性.Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 熒光定量PCR原理及應用 Stratagene Mx3000P熒光定量PCR儀Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G Stratagenes New Mx3000P!High Performance Personal Price

18、Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G Stratagene 公司成立于公司成立于1984年年,致力于致力于發(fā)展生命科學領域的創(chuàng)新產(chǎn)品與科技發(fā)展生命科學領域的創(chuàng)新產(chǎn)品與科技. 總部位于美國總部位于美國 La Jolla, California .在歐在歐洲與日本設有分公司洲與日本設有分公司.Stratagene 公司簡介公司簡介Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 熱蓋熱循環(huán)系統(tǒng)石英鹵鎢燈發(fā)

19、射光濾鏡輪激發(fā)光濾鏡輪光纖掃描臂Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 96 孔樣品槽孔樣品槽 半導體加熱制冷半導體加熱制冷 溫度均一性溫度均一性: +/- 0.25C 升降溫速率升降溫速率: up to 2.5C/secGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 半導體加熱制冷半導體加熱制冷 resistive and convective heat exchange 獨特的溫度補償條，整板溫度

20、均獨特的溫度補償條，整板溫度均一性一性 +/- 0.25C 熱蓋熱蓋 反應體積反應體積10-100ulGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G PMT96 well plate石英鹵鎢燈激發(fā)光濾鏡輪發(fā)射光濾鏡輪掃描式檢測同軸光纖Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 石英鹵鎢燈(350-750nm) 2 個濾鏡輪 可選擇的濾鏡: Filter sets: FAM/SYBR, HEX/JOE/VI

21、C, ROX/Texas Red, Cy5, Alexa350, TET, NED/TAMRA, Cy3 1 PMT（光電倍增管）檢測器 350-700nm 發(fā)射光檢測范圍 掃描式檢測設計Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 整板掃描3.5s 濾鏡輪旋轉(zhuǎn)進行多通道掃描Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G Lasers: 光強高, 波長范圍窄；石英鹵鎢燈石英鹵鎢燈: 中等光強, 波長范圍寬；

22、LED: 光強低, 波長受限制。Halogen LampLaserLEDGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 發(fā)射光濾鏡發(fā)射光濾鏡Ex. Filter350 nm750 nm10 nm InterferenceMx3000PGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.G

23、www.G Mx3000P 發(fā)射光濾鏡輪發(fā)射光濾鏡輪Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G PMT光電倍增管光電倍增管冷冷CCDCCDPhotodiodes光電二極管光電二極管Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G PMT (光電倍增管光電倍增管)冷 CCDCCDPhotodiodes光電二極管Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司

24、吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G hvhve-e-PMTCCDGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 無邊緣效應邊緣效應CCDMirrorGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 19.019.520.020.521.021.522.0113253749617385Well numberCtSimultaneous Illumination/Detection20.521.021.522

25、.022.523.023.5113253749617385Well numberCtCt vs. Well number(across plate groupings)Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 96 well uniformity run. SYBR Green I detection96 wellsMean Ct = 18.1St.Dev. = 0.05C.V . = 0.3%Ct Range = 0.26 cyclesGenetimes TechnologyGenetimes

26、 Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 2-fold serial dilution (20,000 to 1.2 copies hgDNA. -Actin Mol. Beacon)Std. CurveR2 = 0.996Slope = -3.183Amplification Efficiency =106.1% Mx3000PMx3000P的分辨率與靈敏度檢測圖。的分辨率與靈敏度檢測圖。Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 10 x dynami

27、c range, T7 hydrolysis probe, 8 replicates each concentration10 x dynamic range standard curve, Ct range 6-39, Rsq=0.999, Efficiency=98.6% Mx3000PMx3000P檢測動態(tài)范圍檢測圖（高達十個數(shù)量級）。檢測動態(tài)范圍檢測圖（高達十個數(shù)量級）。Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G Mx3000P Multiplex - 4 Color ResultFAMG

28、enetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G FAMHEXMx3000P Multiplex - 4 Color ResultGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G FAMHEXROXMx3000P 4通道實驗結(jié)果通道實驗結(jié)果Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G FAMHEXROXCy5Mx3000

29、P Multiplex - 4 Color ResultGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G Mx3000P 4通道標準曲線通道標準曲線 Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 最新的工程聚合酶最新的工程聚合酶 Archaeal (non-Taq) DNA polymerase 同樣具有優(yōu)越的同樣具有優(yōu)越的: 靈敏度 特異性 可重復性Genetimes TechnologyGenetimes

30、 Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 易學易用易學易用 各種數(shù)據(jù)分析方式：自動分析或者各種數(shù)據(jù)分析方式：自動分析或者手動分析手動分析 支持熒光定量支持熒光定量PCRPCR的多種應用模式的多種應用模式Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G Genetimes TechnologyGenetimes Techno

31、logy吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G PCR板的設定板的設定Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 運行時的狀態(tài)運行時的狀態(tài)Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G Genetimes TechnologyGenetimes

32、 Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 軟件自行優(yōu)化的數(shù)據(jù)分析軟件自行優(yōu)化的數(shù)據(jù)分析Adaptive baseline correctionAmplification-based thresholdGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 4 fold down3 fold upGenetimes Technol

33、ogyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G User defined genotypes, color coded populations, and automatic calling on text reportGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G “只讀板只讀板”實驗結(jié)果實驗結(jié)果Genetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G Tex

34、t Report or raw data can be exported to Excel or a text fileCustomize reportGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 多種格式輸出結(jié)果多種格式輸出結(jié)果Text ReportExcel spreadsheetPowerPoint presentationAny screen shotGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G

35、Master mixes and reagent kits for any fluorescent chemistry Compatible with sequence-specific probes SYBR Green kitsGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G DNA AmplificationBrilliant SYBR Green QPCR Master Mix Brilliant SYBR Green QPCR Core Reagent KitRNA Amplification

36、Brilliant SYBR Green QPCR Master Mix, 1-StepGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G DNA AmplificationBrilliant QPCR Core Reagent Kit Brilliant Plus Core Reagent KitBrilliant QPCR Master Mix2-step RT-PCRRNA AmplificationBrilliant QRT-PCR Core Reagent Kit, 1 - StepBrilli

37、ant QRT-PCR Master Mix Kit, 1 - StepBrilliant QRT-PCR Plus Core Reagent Kit, 1 - Step1-step RT-PCRBrilliant QRT-PCR Core Reagent Kit, 2 - StepBrilliant QRT-PCR Plus Core Reagent Kit, 2 - StepGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 2-fold discrimination using the Brilli

38、ant SYBR QPCR master mix on the Mx3000P instrumentCt variation 0.5Cts10,000 copies5,000 copiesBrilliant QPCR KitsTarget = Beta actin / Template = Human genomic DNA36 wells of 10,000 copies with a Ct variation of 0.5 Cts and 36 wells of 5,000 copies with Ct variation of 0.5CtsGenetimes TechnologyGenetimes Technology吉泰生物科技有限公司吉泰生物科技有限公司www.Gwww.G 設計設計SYBR Green 引物引物, TaqMan 探針探針, FRET 探針和探針和 Molecular beacons（分子信