1、2.2 動物細胞工程 動物細胞培養新教材人教版選擇性必修三【教學過程】Teaching Process1.概念圖3.教學總結、綜合2.課堂教 學內容4.課堂練習鞏固典型習題規律總結動物細胞培養胚胎干細胞基本技術1959年，試管家兔誕生。之后，多種試管動物相繼出生。1975年，米爾斯坦（C.Milstein，19272002）和科勒（G.Khler，19461995）等創立了單克隆抗體技術。1958年，格登（J.Gurdon，1933）用非洲爪蟾進行體細胞核移植實驗，成功培育出性成熟個體。同一時期，我國科學家童第周（19021979）等開展了魚類細胞核移植工作。1951年，張明覺（1908-19

2、91）等發現了哺乳動物精子的獲能現象。1907年，哈里森（R.G.Harrison，18701959）用一滴淋巴液成功培養了蝌蚪的神經元，首創了動物組織體外培養法。1890年，希普（W.Heape，18551929）將安哥拉兔的胚胎移入比利時兔的輸卵管內，得到了兩只安哥拉兔，這是世界上胚胎移植成功的首例。動物細胞工程的發展歷程195119591890190719751978科技探索之路22014年世界上第一個用單細胞基因組測序進行遺傳病篩查的試管嬰兒在我國誕生。2017年，我國科學家首次培育了體細胞克隆猴。2006年，山中伸彌（S. Yamanaka，1962）等獲得了誘導多能干細胞。我國科學

3、家用這種細胞培育出了小鼠。1996年，世界上第一只體細胞克隆羊多莉在英國誕生。隨后多種克隆動物相繼問世。1981年，埃文斯（M.J.Evans，1941）等成功分離和培養了小鼠的胚胎干細胞。1978年，小鼠的桑葚胚被成功分割。次年，科學家分割綿羊胚胎獲得了同卵羔羊。199620061978198120142017動物細胞工程的發展歷程科技探索之路2原理和方法 生物學 生物學和 生物學操作水平 水平 水平或 水平目的獲得特定的細胞組織、器官、個體或 。分類 細胞工程和 細胞工程細胞分子細胞組織細胞產品植物動物細胞工程是指應用細胞生物學、分子生物學和育生物學等多學科的原理和方法，通過細胞器、細胞或

4、組織水平上的操作，有目的地獲得特定的細胞組織、器官、個體或其產品的一門綜合性的生物工程。可分為植物細胞工程和動物細胞工程兩大領域。發育細胞器科技探索之路2 人造皮膚的構建、動物分泌蛋白的規模化生產等，都離不開動物細胞的培養。動物細胞工程動物細胞培養（基礎）動物細胞融合技術和單克隆抗體動物體細胞核移植技術和克隆動物科技探索之路2在治療大面積燒傷時，通常采用的方法是取燒傷病人的健康皮膚進行自體移植。但對這樣的病人來說，自體健康皮膚非常有限，使用他人皮膚來源又不足，而且會產生免疫排斥反應。可以從病人身上取少量正常、健康的皮膚在體外進行培養、擴增；目前，科學家還在研究對皮膚干細胞進行培養，以獲得適合臨

5、床上使用的人造皮膚；通過細胞培養構建的人造皮膚通過細胞培養構建的人造皮膚討論：怎樣才能獲得大量的自體健康皮膚？能不能用自體皮膚的單個細胞培養出可供移植的皮膚？ 到社會中去既解決了來源不足，又不會產生排斥反應既解決了來源不足，又不會產生排斥反應1.動物細胞培養一.動物細胞工程（1）動物細胞培養：從動物體中取出相關組織，將它們分散成單個細胞， 然后在適宜的培養條件下，讓這些細胞生長和增殖。（4）培養對象：胚胎或幼齡動物的細胞較成體的細胞更易培養（2）地位：動物細胞工程的基本技術（3）原理：細胞增殖（有絲分裂）用培養的人細胞構建的人造皮膚用培養的人細胞構建的人造皮膚動物細胞培養的條件營養條件其他條件

6、無菌、無毒的環境適宜的溫度、pH和滲透壓適宜的氣體環境糖類、氨基酸、無機鹽、維生素等（5）動物細胞培養的條件1.動物細胞培養一.動物細胞工程血清中不僅含有蛋白質、氨基酸、葡萄糖、激素等多種營養物血清中不僅含有蛋白質、氨基酸、葡萄糖、激素等多種營養物質，還有激素及多種未知的促細胞生長因子、促貼附因子及其質，還有激素及多種未知的促細胞生長因子、促貼附因子及其他活性物質，能促進細胞的生長、增殖和貼附。他活性物質，能促進細胞的生長、增殖和貼附。（5）動物細胞培養的條件1.動物細胞培養一.動物細胞工程營養條件注意：注意：這里的這里的糖類不包括淀糖類不包括淀粉、蔗糖等粉、蔗糖等（5）動物細胞培養的條件1.

7、動物細胞培養一.動物細胞工程營養條件思考1:為什么培養液需要定期更換？ _思考2:如何防止培養過程中的微生物污染？ _培養液所有培養用具滅菌無菌環境定期更換培養液以便清除代謝物，防止細胞代謝物積累對細胞自身造成危害在細胞培養液中添加一定量的抗生素（5）動物細胞培養的條件1.動物細胞培養一.動物細胞工程其他條件脈動真空滅菌器脈動真空滅菌器A.無菌、無毒的環境對_和_進行_處理在_下進行操作還需要_維持適宜滲透壓的目的_-7.4維持細胞正常的形態和功能（5）動物細胞培養的條件1.動物細胞培養一.動物細胞工程其他條件COCO2 2培養箱培養箱B.溫度、pH和滲透壓哺乳動物細胞培養

8、的溫度多以_為宜適宜的溫度適宜的溫度多數動物細胞生存的適宜pH為_適宜的適宜的pHpH適宜的滲透壓適宜的滲透壓含有_和_的混合氣體的_動物細胞培養所需氣體主要有_和_O2：_CO2：_通常采用_或_O2CO2O2是細胞代謝所必需的CO2的主要作用維持培養液的pH培養皿松蓋培養瓶95%空氣5%CO2CO2培養箱COCO2 2培養箱培養箱（5）動物細胞培養的條件1.動物細胞培養一.動物細胞工程其他條件C.氣體環境組成組成培養容器培養容器培養儀器培養儀器（6）動物細胞培養的過程1.動物細胞培養一.動物細胞工程用機械的方法，或用胰用機械的方法，或用胰蛋白酶，膠原蛋白酶等蛋白酶，膠原蛋白酶等處理的方法，

9、將組織分處理的方法，將組織分散成單個細胞散成單個細胞取動物組織塊分散成單個細胞剪碎剪碎胰蛋白酶處理胰蛋白酶處理制成細胞懸液加培養液加培養液原代培養傳代培養（分瓶培養）（6）動物細胞培養的過程1.動物細胞培養一.動物細胞工程u 原代培養通常將分瓶之前的細胞培養，即動物組織經處理后的初次培養稱為原代培養。u 傳代培養將分瓶后的細胞培養稱為傳代培養。胰蛋白酶胰蛋白酶剪碎剪碎加培養液加培養液部分細胞部分細胞“癌變癌變”，無限傳代無限傳代動物細胞培養不能動物細胞培養不能最終培養成動物體最終培養成動物體原代培養傳代培養細細胞胞貼貼壁壁剝離、分瓶剝離、分瓶（6）動物細胞培養的過程一.動物細胞工程討論1：動物

10、胚胎或幼齡動物的組織、器官（細胞分化程度低，增殖能力強，容易培養）機械法用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理一段時間u為什么用胰蛋白酶、膠原蛋白酶處理？這里中酶作用是什么？由此說明細胞間的物質是什么成份？用酶制備單細胞懸液不會把所培養的細胞消化掉嗎？取動物組織塊分散成單個細胞剪碎剪碎胰蛋白酶處理胰蛋白酶處理制成細胞懸液加培養液加培養液原代培養傳代培養（分瓶培養）（6）動物細胞培養的過程1.動物細胞培養一.動物細胞工程動物組織細胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質，胰蛋動物組織細胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質，胰蛋白酶處理動物組織，可以使動物組織細胞間的蛋白質和細胞白酶處理動物組織，可以使動物組織

11、細胞間的蛋白質和細胞外的其他成分酶解，獲得單個細胞。外的其他成分酶解，獲得單個細胞。催化蛋白質水解。細胞間的物質主要是蛋白質催化蛋白質水解。細胞間的物質主要是蛋白質( (膠原蛋白等膠原蛋白等) )。長時間處理會消化細胞膜蛋白，當然會損傷細胞，所以必須長時間處理會消化細胞膜蛋白，當然會損傷細胞，所以必須控制好時間！控制好時間！討論1：動物胚胎或幼齡動物的組織、器官（細胞分化程度低，增殖能力強，容易培養）從動物體取出的成塊組織中，細胞與細胞靠在一從動物體取出的成塊組織中，細胞與細胞靠在一起，彼此限制了生長和增殖；起，彼此限制了生長和增殖；能使細胞與培養液充分接觸，更易進行物質交換能使細胞與培養液充

12、分接觸，更易進行物質交換機械法用胰蛋白酶、膠原蛋白酶等處理一段時間不可以；胃蛋白酶作用的適宜不可以；胃蛋白酶作用的適宜pHpH約為約為2 2，當，當pHpH大于大于6 6時，胃蛋白酶就會失去活性，多數動物細胞培養的時，胃蛋白酶就會失去活性，多數動物細胞培養的適宜適宜pHpH為為7.2-7.47.2-7.4，胃蛋白酶在此環境中沒有活性。，胃蛋白酶在此環境中沒有活性。u可以用胃蛋白酶處理嗎？為什么？u為什么要將組織分散成單個細胞？取動物組織塊分散成單個細胞剪碎剪碎胰蛋白酶處理胰蛋白酶處理制成細胞懸液加培養液加培養液原代培養傳代培養（分瓶培養）（6）動物細胞培養的過程1.動物細胞培養一.動物細胞工程

13、u原代培養懸浮生長類：能夠懸浮在培養液中生長增殖，會因細胞密度過大、有害代謝物積累和培養液中營養物質缺乏等因素而分裂受阻。貼壁生長類：大多數需要貼附于某些基質表面才能生長增殖（細胞貼壁）；除受密度、有害代謝物、營養物質影響外，還會發生接觸抑制。由于細胞之間有接觸抑制的特性，一般的正常細胞并不重疊干其他細胞之上生長，而是單層生長。癌細胞由于無接觸抑制而能夠繼續移動和增殖，導致細胞向三維空間擴展，發生堆積。是否接觸抑制可作為區別正常細胞與癌細胞的標志之一。取動物組織塊分散成單個細胞剪碎剪碎胰蛋白酶處理胰蛋白酶處理制成細胞懸液加培養液加培養液原代培養傳代培養（分瓶培養）1.動物細胞培養一.動物細胞工

14、程（6）動物細胞培養的過程圓球形細胞剛開始圓球形細胞剛開始鋪展貼壁生長（鋪展貼壁生長（100100）培養的動物細胞貼壁生長培養的動物細胞貼壁生長并進行有絲分裂（并進行有絲分裂（100100）細胞單層貼壁生長鋪滿瓶壁后細胞單層貼壁生長鋪滿瓶壁后出現接觸抑制（出現接觸抑制（100100）先收集細胞，制成細胞懸液，再分瓶培養a.懸浮生長類：直接用離心法收集。b.貼壁生長類：重新用胰蛋白酶等處理，使之分散成單個細胞，然后再用離心法收集。取動物組織塊分散成單個細胞剪碎剪碎胰蛋白酶胰蛋白酶制成細胞懸液加培養液加培養液原代培養傳代培養（分瓶培養）1.動物細胞培養一.動物細胞工程（6）動物細胞培養的過程比較項

15、目植物組織培養動物細胞培養原理培養基性質培養基特有成分培養結果培養目的相同點討論2：植物組織培養和動物細胞培養的比較獲得細胞或細胞產物常用固體培養基植物體葡萄糖、動物血清常用液體培養基細胞增殖細胞的全能性許多細胞快速繁殖等蔗糖、植物激素1.培養過程中細胞都進行有絲分裂，不涉及減數分裂；2.均需無菌操作，需要適宜的溫度、pH等條件1.動物細胞培養一.動物細胞工程（6）動物細胞培養的過程討論3：動物細胞培養能否像綠色植物組織培養那樣最終培養成新個體？討論4：目前使用的或冷凍保存的正常細胞通常為幾代以內？為什么？不能，動物細胞培養只能使細胞數目增多，不能發育成新的動物個體。通常為10代以內以保持細胞

16、正常的二倍體核型。1.動物細胞培養一.動物細胞工程（6）動物細胞培養的過程有關動物細胞培養的問題電鏡下的胚胎干細胞（照片經后電鏡下的胚胎干細胞（照片經后期人工上色處理，放大約期人工上色處理，放大約15001500倍）倍）2.干細胞培養及其應用（1）干細胞：動物和人體內仍保留著少數具有分裂和分化能力的細胞，這些細胞叫作干細胞。一.動物細胞工程干細胞存在于_、_和_等多種組織和器官中早期胚胎骨髓臍帶血2.干細胞培養及其應用（1）干細胞：動物和人體內仍保留著少數具有分裂和分化能力的細胞，這些細胞叫作干細胞。胚胎干細胞成體干細胞胚胎干細胞（ES細胞）存在于早期胚胎中，具有分化為成年動物體內的任何一種類

17、型的細胞，并進一步形成機體的所有組織和器官甚至個體的潛能。特點：體積小，細胞核大、核仁明0顯。取自早期胚胎。也叫做全能干細胞。一.動物細胞工程成體干細胞：存在于成體組織或器官內中。A.造血干細胞：存在于骨髓、臍帶血、外周血， 可分化成各種血細 胞和免疫細胞。也叫做多能干細胞。B. 神經干細胞：取自神經系統，可分化成神經細胞。C. 精原干細胞：取自睪丸，可分化成無數的精子。專能干細胞一般認為，成體干細胞具有組織特異性，只能分化成特定的細胞或組織，不具有發育成完整個體的能力。2.干細胞培養及其應用一.動物細胞工程（1）干細胞：動物和人體內仍保留著少數具有分裂和分化能力的細胞，這些細胞叫作干細胞。(

18、2)iPS細胞(誘導多能干細胞)的培養和應用u將特定基因或特定蛋白導入細胞u用小分子化合物誘導形成獲取方法：iPS細胞最初是由成纖維細胞轉化而來的，后來發現已分化的T細胞、B細胞等也能被誘導為iPS細胞。誘導多能干細胞優點： A. 誘導過程無需破壞胚胎。 B. iPS細胞可以來源于病人自身的體細胞，將它移植回病人體內后，理論上可以避免免疫排斥反應。2.干細胞培養及其應用一.動物細胞工程類型應用造血干細胞神經干細胞誘導多能干細胞（iPS細胞）(3)干細胞的應用有著自我更新能力及分化潛能的干細胞，與組織、器官的發育、再生和修復等密切相關。治療白血病及一些惡性腫瘤放療或化療后引起的治療白血病及一些惡

19、性腫瘤放療或化療后引起的造血系統、免疫系統功能障礙等疾病造血系統、免疫系統功能障礙等疾病治療神經組織損傷和神經系統退行性疾病（如帕治療神經組織損傷和神經系統退行性疾病（如帕金森病、阿爾茨海默病等）金森病、阿爾茨海默病等）可治療小鼠的鐮狀細胞貧血癥，在治療阿爾茲海可治療小鼠的鐮狀細胞貧血癥，在治療阿爾茲海默病、心血管疾病等領域的研究也取得了新進展默病、心血管疾病等領域的研究也取得了新進展干細胞應用面臨的問題存在存在著導致腫瘤發生的風險。2.干細胞培養及其應用一.動物細胞工程誘導多能干細胞（iPS細胞）多種體細胞iPSiPS細胞用于治療人類疾病示意圖細胞用于治療人類疾病示意圖定向誘導分化定向誘導分

20、化體外誘導小鼠成纖維細胞臨床治療人類疾病如：白血病、帕金森病、阿而茨海默病等(3)干細胞的應用2.干細胞培養及其應用一.動物細胞工程無菌、無毒營養溫度、pH和滲透壓氣體環境制備細胞懸液原代培養傳代培養動物細胞培養動物細胞培養的條件動物細胞培養的過程干細胞的培養和應用干細胞的種類、特點及應用iPS細胞的培養和應用課堂小結一.動物細胞工程 1.判斷下列有關動物細胞培養的表述是否正確。（1）培養環境中需要O2，不需要CO2 。（ ）（2）細胞要經過脫分化形成愈傷組織。（ ）（3）培養液中通常含有糖類、氨基酸、無機鹽、維生素和動物血清（ ）（4）培養瓶中的細胞需定期用胰蛋白酶處理,分瓶后才能繼續增殖（ ）一.概念檢測練習與應用（P47） 2.干細胞有著廣泛的應用前景。下列相關敘