1、不同菌株固態生料混合發酵棉籽粕和菜粕（1）實驗材料基本原料：棉粕，菜粕，玉米培養基原料：牛肉膏，蛋白胨，NaCl，酵母膏，葡萄糖，瓊脂，蒸餾水，酵母浸膏，K2HPO4，檸檬酸氫二銨，無水乙酸鈉，Tween80，MgSO4·7H2O，MnSO4·H2O使用儀器：分光光度計，振蕩器（振蕩頻率120130次/min往復)恒溫水浴，具塞三角燒瓶:100,250 mL，容量瓶:25 mL(棕色)，吸量管:1,3,10 mL，移液管:10,50 mL，漏斗:直徑50 mm，表玻璃:直徑60 mm。檢測試劑和藥品：異丙醇，正己烷，冰醋酸，苯胺，鋅粉，3-氨基-1-丙醇，氯化鈀，羧甲基纖維

2、na（2）菌株準備：（3） 培養基的制備牛肉膏蛋白胨培養基( 培養芽孢桿菌) : 牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g( 固體培養基加瓊脂18 20 g) ，蒸餾水1 L，pH 7. 0 7. 2，120滅菌30 min。YPD 培養基( 培養酵母菌) : 酵母膏5 g，蛋白胨10 g，葡萄糖20 g( 固體培養基加瓊脂18 20 g) ，蒸餾水1 L， 120滅菌30min。MRS 培養基( 培養乳酸菌) : 蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，葡萄糖20 g，酵母浸膏5 g，K2HPO4 2 g，檸檬酸氫二銨2 g，無水乙酸鈉5 g，Tween80 1 mL，MgSO4·7

3、H2O 0. 58 g，MnSO4·H2O0. 25 g( 固體培養基加瓊脂18 20 g) ，蒸餾水1 L，pH 6. 2 6. 8， 120滅菌30 min。PDA 培養基( 培養黑曲霉) : 將馬鈴薯去皮切成小塊，稱取200 g 置于鍋中，加水1 L 煮沸約30 min，6 8 層紗布濾成清液，濾液中加入葡萄糖20 g( 固體培養基加瓊脂18 20 g) ，補充水分至1 L，加熱至融化， 120滅菌30 min。（4） 發酵條件：原料棉籽粕粉碎過40 目篩，將棉粕、菜粕，玉米粉按4 4 2 比例混勻 ，料水比1 0. 8，接種量5%，每組設兩個個重復置于500 m l三角瓶中靜

4、止培養24h，48 h，72h后取出，于50下烘干，粉碎分析測定。（5） 實驗結果和分析a測定硫代葡萄糖苷（下面）b測定棉酚含量（下面）c測定粗蛋白（按照教科書）d測定粗纖維（按照教科書）飼料中游離棉酚的測定方法2 原理在3-氨基一1一丙醇存在下用異丙醉與正己烷的混合溶劑提取游離棉酚，用苯胺使棉酚轉化為苯胺棉酚，在最大吸收波長440 nm處進行比色測定。3試劑和溶液除特殊規定外，本標準所用試劑均為分析純，水為蒸餾水或相應純度的水。3.1 異丙醇C(CH3)2CHOH,HG 3-1167)3.2 正己烷3.3 冰乙酸（GB676）3.4 苯胺 (CsH,NH,GB6 91):如果測定的空白試驗吸

5、收值超過0.022時，在苯胺中加入鋅粉進行蒸餾棄去開始和最后的10%蒸餾部分，放入棕色的玻璃瓶內貯存在(0-4)冰箱中，該試劑可穩定幾個月。3.5 3-氨基-1-丙醇(H2NCH,CH2CH2OH）。3.6 異丙醇-正己烷混合溶劑:6:4(V /V )。3.7 溶 劑A:量取約500m L異丙醇、正己烷混合溶劑(3.6),2mL3-氨基一1一丙醇(3.5),8m L冰乙酸(3.3)和50 mL水于1000 mL的容量瓶中，再用異丙醇一正己烷混合溶劑(3.6)定容至刻度。4 儀器、設備4.1 分光光度計:有10 mm比色池，可在440 nm處測量吸光度4.2振蕩器（振蕩頻率120130次/min

6、往復)。4.3 恒溫水浴4.4 具塞三角燒瓶:100,250 mL4.5 容量瓶:25 mL(棕色)4.6 吸量管:1,3,10 mL4.7 移液管:10,50 mL.4.8 漏斗:直徑50 mm.4.9 表玻璃:直徑60 mm5 試樣制備采集具有代表性的棉籽餅樣品，至少2kg，四分法縮分至約250g，磨碎過2.8m m孔篩，混勻，裝人密閉容器，防止試樣變質，低溫保存備用。6 測定步驟6.1 稱取1-2g試樣(精確到。.001 g)>置于250 ml具塞三角燒瓶(4-4)中，加入20粒玻璃珠，用移液管(4.7)準確加入50 mL溶劑A(3.7)，塞緊瓶塞，放入振蕩器(4.2)內振蕩1 h

7、(每分鐘120次左右)。用干燥的定量濾紙過濾，過濾時在漏斗(4.8)上加蓋一表玻璃(4.9)以減少溶劑揮發，棄去最初幾滴濾液，收集濾液于100 mL具塞三角燒瓶(4.4)中。6.2 用吸量管(4.6)吸取等量雙份濾液5-10 mL(每份約含50100 yg的棉酚)分別至兩個25mL棕色 容量瓶(4-5)a和b中，如果需要，用溶劑A(3.7)補充至10 mL。6.3 用異丙醇一正己烷混合溶劑(3.6)稀釋瓶a至刻度，搖勻，該溶液用作試樣測定液的參比溶液。6.4 用移液管(4.7)吸取2份10m L的溶劑A(3.7)分別至兩個25m L棕色容量瓶(4.5) a。和b。中。6.5 用異丙醇一正己烷混

8、合溶劑(3.6)補充瓶a。至刻度，搖勻，該溶液用作空白測定液的參比溶液。6.6 加2.0 m L苯胺(3.4)于容量瓶b和中，在沸水浴(4.3)上加熱30min顯色。6.7 冷卻至室溫，用異丙醇一正己烷混合溶劑(3.6)定容，搖勻并靜置1 h.6.8 用10 mm比色池，在波長440 nm處，用分光光度計(4.1)以a。為參比溶液測定空白測定液b。的吸光度，以a為參比溶液測定試樣測定液b的吸光度，從試樣測定液的吸光度值中減去空白測定液的吸光度值，得到校正吸光度A。7測定結果7.1計算公式游離棉酚×106式中：X游離棉酚含量（mg/kg）；A校正吸光度；m試樣質量（g)V測定用濾液的體

9、積（mL）；a質量吸收系數，游離棉酚為62.5 7.2 結果表示每個 試 樣 取2個平行樣進行測定，以其算術平均值為結果。結果 表 示 到20m g/kg.7.3 重復性同一 分 析 者對同一試樣同時或快速連續地進行兩次測定，所得結果之間的差值在游 離 棉 酚含量小于500m g/kg時，不得超過平均值的15%;在游 離 棉 酚含量大于500m g/kg而小于750m g/kg時，不得超過75m g/kg;在游 離 棉 酚含量超過750m g/kg時，不得超過平均值的10%分光光度法測定硫代葡萄糖甙1 方法原理加入分散劑羧甲基纖維素鈉溶液，硫甙與氯化鈀反應生成有色硫甙鈀溶膠清液。硫甙含量越高，

10、溶液顏色越深。因此硫甙含量可通過比色定量。2 實驗與方法21 試劑與儀器211 試劑8mmolL氯化鈀；015 %羧甲基纖維素鈉溶液。其它試劑均為分析純。212 儀器微機化分光光度計，四孔或六孔恒溫水浴鍋。22 測定步驟準確稱取經研碎的油菜籽或菜餅100mg，移入10ml具塞刻度試管中，沸水浴中干蒸10min，加沸蒸餾水68ml，再蒸煮30min。取出冷卻后定容至10ml，過濾。取濾液2ml于10ml比色管，加4ml 015 %的羧甲基纖維素鈉，搖勻后再加2ml 8m mol1的氯化鈀顯色溶液，在22±3放置2h，在微機化分光光度計540mm 處用lcm 比色皿，以氯化鈀 羧甲基纖維素鈉空白溶液作參比溶液，測其消光度.23 標準曲線的制作準確稱取100mg，150mg,200mg,250mg,300mg還未發酵樣品，根據以上測定步驟進行測定，以樣品質量為橫坐標，消光度為縱座標作標準曲線(圖1)（已知體積一定，樣品質重量和硫苷含量