1、大慶師范學院本科生畢業論文海藻糖的研究進展院(部) 專業生物工程學院 生物技術 研 究 方 向 微生物發酵 學 生 姓 名 武鵬仁 學 號 201101122599 指導教師姓名 郎亞軍 指導教師職稱 講 師 2015 年 5 月 26日摘 要海藻糖是一種在自然界中廣泛存在的非還原性雙糖，具有低聚糖的一般特性，化學性質穩定，能夠在熱、干燥、氧化等環境中保護生物組織和活性大分子在功能和活性，具有重要的生物學功能。海藻糖因其獨特的生物學特性而廣泛應用于食品、農業、化工、醫藥等領域。本文就海藻糖的來源、性質、制備、檢測方法及在各領域的應用進行綜述。 關鍵詞：海藻糖；性質；應用前景；檢測方法Abstr

2、actTrehalose is a widespread in nature non-reducing disaccharide, oligosaccharides having the general characteristics, chemical stability, to protect the active molecules in biological tissue and the function and activity in hot, dry and oxidation environmentIt has important biological functions. Tr

3、ehalose its unique biological characteristics and are widely used in food, agriculture, chemical and pharmaceutical. This paper reviewed on the source of trehalose, nature, preparation, testing methods and applications in various fields.Keywords: Trehalose; properties; application prospect; detectio

4、n method目 錄摘 要IAbstractII目 錄III1 引 言12 海藻糖的簡介22.1 海藻糖的來源22.2 海藻糖的結構22.3 海藻糖的理化性質32.3.1 物理性質32.3.2 化學性質33 海藻糖的制備53.1 酶合成法53.2 酵母抽提法63.3 微生物發酵法63.4 基因重組法73.5 化學合成法74 海藻糖的檢測方法84.1 蒽酮硫酸法84.2 高效液相色譜法84.3 紙層析法84.4 薄層層析法94.5 氣相色譜法94.6 酶分析法95 海藻糖的應用105.1 食品中的應用105.2 精細化工方面的應用105.3 農業中的應用116 展 望12參考文獻13致 謝14

5、1 引 言海藻糖是一種非還原性多糖，其結構是由兩個葡萄糖分子通過，-1，1糖苷鍵連接。海藻糖最早是Wingger在19世紀初從黑麥的麥角中首次分離而得到的。經過科學的不斷發展，人們發現海藻糖的存在不局限于黑麥中，它在動物、植物以及微生物體內也是廣泛存在的。科學家們在研究沙漠植物時發現，卷葉柏在干旱時幾乎死亡，吸收水分后又很旺盛；某些昆蟲，即使在高寒、高溫和干燥失水等惡劣條件下不凍結、不干死；某些咸水蝦、面包酵母和線蟲，如果將它們生物體內90%的水分脫去以后，其仍然能在獲水后迅速復活；保存在大英博物館里的蓮屬種子，150年復水后 85%都能發芽；在真空干燥密封的管里保存35年的真菌，任然能產生孢

6、子。這些生物對外界惡劣環境有特別強的抵抗力，根本原因是它們體內均含有海藻糖。海藻糖對生物體具有保護作用，能提高生物體抗干旱、抗冷凍以及抗高溫的特性。因此海藻糖的存在對生物體來說具有極其重要的意義。早期人們認為海藻糖只是能量的儲存形式，并不了解其的生物學機能。自從20世紀末，海藻糖的研究開發日益發達，市場需求量也逐步增加。但總是供不應求，目前全球海藻糖綜合生產能力平均約為每年7萬噸，而年需求量達15萬以上。因此研究應用新型設備，新工藝來滿足國內外市場具有重大意義。2 海藻糖的簡介2.1 海藻糖的來源 1832年，Wiggers 在研究分離黑麥的麥角菌時，首次發現了海藻糖，標志著海藻糖問世，在自然

7、界中動物、植物、微生物體內，都可以尋找到海藻糖的蹤跡。尤其在酵母菌、霉菌、食用菌、昆蟲等各種生命體中最為常見，目前，酵母是海藻糖生產的主要原料，也就是海藻糖的主要來源。2.2 海藻糖的結構在自然界中，比較常見的海藻糖是帶有兩個結晶水的二水化合物，它可以以多種固體形式存在，其分子式為C12H22O112H2O。20世紀初，科學家利用核磁共振技術闡述了其分子結構。海藻糖的二水化合物的分子和晶體結構通過X射線衍射分析得知，通過糖普鍵的氧原子，兩個葡萄糖分子形成對稱的空間結構，四個C12H22O112H2O單位排列形成正交晶體。經過進一步研究，海藻糖分子存在一種簡單對稱結構,若轉動葡糖基連接的角度，能

8、夠破壞這種對稱的結構。對于果糖、乳糖、麥芽糖等雙糖的結構受分子內葡糖基間氫鍵的影響，而海藻糖的二水化合物葡糖基間的氫鍵與它們不同，是通過水間接連接。從而它們的結構不同，氫鍵的平均長度變短，且結合力非常強。在低溫（-150）的條件下，通過X射線對海藻糖的無水結晶體的結構進行研究，得知其的結構和二水海藻糖的結構相似。,型，,型和,型是海藻糖的三種光學異構體，最為常見的海藻糖是,型，其結構如圖2-1、2-2所示。圖2-1 海藻糖分子的結構式圖2-2 海藻糖分子的構象式2.3 海藻糖的理化性質2.3.1 物理性質海藻糖的甜度是蔗糖的45%，熔點97，白色結晶，能溶于冰醋酸、水、熱乙醇中，含2個H2O的

9、海藻糖結晶，溶解熱為57.8kJ/mol，當加熱到130時，海藻糖失去兩分子的結晶水，變成無水晶體，熔點上升到214-216，溶解熱下降，是53.kJ/mol，如遇含水物質，無水結晶海藻糖能有效地吸收該物質的水分子，變成含水結晶海藻糖。利用這個特性，人們將無水結晶海藻糖制作成生活中常用的脫水劑。（1）抗輻射性科學家在研究海藻糖有抗輻射實驗中，通過一系列實驗和數據分析得知，DNA分子在濃度為100mmol/l海藻糖存在的條件下，能夠承受相于對照組43倍劑量的射線輻射，通過實驗得知，當有射線輻射時，海藻糖有保護DNA的功能，后來發現，海藻糖不僅僅對射線有防輻射功能，對X、紫外射線都有防輻射功能，并

10、且在一定限度范圍內，海藻糖濃度與其保護效果成正比。（2）低吸濕性相對濕度很高時，海藻糖2水結晶無吸濕性，相對濕度很低時，無水結晶有吸濕性。利用海藻糖這一性質，人們將無水結晶海藻糖當做天然脫水化合物使用，能使與它配合的物質的性質穩定地保存下來。能夠使一些食品物質在高溫干燥環境下，能夠保存水分；在潮濕水分充足下又能不吸收多余的水分影響品質.2.3.2 化學性質在自然界天然雙糖中，海藻糖是最穩定的糖，其的穩定性極強，只能夠被特異性的海藻糖酶水解，即使加熱海藻糖與蛋白質、氨基酸的混合物時，海藻糖也不發生美拉德反應，具有良好的耐熱性和耐酸性。具體穩定性如表2-1。表2-1 海藻糖的穩定性檢測項目穩定性情

11、況pH穩定性，100，24h，99%不殘存水溶液穩定性90min， 120 ， 不褐變含氨基酸水溶液的熱穩定性90min，沸水中，不褐變含蛋白質水溶液的熱穩定性90min，沸水中，不褐變水溶液長期保存的穩定性12個月，37，不褐變，不分解3 海藻糖的制備 海藻糖能夠從根本上保護蛋白質分子不變性失活，從而使生命體能夠維持生命過程和基本生物特征。許多物種對外界惡劣環境具有強的抗逆耐受力，原因是它們體內含有大量的海藻糖。同樣，自然界中還有許多糖類物質，例如蔗糖、葡糖糖，但不具備海藻糖對生物體保護作用的功能。這一獨特的功能性質使得海藻糖在生活中的作用舉足輕重，原料來源也廣泛，因此對海藻糖的研究與生產技

12、術也越來越活躍。酶合成法、酵母抽提法、微生物發酵法、基因重組法、化學合成法等是現階段制備生產海藻糖的常用方法。3.1 酶合成法 酶合成法的合成原理是以葡萄糖、淀粉、麥芽糖、寡糖等糖為底物，通過各自相對應的酶與其作用轉化為海藻糖。合成海藻糖相關的酶如表3-1。表3-1 合成海藻糖相關酶類酶存在形式海藻糖酶多種生物海藻糖合酶脂肪桿菌惡臭假單胞菌嗜熱菌海藻糖磷酸化酶Eueliot gracillisFlammtdina velutips海藻糖一6一磷酸酯酶大腸桿菌和酵母菌海藻糖一6一磷酸合酶大腸桿菌和酵母菌麥芽寡糖基海藻糖水解酶節桿菌麥芽寡糖基海藻糖合酶節桿菌 20世紀五十年代，日本科學家從大地土壤

13、中分離得到麥芽寡糖基海藻糖合酶和麥芽寡糖基海藻糖水解酶，這兩種酶能夠與多種淀粉作用，最終將淀粉轉化成海藻糖。在麥芽寡糖基海藻糖合酶的作用下，淀粉的部分分解產物可以在分解產物的末端生成具有海藻糖結構的非還原性糖；麥芽寡糖基海藻糖水解酶能從非還原性糖質中分離出海藻糖。孫長慧做過一個實驗，以淀粉為原料，利用一株產麥芽寡糖基海藻糖合酶和麥芽寡糖基海藻糖水解酶的微球菌， 在酶反應溫度30，pH值為8.0，在濃度為100 mol/L緩沖液和底物質量分數為20%底物條件下，2024h的反應時間，得到海藻糖質量濃度為53 g/L，淀粉轉化率為54%?？茖W家經過大量實驗和數據分析結果表明，溫度3840，pH值6

14、.36.7，淀粉水解液的質量分數為15%的條件是合成麥芽寡糖基海藻糖合酶和麥芽寡糖基海藻糖水解酶聯合作用的最佳條件。目前，在眾多的酶合成法生產海藻糖中，麥芽寡糖基海藻糖合酶和麥芽寡糖基海藻糖水解酶協同作用于淀粉來生產海藻糖是最為普遍使用的，具有產率高、原料回收率高等優點，比其他生產工藝較成熟。3.2 酵母抽提法在所有的海藻糖生產方法中，酵母抽提法是最原始的。其原理是從微生物發酵液中提取生產的方法，簡明的合成途徑是：在海藻糖-6-磷酸合酶催化尿苷二磷酸(UDP)-葡萄糖和6-磷酸葡萄糖的條件下得到6-磷酸海藻糖，再將產物在海藻糖-6-磷酸酯酶的催化下生產海藻糖最終成品。當生物體細胞受到惡劣環境脅

15、迫時，生物體為了緩解或消除這種脅迫作用，因此，生物體本能反應是體內大量合成海藻糖。利用這一原理，工業上為了提高海藻糖的產量，人為的適當提高溫度和高壓處理酵母，海藻糖提取率比沒處理之前顯著提高。也可以在在發酵末期一定范圍內提高溫度并且減少通風量，延時23h，海藻糖質量分數明顯增大。大量的海藻糖儲存在酵母細胞中的細胞質和子囊孢子中，如果采用破壁技術提取海藻糖，酵母細胞內的其他許多物質會與海藻糖混合，給下游的提純以及精制會帶來很多難題。所以，為了減少其他雜質的含量，破壁技術可以用滲透細胞技術來替換，通過這種方法，能夠使小分子量的海藻糖透過細胞壁，大分子量的物質不能透過細胞壁，實現海藻糖的初步分離，這

16、時，大量的海藻糖在抽提液中，接著對抽提液進行脫雜、濃縮和結晶等流程得到成品，是提高海藻糖成品純度的一個方法。3.3 微生物發酵法 由于海藻糖廣泛存在于易繁殖的微生物中，可進行液態深層發酵，因此，海藻糖生產用微生物發酵法具有獨特的優越特性。利用微生物發酵法生產海藻糖，主要的操作步驟是通過誘變、細胞融合及基因重組等方法選育出能夠高產海藻糖的菌株，在適宜的條件下進行發酵，最后采用有效分離提取技術對產物進行精制。目前，在選育海藻糖的大量菌株中，灰樹花中海藻糖含量較高。研究發現，發酵pH值控制在6.07.0，溫度控制在3040，培養時間48 h，海藻糖產量會相對較高。提高種子產率和活力，是微生物發酵法生

17、產海藻糖的關鍵所在，隨著科學技術的發展，若能夠選育出胞外積累海藻糖的菌株，則對降低生產成本會發生跨時代的變化。目前，還沒有培育出胞外積累海藻糖的菌株，有待發展。3.4 基因重組法基因重組法是最新的一種研究方法。這種方法主要有兩個目的：其一，利用先進的技術手段改進海藻糖的生產，以最大限度的降低生產成本；其二，利用基因工程技術，將能夠合成海藻糖酶的基因直接導入作物的基因中去，讓其在作物中有效表達。美國Calgene公司用基因工程的方法將葡萄糖中轉化成的海藻糖的酶基因，導入到植物當中，使其能制出海藻糖。當然，目標植物應具有產生糖的能力，并且葡萄糖轉化為海藻糖會受有關酶的控制。能夠生產海藻糖的很多微生

18、物中，均含有海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶和海藻糖-6-磷酸連接酶。例如，大腸桿菌能夠生產海藻糖，其體內含有大量的海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶和海藻糖-6-磷酸連接酶。據有關資料記載，有人已利用嗜熱古細菌克隆出了海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶和海藻糖-6-磷酸連接酶這兩種酶的基因，嗜熱古細菌常溫可培養，產酶率也高，并且在高溫下能利用直鏈淀粉或麥芽糖生產出海藻糖，目前世界上已經有公司研究出利用這一酶系產海藻糖的設備，具有很好的工業前景。3.5 化學合成法 海藻糖的化學合成法中，通常采用2，3，4，6-四乙?；咸呛?，4，6-三乙酰-1，2-脫水-D-葡糖作為反應物，在一定的反應條件下，由發生環氧乙烷加成反應生

19、成，但其制備分離困難，產率低，因此化學合成法在海藻糖的生產制備中并不多用，且生產過程中涉及較多的化學物質，在下游分離提純工序難度較大，生產成本較高。還處于不成熟階段，有待進一步研究。4 海藻糖的檢測方法4.1 蒽酮硫酸法蒽酮硫酸法在定糖方法中比較常見，蒽酮硫酸法的原理是蒽酮能與醛類物質發生脫水縮合反應，而糖類物質在硫酸的作用生成糠醛，最終產生藍綠色糠醛衍生物。其定量的依據是衍生物顏色的深淺。由于此方法是非特異性的，容易受到其他與其反應的試劑干擾。因此在用于海藻糖的檢測時，要選擇合適的提取方法。此方法偏值大，但價值便宜，因此在廣泛用于海藻糖的常規檢測。 4.2 高效液相色譜法高壓液相色譜是溶質在

20、流動相與固定相之間的連續多次的一種交換過程，與其他色譜大體相同，其特點是高效、快速，對于海藻糖的定性分析比較理想。此方法的分離依據是借助溶質在固液兩相之間的分配系數、吸附能力、親和力以及分子大小不同來造成排阻作用，使不同溶質分離。檢測樣品在柱內的保留能力用保留值來衡量。定量的依據是溶質的量與峰面積存在一定范圍內的正比關系。檢測中影響分離效果的主要因素分別是溫度、柱長、流動相、固定相以及進樣量等。C18柱和氨基柱是常用來分離糖的色譜柱。其中C18柱對同分異構體的分離效果不及氨基柱。因此對色譜柱的選擇也要根據情況來定。4.3 紙層析法紙層析法的操作最為簡單而且費用也低，所以在被廣泛應用。顯色劑和展

21、開劑的選擇是使用紙層析法的關鍵。用紙層析法檢測海藻糖的展開系統中，所需要的試劑及其體積比為：水:丙酮酸:乙醇:正丁醇為2:3:4:5；醋酸:水:正丁醇為1:2:4；水:甲酸:乙酸乙酯為5:7.5:30；水:甲酸:正丁醇為10:15:75。經過多人實驗發現，紙層析方法的洗脫劑選擇也有很大難度，然而為了避免誤差大和重現性差的問題，選擇0.1mol/L的鹽酸溶液作為該方法的洗脫劑，精確度相對較高，重現性也好。4.4 薄層層析法薄層層析法的基本原理和紙層析法的相同，也是用于對糖類進行定性分析，顯色劑和展開劑的選擇也是關鍵，但不同之處在與所用的固定相不同。薄層層析法的操作設備簡單，對中間試樣的測定和菌種

22、的選擇都很容易，與薄層層析法相比紙層析法的重現性較好，因此用于定量分析。而薄層層析法在定量分析中主要應用于分離。4.5 氣相色譜法氣相色譜法被用于分離和檢測糖組分上，分析時，需將不揮發性的糖制成具有揮發性的衍生物，三甲基硅烷基是用的最多的衍生物。與高壓液相色譜法比較，氣相色譜法操作干擾大，操作較繁瑣，重現性和準確性也較差。所以，在海藻糖的分析應用中比較少見。4.6 酶分析法酶分析法的基本原理是，由于海藻糖性質及其穩定，只能與海藻糖酶發生特異性水解，所以，首先用海藻糖酶對海藻糖水解，再用葡萄糖氧化酶過氧化物酶系統對海藻糖水解后的葡萄糖進行檢測。此方法是近些年來研究出的檢測海藻糖的新方法，其特異性

23、較高，分析成本也高。檢測時，因海藻糖酶的制備方法不同，所得海藻糖酶的種類也將不同，所以對檢測結果會產生一定的影響。在以上6種檢測方法中，高效液相色譜法最為理想，它的優點是能快速、準確的測定樣品中的海藻糖含量；缺點是此方法使用的設備價格及其昂貴。但紙層析法和薄層層析法用的設備簡單，價格適中，操作簡單，因此是目前比較廣泛應用的方法。5 海藻糖的應用5.1 食品中的應用 如今食品防腐中的食品質量安全性和穩定性是食品行業中最大的挑戰。雖然食品防腐技術比以前大有成熟，卻長時間放置，未過保質期，食品在成分上發生變性問題屢見不鮮。如將海藻糖的這一特性用于鮮蛋的保存中，將含量為3%的海藻糖與鮮蛋混合，在大約4

24、5下干燥，會產生無氣味黃色粉末，將其室溫保存，食用時再水化，水化后產品和鮮蛋差別不大。海藻糖是一種保護劑， 與其他糖類相比，海藻糖甜度較低，不會焦糖化，在人體內容易被酶降解為葡萄糖吸收，所以在食品工業上可以作為一種新型的天然防腐劑。現今好多食品加工企業已經將海藻糖廣泛應用，主要用于禽蛋類、奶類及番茄醬的保存。海藻糖還可以作為口感改良劑，將海藻糖與食鹽共同存放，能保持食品優良的口味并且改善口感。5-1是海藻糖的性質及其對應的應用表，從表5-1可以看出，海藻糖產品可以應用到各種各樣的食品和調味料中，從而可以大大改善食品的質量并增加食品的花色品種，促進食品工業的進一步發展。表5-1 海藻糖在食品工業

25、中的性質及應用性 質應 用保鮮新鮮水果、蔬菜等低甜味冰淇淋、糖果、巧克力、口香糖等低吸濕性營養糖、快餐點心、保健食品等口感改良咖啡用糖、冰淇淋、調味料等低呈色性無油蛋糕、火腿、甜餅等抗淀粉老化糯米點心、面條等抗蛋白變性肉制品、蛋制品、乳制品和面團等熱酸穩定性豆醬、茶和飲料、非油炸方便食品等5.2 精細化工方面的應用近些年來，隨著科學技術的發展，大部分的生物表面活性劑是通過生物工程技術生產的，譬如海藻糖的工業化生產，其是生物表面活性劑家族中的重要組成成員。它不僅具有良好的表面活性功能，而且也可廣泛用于紡織、日化、石油等工業。海藻糖用于紫外吸收劑、作為潔膚劑、皮膚保濕劑、口紅、唇膏的穩定劑和品質改

26、良劑，主要利用了良好的保濕性能。5.3 農業中的應用海藻糖在農業方面也大有用武之地。海藻糖存在于高等植物體中已經被科學證明，但在大多數維管植物體中海藻糖的含量比較低，因此利用外源的海藻糖來研究海藻糖在逆境條件下對植物生理功能的影響，在一定條件下，溫度越低，海藻糖的相對效應就越明顯；海藻糖也能防止植物葉綠素的降解，以維持較高的根系活力，為高鹽條件下的植物生長速率和干物質的積累提供了保障。另外，把海藻糖合酶基因導入植物中并使其在作物體內表達，將來也許會培育出一種能抗干旱、抗嚴寒、耐鹽的新品種作物。而海藻糖對嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌菌體細胞的保護作用的研究表明：在冷凍干燥過程中，被海藻糖保護的細胞存活

27、率分別能達到75%和33%左右，而對照分別為19%和11%。 海藻糖廣泛的引用于生活中各個領域，其中主要應用于食品、農業、化妝品、醫療和保健品等方面，如今，科學技術突飛猛進，將來海藻糖的應用會越來越廣，生產成本會越來越低。6 展 望利用植物生產海藻糖是最有可能得到廉價產品的方法，國內外科學家正在進行轉基因植物的研究，因此應加強運用分子生物學研究開發海藻糖制備新工藝。對于海藻糖保護生物分子的作用機制，目前3個假說都不能作出完美的解釋，在今后的研究中應結合海藻糖晶體結構、物理構象和化學特性深入研究其保護作用機制。隨著以淀粉為底物酶法生產海藻糖技術的成熟，海藻糖的價格大幅度降低，已由原來的20030

28、0美元kg降為23美元kg，海藻糖價格的降低，使其引用范圍擴大，廣泛地應用于食品領域，故應深入研究海藻糖的功能特性，進一步擴大在食品中的應用，如對人體腸道調節機制，作為食品保鮮劑的保鮮機制和技術的研究等。 參考文獻1 周青峰.海藻糖在食品加工上的應用.中國食品工業.1996,18(2):22-23.2 葛文光,于曉雨,唐傳核.海藻糖提取工藝的研究.食品科學,1998,19(5):21-24.3 趙曉峰,吳榮書.海藻糖的功能特性及其應用J.廣州食品工業科技,2004,20(2):151-154.4 Elbein A D.The metabolism of trehaloseJ.Carbohydr

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