1、肝星狀細胞(hepatic stellate cells,HSCs分離培養及鑒定的試驗方案 【試驗原理】在用循環灌注法去除肝膠原組織后 , 根據 HSC 內含富含脂滴 , 密度較輕 , 它與 肝臟內其它細胞在不同密度的離心液中有不同的浮密度的原理 , 采用密度梯度離 心方法 (連續性和非連續性兩種 使 HSC 存在于 一高度提純的區帶中而得以分離。 【試驗動物】雄性清潔級 Sprague-Dawsey 大鼠 (購自浙江省實驗動物中心 , 合格證號: , 體重 400500g, 常規飼料喂養 , 正常飲水 , 在分離 HSCs 前 2周每天 Vitamin A 以 200IU/100g灌胃。【試

2、劑與儀器 】主要試劑型膠原酶、鏈霉蛋白酶 (Pronase E、 Nycodenz 均為美國 Sigma 公司產 品 ,DNA 酶 I(Dnase I、 DMEM 培養干粉 (高糖型 為 Gibco 公司產品 , 鼠抗人 Desmin 抗體 SP 試劑盒為福州邁新生物工程公司產品 , 其它試劑均為國產分析純試劑。 主要儀器設備蠕動恒流泵、超凈工作臺 (2臺 、電子分析天平、超速低溫離心機、二氧化 碳培養箱、多功能動物手術臺等。【試驗方法】1、肝星狀細胞的分離制備1肝星狀細胞的分離采用改良的 Friedman 方法 , 大鼠術前禁食 1216h, 自由 飲水。2用 1%戊巴比妥鈉 40mg/kg

3、 腹腔內注射麻醉大鼠。3胸腹部皮膚消毒 , 移入超凈工作臺中。沿腹部正中線剪開腹腔 , 分離下腔靜 脈及門靜脈 , 在門靜脈距肝外 10mm 處用眼科剪斜形剪一小口 , 迅速插入自制 血管插管 , 結扎固定。4接通恒流蠕動泵 , 灌注預熱 37的 D-Hank s 肝臟灌流液 , 剪開下腔靜脈 , 此 時可見灌流液自下腔靜脈流出 , 肝臟逐漸飽滿 , 由紫紅色逐漸變成淡黃白 色。5游離肝臟 , 保留下門靜脈血管插管及下腔靜脈的標志縫線。 將游離之肝臟置 于平皿中 , 灌注預熱 37的含酶Hank s 液 I(含 0.05%的膠原酶、 0.1%鏈霉 蛋白酶溶液并調 PH 7.35,并將灌注系統進

4、液端放入平皿中 , 使流出的酶液 可進行循環灌流 , 可見肝臟變軟無彈性 , 肝包膜下出現小液泡。6倒除灌流液 , 撕去肝臟外膜 , 撕碎或剪碎肝組織 , 加入預熱 37的含酶HankS液 (含 0.05%的膠原酶、 0.02%鏈霉蛋白酶、 0.01%DNA 酶 I 溶液 并調 PH 7.35,再次消化 20min 。7經 200目濾網過濾 , 用磨錘輕輕研磨 , 并用 4的 Hank S 液沖冼。8將燒杯內細胞懸液分裝入 2只 50 ml的刻度離心管 ,550r/min 離心 8min ;吸 除上清入 2只 50 ml的刻度離心管 ,1750 r/min 離心 8min 。去上清 , 用 4

5、的 HankS液沖冼重懸 ,2管合 1定容至 10 ml。9加入 20 ml的 18% Nycodenz,將細胞懸液分裝入 6只 10 ml帶蓋的刻度離心管 中 , 每管液面覆蓋 23 ml的HankS液 ,3200 r/min 離心 15 min。吸取中間 細胞懸液層入 50 ml刻度離心管 , 加入無血清 DMEM 培養液至 50 ml,550 r/min 離心 8 min,取沉淀。10 加入預熱 37的含血清的 DMEM 完全培養基至 10ml 。2、 肝星狀細胞的鑒定1 光鏡下觀察新分離的肝星狀細胞含有豐富的脂滴 , 細胞透光度增加。2 維生素 A 自發熒光鑒定:熒光顯微鏡下觀察 ,

6、在 328 Bin 波長的紫外光激發下 , 新分離的肝星狀細胞能發出藍綠色的自發熒光 , 但在數秒內迅速減退。3 新鮮肝星狀細胞產量測定倒置相差顯微鏡下 , 使用血細胞計數板計數肝星狀 細胞產量。4肝星狀細胞活力的鑒定常規臺盼藍拒染法5 免疫組織化學 (簡稱免疫組化 法鑒定 Desmin 陽性的細胞:用鼠抗人 Desmin 抗體 ,SP 法做免疫細胞化學染色。3、肝星狀細胞純度的鑒定:倒置顯微鏡下于細胞片上隨機數 200個細胞 , 計數 Desmin 染色胞漿黃色的細胞 , 并計算純度。肝星狀細胞純度 (%=Desmin陽性的細胞/細胞總數100%。 4、肝星狀細胞的培養1原代培養用含 20%

7、(體積分數 胎牛血清的 DMEM 完全培養基稀釋細胞懸液 , 留取少量的 細胞進行細胞純度及活力鑒定。以 11051 106ml 的密度接種到 50ml 塑料培 養瓶中 , 在 37、體積分數為 5%co :、 95%潮濕空氣的 C02恒溫培養箱里培養。 培養瓶內細胞 24 h后首次換新鮮 DMEM 培養液 , 以后每 3 d換液 1次 , 培養液改為含10%胎牛血清的 DMEM 完全培養基。2傳代培養原代培養星狀細胞長滿單層后 , 吸去培養基 ,0. 25%胰蛋白酶于 37消化 1015 min。等細胞附著松動 , 顯微鏡下觀察細胞質邊緣卷起 , 間隔加大 , 便終止 消化。吸去胰蛋白酶 , 用 Hanks 液清洗 1次。加入 3 ml DMEM,反復吹打培養瓶壁制 成單個細胞懸液 , 收集細胞懸液 ,1 500 r min 離心 10 min, 離心 2次后加入含 10%胎牛血清的 DMEM 重懸 , 以 2 X 105個 /ml 濃度。注意事項(1灌注速度要恒定在 10ml/min,防止血栓的形成,影響以后的消化。(2灌注液的 PH 要準確控制在 PH 7