1、抗生素發酵工藝學知識要點（1） 發酵工業的生產水平取決于三個要素，即 生產菌種 、 生產工藝、 生產設備 。（2） 目前無菌檢測的方法主要四種，即 鏡檢法 、肉湯培養法、平板劃線培養 和 發酵過程異常現象觀察法。（3） 發酵醪中菌體分離一般采用  離心分離 和   過濾分離  兩種方法。（4） 在微生物培養過程中，引起培養基pH值改變的原因主要有 營養成份的消耗 和 代謝物的累積 等。（5） 發酵過程控制的目的就是得到 最大的比生產率 和 最大的得率 。（6） 發酵工業中常用滅菌方法： 化學滅菌 、 射線滅菌 、 干熱滅菌 、 濕熱滅菌 。（7） 常用工

2、業微生物可分為細菌、 酵母菌 、 霉菌 、 放線菌 四大類。（8） 常用菌種保藏方法有 斜面保藏法、沙土管保藏法、液體石蠟保藏法和真空冷凍保藏法等（9） 發酵高產菌種選育方法包括 自然選育 、 雜交育種 、 誘變育種 、 基因工程育種 、 原生質體融合 （10） 發酵產物整個分離提取路線可分為 預處理 、 固液分離 、 初步純化 、 精細純化 和 成品加工 等五個主要過程。（11） 工業微生物菌種可以來自 自然分離 ，也可以來自從 微生物菌種保藏機構 單位獲取。（12） 環境無菌的檢測方法有 顯微鏡檢查法、 肉湯培養法 、 平板培養法 、 發酵過程的異常觀察法 等。（13） 發酵罐發酵過程中的

3、物理檢測參數有 溫度、 轉速 、壓力 、 攪拌轉速 和 空氣流量）。（14） 前體：是指某些化合物加入到發酵培養基中，能直接彼微生物在生物合成過程中合成到產物物分子中去，而其自身的結構并沒有多大變化，但是產物的產量卻因加入前體而有較大提高的化合物。（15） 發酵生長因子：從廣義上講，凡是微生物生長不可缺少的微量的有機物質，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素等均稱生長因子。（16） 生理性酸性物質：經微生物代謝等作用后能形成酸性物質使培養基pH值下降的營養物質。（17） 限制性基質：微生物生長速率與底物濃度有一定的依賴關系，當底物濃度很小，微生物生長速率與底物濃度成正比，此時基質叫限制性基質。（18）

4、 發酵熱 ：所謂發酵熱就是發酵過程中釋放出來的凈熱量。什么叫凈熱量呢？在發酵過程中產生菌分解基質產生熱量，機械攪拌產生熱量，而罐壁散熱、水分蒸發、空氣排氣帶走熱量。這各種產生的熱量和各種散失的熱量的代數和就叫做凈熱量。發酵熱引起發酵液的溫度上升。發酵熱大，溫度上升快，發酵熱小，溫度上升。（19） 染菌率：總染菌率指一年發酵染菌的批（次）數與總投料批（次）數之比的百分率。染菌批次數應包括染菌后培養基經重新滅菌，又再次染菌的批次數在內。（20） 連消：連消也叫連續滅菌，就是將將配制好的并經預熱（6075）的培養基用泵連續輸入由直接蒸汽加熱的加熱塔，使其在短時間內達到滅菌溫度（126132），然后進

5、入維持罐（或維持管），使在滅菌溫度下維持57分鐘后再進入冷卻管，使其冷卻至接種溫度并直接進入已事先滅菌（空罐滅菌）的發酵罐內的培養基滅菌方法。其過程均包括加熱、維持和冷卻等滅菌操作過程。（21） DE值（葡萄糖值）：表示淀粉水解程度及糖化程度，指葡萄糖（所有測定的還原糖都當作葡萄糖來計算）占干物質的百分率。（22） 補料分批培養：在分批培養過程中補入新鮮的料液，以克服營養不足而導致的發酵過早結束的缺點。在此過程中只有料液的加入沒有料液的取出，所以發酵結束時發酵液體積比發酵開始時有所增加。在工廠的實際生產中采用這種方法很多。（23） 次級代謝產物：從初級代謝途徑中形成分枝代謝途徑，并用初級代謝產

6、物生成與菌體生長繁殖無關的物質或功能還未明的化合物，這個過程稱次級代謝。（24） 種子培養基有何特點？a) 有較完全和豐富的營養物質，糖分少，需充足氮源和生長因子，無機氮源比例大；b) 各種營養物質的濃度不必太高；c) 供孢子用的種子培養基，可添加易被吸收利用的碳源和氮源；d) 應考慮與發酵培養基的主要成分相近。（25） 泡沫對發酵有何影響？常用的消泡方法有何優缺點？ 泡沫對發酵的影響有：（1）泡沫持久存在，妨礙CO2的排除，影響微生物對氧的吸收，破壞正常生理代謝，不利發酵和生物合成。（2）泡沫大量產生，使發酵罐有效容積大大減少，影響設備利用率。（3）泡沫過多，控制不好，會引起大量跑料，造成浪

7、費和環境污染（4）泡沫升到灌頂，可能從軸封滲出，增加染菌機會（5）泡沫過多也會影響氧傳遞、通風與攪拌效果。（6）化學消泡優點：化學消泡劑來源廣泛，消泡效果好作用迅速可靠，用量少，不需改造設備，大小規模適用，易實現自動控制。缺點：消泡劑對微生物生長有毒性。（7）物理消泡優點：不用在發酵液中加其他物質，節省原料，減少由于加消泡劑引起的污染機會。缺點：不如化學消泡迅速、可靠，需一定設備及消耗動力，不能從根本上消除引起穩定泡沫的因素。（26） 什么是半連續培養，說明其優缺點。 在補料分批培養的基礎上間歇放掉部分發酵液（帶放）稱為半連續培養。某些品種采取這種方式，如四環素發酵，優點：放掉部分發酵液，再補

8、入部分料液，使代謝有害物得以稀釋有利于產物合成，提高了總產量。缺點：代謝產生的前體物被稀釋，提取的總體積增大；（27） 發酵級數確定的依據是什么？ 答：（1）一般由菌絲體培養開始計算發酵級數，但有時，工廠從第一級種子罐開始計算發酵級數，谷氨酸：三級發酵，一級種子（搖瓶）二級種子 （小罐）發酵；青霉素：三級發酵，一級種子（小罐）二級種子（中罐）發酵。 （2）發酵級數確定的依據：級數受發酵規模、菌體生長特性、接種量的影響。 （3）級數大，難控制、易染菌、易變異，管理困難，一般2-4級。 （4）在發酵產品的放大中，反應級數的確定是非常重要的一個方面（28） 如何選擇最適發酵溫度？ 1、根據菌種及生長

9、階段選擇。微生物種類不同，所具有的酶系及其性質不同，所要求的溫度范圍也不同。在發酵前期由于菌量少，發酵目的是要盡快達到大量的菌體，取稍高的溫度，促使菌的呼吸與代謝，使菌生長迅速；在中期菌量已達到合成產物的最適量，發酵需要延長中期，從而提高產量，因此中期溫度要稍低一些，可以推遲衰老。發酵后期，產物合成能力降低，延長發酵周期沒有必要，就又提高溫度，刺激產物合成到放罐。 2、根據培養條件選擇。溫度選擇還要根據培養條件綜合考慮，靈活選擇。通氣條件差時可適當降低溫度，使菌呼吸速率降低些，溶氧濃度也可髙些。培養基稀薄時，溫度也該低些。因為溫度高營養利用快，會使菌過早自溶。 3、根據菌生長情況，菌生長快，維

10、持在較高溫度時間要短些；菌生長慢，維持較高溫度時間可長些。培養條件適宜，如營養豐富，通氣能滿足，那么前期溫度可髙些，以利于菌的生長。總的來說，溫度的選擇根據菌種生長階段及培養條件綜合考慮。要通過反復實踐來定出最適溫度。（29） 簡述發酵工業經歷的幾個不同階段  答：發酵工業經歷了以下幾個不同階段：  ( 1)自然發酵時期；  (2)純培養技術的建立 ； (3)通氣攪拌（好氣性）發酵（工程）技術的建立； (4)人工誘變育種與代謝控制發酵工程技術的建立； (5)開拓新型發酵原料時期 ； (6)與基因操作技術相結合的現代發酵工程技術階段。（

11、30） 發酵過程中pH會不會發生變化？為什么？ 發酵過程中pH是不斷變化的，1） 糖代謝特別是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，pH上升，是補料的標志之一；2） 氮代謝當氨基酸中的-NH2被利用后pH會下降；尿素被分解成NH3，pH上升，NH3利用后pH下降，當碳源不足時氮源當碳源利用pH上升。3） 生理酸堿性物質利用后pH會上升或下降；4） 某些產物本身呈酸性或堿性，使發酵液pH變化。如有機酸類產生使pH下降，紅霉素、潔霉素、螺旋霉素等抗生素呈堿性，使pH上升。5） 菌體自溶 pH上升，發酵后期，pH上升；6）雜菌的污染，pH下降等。31、簡述氧為何容易成為好氧發酵的限制

12、性因素？如何調節搖瓶及發酵罐發酵的供氧水平？ （1）氧是需氧微生物生長所必需的。氧往往容易成為控制因素，是因為氧在水中的溶解度很低，培養基因含有大量的有機和無機物質，氧的溶解度比水中還要更低。在對數生長期即使發酵液中的氧濃度達到飽和，若此時終止供氧，發酵液中的溶氧可在幾分鐘內全部耗盡，使溶氧成為控制因素。細胞濃度直接影響培養液的攝氧率，在分批發酵中攝氧率變化很大，不同生長階段需氧不同，對數生長后期達最大值。培養基的成分和濃度顯著影響微生物的攝氧率，碳源種類對細胞的需氧量有很大影響，一般葡萄糖的利用速度比其他的糖要快。 （2）搖瓶往復培養，頻率80-120分/次，振幅 8cm；旋轉培養，偏心距轉

13、速250rpm；搖瓶裝液量，一般取1/10左右（250ml ，15-25 ml；500ml ，30 ml；750ml ，80 ml）。 （3）發酵罐通氣，一般認為，發酵初期較大的通風和攪拌而產生過大的剪切力，對菌體的生長有時會產生不利的影響，所以有時發酵初期采用小通風，停攪拌，不但有利于降低能耗，而且在工藝上也是必須的。但是通氣增大的時間一定要把握好。32、簡述代謝網絡假說的要點 代謝網絡假說的要點包括： 1)  代謝途徑（中心、注入、發散）交織形成網絡；  2) 分解代謝和合成代謝具有單向性； 3) A

14、TP是通用的能量載體； 4) NAD(P)H 以還原當量形式攜帶能量。33、發酵過程中染菌的判斷與檢查 以無菌試驗中的酚紅肉湯培養和雙碟培養的反應為主,，以鏡檢為輔。每個無菌樣品的無菌試驗，至少用2只酚紅肉湯或斜 面同時取樣培養。要定量或用接種環蘸取法取樣，不宜從發酵罐直接取樣。因取樣量不同,影響顏色反 應和渾濁程度的觀察。如果連續3個時間的酚紅肉湯無菌樣 發生顏色變化或產生渾濁,或斜面連續3個時間樣品長出雜菌 即判斷為染菌。有時酚紅肉湯反應不明顯,要結合鏡檢確認連 續3個時間樣品染菌，即判為染菌。 34、種子罐和發酵罐發現染菌后的處理 種子罐染菌后都不能往下道工序移種,要

15、及時 用高壓蒸汽直接滅菌后經過濾處理。發酵罐染菌的處理 ： 發酵罐前期染菌,污染的雜菌對產生菌的危害性大, 采用蒸汽滅菌經過濾處理后放掉;如果危害性不大, 可用重新滅菌、重新接種的方式處理,如營養成分消 耗較多,可放掉部分培養液補入部分新培養基后進行 滅菌,重新接種；如污染的雜菌量少且生長緩慢,可 以繼續運轉下去,但要時刻注意雜菌數量和代謝的變 化。 在發酵的中后期染菌,一是加入適量的殺菌劑, 如呋喃西林或某些抗生素,抑制雜菌的生長。二是降 低培養溫度或控制補料量來控制雜菌的生長速度。 如果采用上述兩種措施仍不見效,就要考慮提前放罐； 染菌后的設備處理 ： 染菌后的罐體用甲醛等化學物質處理,再用蒸 汽滅菌包括各種附屬設備。在再次投料 之前,要徹底清洗罐體、附件,同時進行嚴密程 度檢查,以防滲漏。染菌后的處理尤為重要， 很多大面積染菌都是由于處理不徹底而造成 的系統污染，造成無法及時處理好各個環節 出現連續污染。 35、如何防止染菌？ 提高空氣進口 的空氣潔凈度； 除盡壓縮空氣中夾帶的油和水,保持過濾介質的除菌效率。在夏秋兩季，由于空氣濕度較大可能出現預過濾器放出水的現象，因此定時放水。另外,在過濾器滅菌時要防止過濾介質被沖翻或燒灼,還要