1、熒光顯微鏡檢測方法(以96孔板，A549貼壁細胞為例)細胞培養(yǎng) 取對數(shù)生長期細胞，以每孔4×1031×105細胞接種于96孔板中，培養(yǎng)至正常生長階段。藥物處理 (可選)客戶可以根據(jù)實驗需要進行各種藥物處理。EdU標記 1.1 用細胞培養(yǎng)基按1000：1的比例稀釋EdU溶液 (試劑A)，制備適量50M EdU培養(yǎng)基； 注：1)EdU濃度與孵育時間相關(guān)，短時間孵育(<2h)宜采用高濃度(1050 M)，長時間孵育(>24h)宜采用低濃度(110M)； 2)如果需配置10M EdU培養(yǎng)基，需調(diào)整為5000：1稀釋比例； 3)配置好的培養(yǎng)基的保存時間取決于培養(yǎng)基的性質(zhì)。

2、表1 EdU培養(yǎng)基及染色反應(yīng)液的使用量參考 96孔板*48孔板24孔板12孔板6孔板5.5 cm 小皿EdU培養(yǎng)基100 l150 l200 l300 l500 l2 mL染色反應(yīng)液100 l150 l200 l300 l500 l2 mL 注：1)*表示貼壁細胞通常采用的培養(yǎng)容器，EdU培養(yǎng)基與染色反應(yīng)液用量以覆蓋細胞為宜； 2)懸浮細胞EdU用量依據(jù)培養(yǎng)體積而定。 1.2 每孔加入100L 50M EdU培養(yǎng)基孵育2小時，棄培養(yǎng)基； 注：1)最佳孵育時間與細胞周期相關(guān)(表2)，大多數(shù)細胞系均可采用2小時孵育時間； 2)EdU培養(yǎng)基用量以沒過細胞為宜，但需要保證EdU孵育時間內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)持續(xù)

3、供給(表1)； 1.3 PBS清洗細胞12次，每次5分鐘。 注：清洗目的是將未滲入DNA的EdU洗脫，清洗方式依據(jù)不同的細胞類型而定，貼壁不牢的細胞請降低清洗強度。表2 EdU孵育時間設(shè)定參考 3T3HelaHEK293* 細胞系人胚胎細胞酵母細胞人成纖維細胞人宮頸癌細胞人胚腎細胞系人神經(jīng)細胞細胞周期30min3h18h21h25h5d孵育時間5min20min2h2h2h1d 注： 1)EdU孵育時間取決于細胞周期，一般為細胞周期的1/10至1/5，但大多數(shù)細胞系均可采用2h孵育時間。孵育時間越長，細胞增殖數(shù)量就越多； 2)*考慮到細胞培養(yǎng)基、溫度、濕度、光線等其他因素的影響，具體實驗的細胞

4、群體細胞周期會有所變化。表3 細胞實驗EdU孵育濃度及時間參考PubMed IDReferenceCell lineConcentrationTime18272492Salic A, et al. PNAS. 2008NIH3T3, Hela10 nM10 M1 hr18521918Cappella P,et al. Cytometry A. 2008HL-60, A2780, U2OS110 M30 min18996411Chehrehasa F, et al. J Neurosci Methods. 2009Neurospheres120 M24 hr19179371Limsirichai

5、kul S, et al. Nucleic Acids Res. 2009Primary fibroblasts10 M1,2,4 hr19253396Warren M, et al. Dev Dyn. 2009Chick embryos10 M2 mM4 hr19647746Yu Y, et al. J Immunol Methods. 2009Spleen cells50 M24 hr19544417Momcilovi O, et al. Stem Cells. 2009Human ES cells10 M30 min20080700Cinquin O, et al. PNAS. 2010

6、emb-301 M12 hr20025889Han W, et al. Life Sci. 2009VSMC50 M2 hr20659708Huang C, et al. J Genet Genomics. 2010ESC50 M2 hr21310713Hua H, et al. Nucleic Acids Res. 2011fission yeast strains10 M3 hr20824490Lv L, et al. Mol Cell Biochem. 2011EJ cells50 M4hr21248284Yang S, et al. Biol Reprod. 2011GC cells5

7、0 M2 hr21227924Zhang YW, et al. Nucleic Acids Res. 2011U2OS, HT2930 M90 min21829621Guo T, et al. PloS One. 2011HIT-T1550 M4hr21980430Zeng T, et al. PloS One. 2011MCF-10A25 M2hr22012572Ding D, et al. Int Orthop. 2011C3H10T1/210 M24hr22000787Zeng W, et al. Biomaterials. 2011EPC50 M4hr21913215Xue Z, et

8、 al. J Cell Biochem. 2011SGC790125 M24hr22016038Peng F, et al. Lasers Med Sci. 2011MSC50 M2hr21878637Li D, et al. J Biol Chem. 2011HCC50 M2hr注：如果您有采用BrdU進行實驗的經(jīng)驗，可以參照BrdU實驗的相關(guān)參數(shù)進行EdU實驗。細胞固定化 2.1 每孔加入50L 細胞固定液 (即含4% 多聚甲醛的PBS)室溫孵育30分鐘，棄固定液； 注：1)低濃度的多聚甲醛有利于細胞結(jié)構(gòu)的保持，當需要抗體染色時，需采用Triton X-100透化細胞以利于抗體進入細胞內(nèi)。

9、 2)可采用其他方式進行細胞固定。 2.2 每孔加入50L 2 mg/mL 甘氨酸，脫色搖床孵育5分鐘后，棄甘氨酸溶液； 注：目的是中和多聚甲醛，保證染色反應(yīng)體系，當采用其他方式進行細胞固定時可酌情省略此步驟； 2.3 每孔加入100 L PBS，脫色搖床清洗5分鐘，棄PBS； 2.4 (加強)每孔加入100L滲透劑(0.5% TritonX-100的PBS)脫色搖床孵育10分鐘;PBS清洗1次，5分鐘。 注：當實驗需要進行其他抗體染色時，或由于某些細胞類型對染料的吸附性較高，可能需要增強細胞膜通透性。普通細胞可以省略。Apollo染色 3.1 每孔加入100 L的1X Apollo®

10、;染色反應(yīng)液(表3)，避光、室溫、脫色搖床孵育30分鐘后，棄染色反應(yīng)液； 注：1)染色液用量與細胞量相關(guān)，以覆蓋細胞為宜(表1)； 2)孵育時間可以進行適當調(diào)整，調(diào)整范圍為1030分鐘。表4 Apollo®染色反應(yīng)液的配置參考(現(xiàn)用現(xiàn)配)配制順序Apollo®染色反應(yīng)液500L*1 mL5 mL10 mL1去離子水469 L938 L4.69 mL9.38 mL2Apollo®反應(yīng)緩沖液 (試劑B)25 L50 L250 L500 L3Apollo®催化劑溶液 (試劑C)5 L10 L50 L100 L4Apollo®熒光染料溶液 (試劑D)1

11、.5 L3 L15 L30 L5Apollo®緩沖添加劑 (試劑E)5 mg9 mg44 mg88 mg 注：1)*表示通常配制的Apollo®反應(yīng)液的體積足以進行510個孔(96孔板)染色； 2)按順序配制適量1X Apollo®染色反應(yīng)液，以免破壞正常的反應(yīng)體系(現(xiàn)用現(xiàn)配，30分鐘用完)； 3)試劑E 為白色粉末，較易氧化，使用后請旋緊管蓋，如試劑出現(xiàn)棕黃色，則需更換； 粉末較難準確稱量，稱量誤差范圍可稍微放寬，但不應(yīng)超過±20%。 3.2 加入100 L滲透劑(0.5% TritonX-100的PBS) 脫色搖床清洗23次，每次10分鐘，棄滲透劑；

12、 3.3 (加強)每孔每次加入100 L 甲醇清洗12次，每次5分鐘；PBS清洗1次，每次5分鐘。 注：由于某些細胞對染料的吸附性較高，需采用加強方式洗脫以降低染料背景。普通實驗可以省略。DNA染色 4.1 用去離子水按100：1的比例稀釋試劑F，制備適量1X Hoechst33342反應(yīng)液，避光保存； 4.2 每孔加入100 L 1X Hoechst 33342反應(yīng)液，避光、室溫、脫色搖床孵育30分鐘后，棄染色反應(yīng)液； 4.3 每孔每次加入100 L PBS清洗13次； 4.4 客戶可選擇進行其他染色步驟，否則每孔加入100 L PBS保存待用。其他染色(自備) (可選)客戶可以根據(jù)實驗需要進行細胞表面或細胞內(nèi)抗原的抗體染色(注：染料兼容性請參照表4)。圖像獲取及分析 建議染色完成后立即進行觀測;如果條件限制，請避光 4 濕潤保存待測，但不應(yīng)超過3天。 注：調(diào)試儀器時，請將曝光時間調(diào)整為30ms左右，盡量不要>1s。表5 配套染料的相關(guān)波長信息C00031*Apollo®