1、蛋白樣本制備與蛋白樣本制備與Western BlotWestern Blot北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司2主要內容主要內容123成功的成功的 Western Blot645北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司3一一 蛋白樣本制備蛋白樣本制備-成功蛋白分析的基礎成功蛋白分析的基礎蛋白樣本蛋白樣本activity assaysprotein microarraysSDS-PAGEimmunoblottingmass spectrometry/IEFEMSAEL

2、ISA蛋白樣本制備的目的蛋白樣本制備的目的: 后續應用后續應用北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司4二二 蛋白樣本制備的原則蛋白樣本制備的原則蛋白樣本制備原則方法應具備標準化，具有重現性方法應具備標準化，具有重現性 、可靠性、簡便性；、可靠性、簡便性；盡量抽提完全；盡量抽提完全；應使所有蛋白全部處于溶解狀態應使所有蛋白全部處于溶解狀態防止發生蛋白的降解、聚集、沉淀、變性防止發生蛋白的降解、聚集、沉淀、變性防止在抽提過程中發生化學修飾防止在抽提過程中發生化學修飾如做如做2D則需去除高豐度蛋白或無關蛋白則需去除高豐度蛋白或無關蛋白必

3、要時去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白必要時去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司5二二 蛋白樣本制備的策略蛋白樣本制備的策略制備蛋白的目的制備蛋白的目的活性分析 免疫印跡雜交 免疫沉淀或共沉淀1D 2D EMSA CHIP等實驗材料實驗材料 細胞 組織 固定組織或石蠟包埋組織 微生物 酵母 植物 提取RNA后的剩余的蛋白樣本等目的蛋白的結性質目的蛋白的結性質與分布與分布分布于胞槳/胞核/膜 可溶/不可溶 含量多少 分子量大小 四級結構特征 磷酸化等修飾方法的選擇方法的選擇 1 自行配制抽提試劑,根據文

4、獻方法或經驗提取 2 購買商品化試劑盒,按其說明書的方法提取北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司6三三 案例分析案例分析- - 細胞中總蛋白的制備細胞中總蛋白的制備裂解樣品離心收集定量檢測北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司7細胞裂解液-RIPA Buffer的配方分析及技術要點表面活性劑表面活性劑緩沖液緩沖液蛋白酶抑制劑蛋白酶抑制劑磷酸酶抑制劑磷酸酶抑制劑其它：其它：H2O、NaCl、等、等還原劑還原劑RIPA Buffer北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為

5、世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司8細胞裂解液細胞裂解液-RIPA Buffer-RIPA Buffer的配方分析及技術要點的配方分析及技術要點 緩沖液緩沖液Tris-HCl（pH7.5),提供提供pH環境，使蛋白保持穩定，環境，使蛋白保持穩定，增加溶解性增加溶解性。北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司9細胞裂解液細胞裂解液-RIPA Buffer-RIPA Buffer的配方分析及技術要點的配方分析及技術要點溶解膜與脂膜，溶解與穩定蛋白質（特別是膜蛋白）溶解膜與脂膜，溶解與穩定蛋白質（特別是膜蛋白

6、）分為離子型（如分為離子型（如SDS、脫氧膽酸鹽等）和非離子型（、脫氧膽酸鹽等）和非離子型（如如NP-40、Triton-100、tween系列等）。系列等）。北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司10各類表面活性劑特點各類表面活性劑特點 1 陰離子型陰離子型: SDS 脫氧膽酸鹽 2 陽離子型陽離子型: CPB和CTAB 3 雙性離子型雙性離子型: CHAPS Zwittergent系列 4 非離子型非離子型: Brij系列 Triton-100 Nonidet P40 Tween 系列等北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世

7、紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司11選用表面活性劑考慮的因素選用表面活性劑考慮的因素參考文獻報告保持生物活性時使用的表面活性劑參考文獻報告保持生物活性時使用的表面活性劑選選用用表表面面活活性性劑劑考考慮慮的的因因素素工作條件下表面活性劑的溶解性工作條件下表面活性劑的溶解性使用分子生物學級的表面活性劑使用分子生物學級的表面活性劑,無核酸酶蛋白酶等無核酸酶蛋白酶等根據樣本下游的應用來選擇表面活性劑的種類根據樣本下游的應用來選擇表面活性劑的種類考慮表面活性劑的去除方法考慮表面活性劑的去除方法表面活性劑的純度影響提取蛋白的質量表面活性劑的純度影響提取蛋白的質量保護蛋白活性

8、時保護蛋白活性時,不僅考慮表面活性劑的種類還有濃度不僅考慮表面活性劑的種類還有濃度盡量使用毒性較低的表面活性劑盡量使用毒性較低的表面活性劑因不明原因某些蛋白適用專門的表面活性劑進行分離因不明原因某些蛋白適用專門的表面活性劑進行分離使用非表面活性劑使用非表面活性劑NDSB結合表面活性劑來增加膜蛋白溶解性結合表面活性劑來增加膜蛋白溶解性有時比較難僅一種表面活性劑既能溶解蛋白又適用于蛋白分析有時比較難僅一種表面活性劑既能溶解蛋白又適用于蛋白分析,常先用一種表面活性劑將蛋白溶解常先用一種表面活性劑將蛋白溶解,而另一種表面活性劑取代進而另一種表面活性劑取代進行蛋白的后續分析行蛋白的后續分析北京康為世紀生

9、物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司12去除未結合的表面活性劑去除未結合的表面活性劑1疏水吸附方法疏水吸附方法 Hydrophobic Adsorption 2透析法透析法 Dialysis3凝膠層析法凝膠層析法 Gel Chromatography4離子交換層析離子交換層析Ion-exchange Chromatography 根椐表面活性劑的疏水性根椐表面活性劑的疏水性,CMC,凝聚數目凝聚數目,和電荷等性質來去除和電荷等性質來去除. 北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司1

10、3細胞裂解液細胞裂解液-RIPA Buffer-RIPA Buffer的配方分析及技術要點的配方分析及技術要點蛋白蛋白酶抑酶抑制劑制劑抑制蛋白酶的活性，防止蛋白被水解，使用前臨抑制蛋白酶的活性，防止蛋白被水解，使用前臨時加入時加入北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司14蛋白酶抑制劑蛋白酶抑制劑北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司15細胞裂解液細胞裂解液-RIPA Buffer-RIPA Buffer的配方分析及技術要點的配方分析及技術要點磷酸磷酸酶抑酶抑制劑制劑抑

11、制磷酸酶的活化，防止蛋白樣本脫磷酸化，使抑制磷酸酶的活化，防止蛋白樣本脫磷酸化，使用前臨時加入。用前臨時加入。北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司16磷酸酶抑制劑選擇磷酸酶抑制劑選擇 磷酸酶主要包括非特異性的磷酸酶（例如：堿性磷酸酶，磷酸酶主要包括非特異性的磷酸酶（例如：堿性磷酸酶，酸性磷酸酶），特異性的絲氨酸酸性磷酸酶），特異性的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶（例如：蘇氨酸磷酸酶（例如：PP1, PP2A, PP2B） 、酪氨酸蛋白磷酸酶（例如：、酪氨酸蛋白磷酸酶（例如：PTP）。）。 常規的抑制劑主要包括：常規的抑制劑主要包括： 試劑

12、名稱試劑名稱抑制作用抑制作用氟化鈉氟化鈉酸性磷酸酶，絲氨酸酸性磷酸酶，絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶蘇氨酸磷酸酶正釩酸鈉正釩酸鈉堿性磷酸酶，酪氨酸蛋白磷酸酶堿性磷酸酶，酪氨酸蛋白磷酸酶焦磷酸鈉焦磷酸鈉絲氨酸絲氨酸-蘇氨酸磷酸蘇氨酸磷酸 北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司17細胞裂解液細胞裂解液-RIPA Buffer-RIPA Buffer的配方分析及技術要點的配方分析及技術要點防止蛋白質發生氧化，保護二硫鍵。防止蛋白質發生氧化，保護二硫鍵。DTT、 巰基乙醇等。巰基乙醇等。.北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理

13、 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司18細胞裂解液細胞裂解液-RIPA Buffer-RIPA Buffer的配方分析及技術要點的配方分析及技術要點水；溶劑水；溶劑NaCl：北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司19全蛋白抽提時注意事項全蛋白抽提時注意事項可以適量加入甘可以適量加入甘油油,穩定蛋白穩定蛋白注意事項注意事項可以適量加入可以適量加入Benzonase /DNase I等核酸等核酸酶酶,去除去除DNA,充充分提取蛋白分提取蛋白,降降低提取的粘度低提取的粘度.抑制蛋白酶及磷抑制蛋白酶及磷酸酶酸酶使用的使用的Deter

14、gent的種的種類類 純度純度 濃度濃度 干干擾擾 去除等因素去除等因素Temperature 試劑和器皿冰上試劑和器皿冰上預冷預冷,低溫低溫4操操作作細胞或組織的樣細胞或組織的樣本量本量裂解液的用量裂解液的用量北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司20細胞裂解液細胞裂解液-RIPA Buffer-RIPA Buffer的配方分析及技術要點的配方分析及技術要點北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司21四四 蛋白樣本制備產品選擇指南蛋白樣本制備產品選擇指南北京康為世紀生

15、物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司22核蛋白樣本制備核蛋白樣本制備抽提原理低滲裂解細胞膜,釋放出胞漿蛋白與胞核;離心分離出胞核;高滲破裂胞核,釋放出可溶性核蛋白;加核酸酶降解DNA,釋放出DNA結合蛋白(組蛋白和轉錄因子)實驗注意事項試劑和器皿冰上預冷裂解液的用量細胞總量抑制蛋白酶蛋白酶抑制劑北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司23膜蛋白樣本制備膜蛋白樣本制備北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司24膜蛋白的抽提

16、v 方法及原理方法及原理 方法多 直接抽提法 分級抽提法 1:先機械法等非表面活性劑方法裂解細胞,再用表面活性劑抽提 2:按溶解性分級抽提 3:按亞細胞分級抽提 v 產物產物 細胞膜蛋白 細胞器質膜蛋白v 注意事項注意事項 根椐膜蛋白種類和后續研究目的的不同,選擇不同的產品或表面活性劑變性劑等. 抑制蛋白酶. 樣本量北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司25膜蛋白的直接提取膜蛋白的直接提取北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司26蛋白的分級提取蛋白的分級提取 按蛋白溶

17、解度不同進行分級抽提按蛋白溶解度不同進行分級抽提,降低樣品的復雜性并富集低豐度蛋白質降低樣品的復雜性并富集低豐度蛋白質第一步：用非表面活性劑溶液裂解細胞提取高溶解性蛋白；第一步：用非表面活性劑溶液裂解細胞提取高溶解性蛋白；第二步：把未溶解的第二步：把未溶解的pellet用裂解液溶解用裂解液溶解,提取高疏水性蛋白提取高疏水性蛋白(膜蛋白膜蛋白)；第三步：用含復合表面活性劑的蛋白溶解液，最后抽提前兩次抽提后不第三步：用含復合表面活性劑的蛋白溶解液，最后抽提前兩次抽提后不能溶解的膜蛋白約占整個樣品的能溶解的膜蛋白約占整個樣品的11%（W/W）。）。北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河

18、南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司27亞細胞分級抽提亞細胞分級抽提v 用超離心技術分離出細胞器、用超離心技術分離出細胞器、質膜和細胞核等成分，再用適質膜和細胞核等成分，再用適當的蛋白質溶解液進行溶解。當的蛋白質溶解液進行溶解。其優點是不僅大大減少樣品的其優點是不僅大大減少樣品的復雜性，而且可對分離的蛋白復雜性，而且可對分離的蛋白質進行亞細胞定位。但該法需質進行亞細胞定位。但該法需要專業儀器，有時會出現假陽要專業儀器，有時會出現假陽性。性。v 根椐胞漿根椐胞漿/胞膜胞膜/胞核胞核/骨架骨架蛋白的亞細胞策略用不同蛋白的亞細胞策略用不同提取液逐級溶解提取液逐級溶解北京康為世紀生物科技

19、河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司28四種亞細胞組分分離提取的結果四種亞細胞組分分離提取的結果北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司29線粒體蛋白樣本制備線粒體蛋白樣本制備v 首先用密度梯度離心方法分別分離首先用密度梯度離心方法分別分離出線粒體出線粒體,胞質胞質,胞核胞核.v 再用線粒體抽提再用線粒體抽提Buffer溶解線粒體溶解線粒體蛋白蛋白.北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司30蛋白抽提產品蛋白抽提產品v哺乳動物

20、蛋白抽提試劑盒哺乳動物蛋白抽提試劑盒（CW0002）v組織蛋白抽提試劑盒組織蛋白抽提試劑盒（CW0004）v真核膜蛋白抽提試劑盒真核膜蛋白抽提試劑盒（CW0005）v細菌蛋白抽提試劑盒細菌蛋白抽提試劑盒（CW0001）v酵母蛋白抽提試劑盒酵母蛋白抽提試劑盒（CW0003）v植物蛋白抽提試劑盒植物蛋白抽提試劑盒（CW2033）vNc-細胞核細胞核/漿蛋白抽提試劑盒漿蛋白抽提試劑盒（CW0006）北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司31五五 蛋白定量產品選擇指南蛋白定量產品選擇指南北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河

21、南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司32BCABCA法蛋白定量法蛋白定量（CW0014CW0014） BCA（bicinchoninic acid）是理想的蛋白質定量方法。）是理想的蛋白質定量方法。該方法因快速靈敏、穩定可靠，對不同種類蛋白質檢測的該方法因快速靈敏、穩定可靠，對不同種類蛋白質檢測的變異系數非常小而倍備受專業人士的青睞。該方法的原理變異系數非常小而倍備受專業人士的青睞。該方法的原理是，在堿性條件下，蛋白將是，在堿性條件下，蛋白將Cu2+還原為還原為Cu+，Cu+與與BCA試劑形成紫色的絡合物，測定其在試劑形成紫色的絡合物，測定其在562nm處的吸收處的吸收值，并與標

22、準曲線對比，即可計算待測蛋白的濃度。值，并與標準曲線對比，即可計算待測蛋白的濃度。BCA法測定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學物質的影響。法測定蛋白濃度不受絕大部分樣品中的化學物質的影響。在組織細胞裂解實驗中，低濃度的去垢劑在組織細胞裂解實驗中，低濃度的去垢劑SDS，Triton X-100，Tween不影響檢測結果，但螯合劑（不影響檢測結果，但螯合劑（EDTA，EGTA）、還原劑（）、還原劑（DTT，巰基乙醇）和脂類會對檢測結，巰基乙醇）和脂類會對檢測結果有一定影響。實驗中，若發現樣品稀釋液或裂解液本身果有一定影響。實驗中，若發現樣品稀釋液或裂解液本身背景值較高，可試用背景值較高，可試用Br

23、adford法測定蛋白濃度。法測定蛋白濃度。 北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司33BradfordBradford法法蛋白定量蛋白定量（CW0013CW0013） 考馬斯亮蘭考馬斯亮蘭G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質結合，使染料，在酸性溶液中與蛋白質結合，使染料的最大吸收峰的位置（染料的最大吸收峰的位置（lmax），由），由465nm變為變為595nm，溶液的顏色也由棕黑色變為蘭色。經研究認為，溶液的顏色也由棕黑色變為蘭色。經研究認為，染料主要是與蛋白質中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和染料主要是與蛋白質中的堿性氨基酸（特

24、別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結合。測定快速、簡便，只需加一種芳香族氨基酸殘基相結合。測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要試劑。完成一個樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染分鐘左右。由于染料與蛋白質結合的過程，大約只要料與蛋白質結合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏分鐘即可完成，其顏色可以在色可以在1小時內保持穩定，且在小時內保持穩定，且在5分鐘至分鐘至20分鐘之間，分鐘之間，顏色的穩定性最好。由于各種蛋白質中的精氨酸和芳香族顏色的穩定性最好。由于各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質測法用于不同蛋白質

25、測定時有較大的偏差。去污劑、定時有較大的偏差。去污劑、 Triton X-100、十二烷基硫、十二烷基硫酸鈉（酸鈉（SDS）干擾此法的測定。）干擾此法的測定。 北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司34LoweryLowery法蛋白定量法蛋白定量（CW0015CW0015） Lowry法蛋白質測定法是最靈敏的方法之一。過去此法是法蛋白質測定法是最靈敏的方法之一。過去此法是應用最廣泛的一種方法，在堿性條件下，蛋白質中的肽鍵應用最廣泛的一種方法，在堿性條件下，蛋白質中的肽鍵與銅結合生成復合物。與銅結合生成復合物。 Folin酚試劑中的

26、磷鉬酸鹽酚試劑中的磷鉬酸鹽磷磷鎢酸鹽被蛋白質中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產生深鎢酸鹽被蛋白質中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。這個測定法的優點是靈敏度高，缺度與蛋白的量成正比。這個測定法的優點是靈敏度高，缺點是費時間較長，要精確控制操作時間，標準曲線也不是點是費時間較長，要精確控制操作時間，標準曲線也不是嚴格的直線形式，且專一性較差，干擾物質較多。嚴格的直線形式，且專一性較差，干擾物質較多。北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司

27、鄭州森斯科貿有限公司35六六 成功的成功的Western BlotWestern BlotDiagram通過電泳區分不同的組分，并轉移至固相支持物，通過特異性試劑（抗體）作為探針，對靶物質進行檢測，蛋白質的Western印跡技術結合了凝膠電泳的高分辨率和固相免疫測定的特異敏感等多種特點，可檢測到低至15ng（最低可到10100pg）中等大小的靶蛋白 原理原理北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司36六六 成功的成功的Western BlotWestern Blot二抗孵育二抗孵育蛋白提取與定量蛋白提取與定量一一抗孵育抗孵育封閉封閉

28、轉膜轉膜SDS-PAGE蛋白變性蛋白變性顯影顯影北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司37蛋白變性蛋白變性蛋蛋白質白質-SDS膠束膠束加入Sample buffer沸水浴5min北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司38SDS-PAGESDS-PAGE產物：三維網狀結構凝膠產物：三維網狀結構凝膠加速劑加速劑催化劑催化劑單體單體交聯劑交聯劑四甲基乙二胺（四甲基乙二胺（TEMED）丙烯酰胺（丙烯酰胺（Acr）過硫酸胺或核黃素（過硫酸胺或核黃素（AP）甲叉雙丙烯酰胺（甲叉雙

29、丙烯酰胺（Bis）北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司39SDS-PAGESDS-PAGE 作用緩沖液PH凝膠濃度濃縮膠濃縮膠使蛋白樣品濃縮使蛋白樣品濃縮PH6.8Tris-ClPH6.8Tris-Cl 低，低，2-5%2-5%分離膠分離膠使蛋白樣品分離使蛋白樣品分離PH8.8Tris-ClPH8.8Tris-Cl 高，根據蛋白高，根據蛋白大小大小電泳緩沖液：電泳緩沖液：PH8.3Tris-PH8.3Tris-甘氨酸甘氨酸-SDS-SDS系統系統。北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司

30、鄭州森斯科貿有限公司40SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝膠最佳分離范圍聚丙烯酰胺凝膠最佳分離范圍不同分子量范圍的蛋白質應選用不同的凝膠濃度。不同分子量范圍的蛋白質應選用不同的凝膠濃度。北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司41聚丙烯酰胺分離膠配方聚丙烯酰胺分離膠配方北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司42SDS-PAGESDS-PAGE灌制分離膠 隔絕空氣灌好后一般室溫放置灌好后一般室溫放置3040分鐘分鐘北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭

31、州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司43SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝膠濃縮膠配方聚丙烯酰胺凝膠濃縮膠配方北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司44SDS-PAGESDS-PAGE灌制積層膠灌制積層膠 插入梳子插入梳子北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司45SDS-PAGESDS-PAGE膠制備注意事項膠制備注意事項v過硫酸銨一般現配現用，如連續實驗可在過硫酸銨一般現配現用，如連續實驗可在4度放度放置置23天。配制天。配制30丙烯酰胺儲存液要過濾。丙烯酰胺儲存液要過

32、濾。v配制過程中每加入一種試劑要充分混勻，防止膠配制過程中每加入一種試劑要充分混勻，防止膠出現濃度不均的情況。出現濃度不均的情況。v要根據溫度調整要根據溫度調整TEMED的使用量。的使用量。v水封的時候水要慢慢加入，太快會導致膠面不平。水封的時候水要慢慢加入，太快會導致膠面不平。v插梳子的時候要用力均勻，一次成型。插梳子的時候要用力均勻，一次成型。v在上樣前可在上樣前可20V恒壓預電泳恒壓預電泳20分鐘，可去除泳道分鐘，可去除泳道中的雜質。中的雜質。北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司46上樣及電泳上樣及電泳v提前將樣品沸水浴提

33、前將樣品沸水浴5分鐘，分鐘，1200014000rpm離心離心5分鐘。分鐘。v根據自己的設計上樣。根據自己的設計上樣。v80V恒壓跑濃縮膠。恒壓跑濃縮膠。v看溴酚藍壓縮成一條線后把電壓調為看溴酚藍壓縮成一條線后把電壓調為100V。v當溴酚藍跑至離膠的下面還有當溴酚藍跑至離膠的下面還有0.40.6mm時停止電泳。時停止電泳。北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司47轉膜轉膜 蛋白質帶負電荷，凝膠在負極一側，膜在正極蛋白質帶負電荷，凝膠在負極一側，膜在正極一側，接通電源以后，蛋白質由負極向正極轉移一側，接通電源以后，蛋白質由負極向正極

34、轉移至膜上。至膜上。北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司48轉膜轉膜北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司49轉膜注意事項轉膜注意事項v PVDF膜要預先用甲醇活化；膜要預先用甲醇活化；NC膜要預先泡水，除去中間的氣泡。然膜要預先泡水，除去中間的氣泡。然后在轉膜也中平衡后在轉膜也中平衡20分鐘。分鐘。v 膜、膠、濾紙夾好后要將中間的氣泡全部趕出來，否則有氣泡的地方膜、膠、濾紙夾好后要將中間的氣泡全部趕出來，否則有氣泡的地方就會斷路，蛋白無法轉到膜上。就會斷路，蛋白無

35、法轉到膜上。v 轉膜要在冰浴中進行，防止散熱量太大導致轉膜溫度過高。轉膜要在冰浴中進行，防止散熱量太大導致轉膜溫度過高。v 根據蛋白分子量大小選擇適合的轉膜條件。根據蛋白分子量大小選擇適合的轉膜條件。分子量（分子量（kd）轉膜條件轉膜條件200同上，可在轉膜液中加同上，可在轉膜液中加0.1SDS北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司50膜的封閉膜的封閉 為避免膜與作為檢測試劑的特異性第為避免膜與作為檢測試劑的特異性第一抗體發生非特異性結合，使非特異性背一抗體發生非特異性結合，使非特異性背景提高，需對膜上的潛在結合位點進行封景提高，

36、需對膜上的潛在結合位點進行封閉處理閉處理,一般用一般用5的脫脂奶粉或者的脫脂奶粉或者3的的BSA室溫或室溫或37度封閉度封閉2小時。小時。北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司51轉好蛋白的膜轉好蛋白的膜ProteinProtein北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司52封閉封閉ProteinProteinBlocking AgentBlocking AgentBlocking Agent北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限

37、公司鄭州森斯科貿有限公司53一抗孵育一抗孵育ProteinProteinBlocking AgentBlocking AgentBlocking AgentPrimary Antibody北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司54二抗孵育二抗孵育ProteinProteinBlocking AgentBlocking AgentBlocking AgentPrimary AntibodySecondary Antibody北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司55顯影

38、顯影ProteinProteinBlocking AgentBlocking AgentBlocking AgentPrimary AntibodySecondaryAntibodyEnzyme (E)sssssPPPP Substrate北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司56顯色方法顯色方法- HRP- HRP酶促底物直接顯色酶促底物直接顯色北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司57顯色方法顯色方法化學發光化學發光cECL低背景(CW0048)eECL高靈敏型(

39、CW0049)主要優點適用于HRP檢測的最靈敏的化學發光底物適用于HRP檢測的最靈敏的化學發光底物檢測下限10-12g10-15g 信號持續時間8小時8小時首選檢測方法成像設備或X膠片成像設備或X膠片建議一抗稀釋度0.2ug-1ug/ml50ng-1ug/ml建議二抗稀釋度10ng-50ng/ml5ng-50ng/ml產品保存期室溫1年41年建議印跡膜硝化纖維或PVDF硝化纖維或PVDF北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司58成功的要素成功的要素1質優量足的蛋白樣本質優量足的蛋白樣本2科學的對照科學的對照3正確的抗體選擇正確的抗

40、體選擇 保存和使用保存和使用4細致的實驗操作細致的實驗操作5步步監測步步監測北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司59科學的對照科學的對照v 蛋白蛋白Marker：預染或非預染各種分子量的蛋白，用于標示電泳中蛋：預染或非預染各種分子量的蛋白，用于標示電泳中蛋白的大小和示蹤白的大小和示蹤v 陽性對照：目的蛋白或明確表達目的蛋白的組織或細胞的蛋白提取物，陽性對照：目的蛋白或明確表達目的蛋白的組織或細胞的蛋白提取物，用于檢驗整個實驗體系和過程的正確性有效性用于檢驗整個實驗體系和過程的正確性有效性/特別是一抗的質量和特別是一抗的質量和效率

41、效率v 陰性對照：非目的蛋白或明確不表達目的蛋白組織或細胞的蛋白提取陰性對照：非目的蛋白或明確不表達目的蛋白組織或細胞的蛋白提取物，用于檢驗抗體的特異性物，用于檢驗抗體的特異性v 二抗對照：不加一抗，用于檢驗二抗的特異性二抗對照：不加一抗，用于檢驗二抗的特異性v 內參對照：管家基因編碼的、很多組織和細胞中都穩定表達的蛋白，內參對照：管家基因編碼的、很多組織和細胞中都穩定表達的蛋白，用于檢測整個用于檢測整個WB實驗過程及體系是否正常工作，并作為半定量檢測實驗過程及體系是否正常工作，并作為半定量檢測目的蛋白表達量的標準對照目的蛋白表達量的標準對照v 空白對照：不加一抗和二抗；用于檢測膜的性質和封閉

42、的效果空白對照：不加一抗和二抗；用于檢測膜的性質和封閉的效果北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司60蛋白蛋白MarkerMarker中分子量中分子量CW0142可視型中分子量可視型中分子量CW0139藍色預染中分子量藍色預染中分子量CW0140可視型藍色預染中分子量可視型藍色預染中分子量CW0141彩虹預染中分子量彩虹預染中分子量CW0177Western中分子中分子量量CW0021Western中低分子中低分子量量CW2014北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總代理 鄭州森斯科貿有限公司鄭州森斯科貿有限公司61WBWB常用內參及其技術參數常用內參及其技術參數antibody AC-15 (ab6276) at 1/5000 dilution, Lysates/proteins at 20 ug per laneLane 1 : HeLa nuclearLane 2 : HeLa whole cell lysateLane 3 : A431 cell lysateLane 4 : Jurkat cell lysateLane 5 : HEK293 cell lysate.WB內參對照內參對照CW0081北京康為世紀生物科技河南總代理北京康為世紀生物科技河南總