1、水稻香味的起源和進化在水稻作物中，香味是評介其品質的一個重要參數，雖然甜菜堿醛脫氫酶基因（BADH2）的起源和進化在這個特征下還不清楚。我們假定廣泛存在8個BADH2勺非功能等位基因表明，這些基因具有不同的地理和遺傳起源。盡管香味特征有多個起源，單一 等位基因badh2.1在幾乎所有香稻品種占主要地位，包括巴斯馬蒂和茉莉花。單體型分析，使我們能夠建立一個粳稻品種群 badh2.1等位基因單一來源并使這個等位基因從粳 稻品質滲入秈稻品種中。巴斯馬蒂樣的種類，不論其香味基因的表型，都與粳稻原始種 類一樣，跨越了 BADH側翼的5.5MB區域，展示了巴斯馬蒂和粳稻基因庫品種之間密切 的進化關系。這些

2、結果表明了水稻品種之間香味的關系，并對認為水稻香味特點起源于 秈稻的傳統假說提出了挑戰。最近的研究表明，亞洲栽培稻（Oryza sativa ）是幾個不同的遺傳組組成，在這些遺 傳組中，一些等位基因對關鍵馴化和糧食品質性狀負責。由于復雜的水稻進化史，這些 基因變異的起源是怎么樣通過高度不同的水稻亞種生存下來，在水稻生物進化中任然是個核心問題。香味被認為是最重要的糧食稻米品質性狀之一，因為它是決定市場價格的關鍵因 素，同樣關系到地方和國家的地位（1,2）。對水稻香味基因的遺傳基礎進行調查研究， 發現了水稻8號染色體上的一個單一位點與水稻香味有關（3、4）。精細定位（5-7） 和隨后的序列分析鑒定

3、甜菜堿醛脫氫酶基因，BADH2與香味表型有關命名如下（8）。把功能基因的突變創建隱性badh2.1等位基因描述為在第七外顯子基因處三個核苷酸多 態性（SNP9和8 - bp的缺失，導致了密碼子的提前終止以及假定存在縮短的BADH2S白（9）。其他序列比對已被用來描述這種復雜的突變（10, 11）。因此，badh2.1突變 被稱為功能核苷酸多態性（FNP）。最近的調查各種不同的香味種質，支持 badh2.1與香 味有關（10, 12, 13）,一個有關香味與非香味主要基因的轉變實驗，已經顯示消除了香味（14），確認BADH在水稻種是主要香味遺傳決定基因。在香米品種中，100多種容易揮發的物質已經

4、被檢測到，2 -乙酰-1 -吡咯啉（2AF） （15, 16）是最主要的化合物對香米品質其主要作用。這種化合物在水稻植物除根以外 的所有器官中產生，含量非常低，人們能夠立即在密集種植或者碎葉組織中發現，以及 在蒸煮過程或者以后或之前的谷物中發現（17）。然而2AP的化學合成途徑還沒有成功，BADH催化r-氨基丁醛的氧化（AB-ald; a 2AP的前身）,于是非功能等位基因在AB-ald 和其循環物中吡咯啉積累，導致 2AP的合成的增強。中國自古已經認識到（19，20）亞洲栽培稻（O. sativa）分為兩個主要品種群體，秈 稻和粳稻（談到品種組時用大寫）。用15種同工酶標記能 夠進一步的把這

5、兩個主要群體 分為遺傳上的六個不同的亞群，這和公認生態型是一致的（21）.隨后用SSRs（22） andSNPs （23）標記分辨出了和上面的群體差不多 5種分界線清楚的遺傳群組：即秈稻，澳 大利亞稻，溫帶粳稻，熱帶粳稻和芳香稻（提到亞群時小寫）（圖1）。系統進化分析法和Fst顯示構成粳稻品種群的芳香稻，溫帶粳稻和熱帶粳亞群之間有密切的進化關系； 然而秈稻，澳大利亞稻亞群具有不同的祖先，并作為秈稻品種組成員（22, 23）。盡管它的名字怎么樣，芳香亞群的表型多樣，既包括香型也包括非香味型。為了避免混淆， 從今以后我們將用其同工酶的名字命名芳香亞群，簡稱V組（24）。水稻香料新品種已經確定至少包

6、含三個不同的亞群，包括v組（即巴斯馬蒂和'沙德里品種），秈稻（即茉莉品種）與熱帶粳稻。在調查各種不同的新型香米 中，幾乎都含有badh2.1等位基因，證明這個等位基因是在不同香稻中普遍遺傳的（9, 10, 11, 12）。最近，BADH2基因的第二個突變位點 badh2.2，被證明與來自中國的種 質資源有有限的聯系。有證據表明有額外的突變可能導致 2AP的合成來自一個嚴格的研 究，包括主要來自東南亞的已經檢測到幾個新香料種質資源多樣化小組，這已使2AP水平升高，但沒有攜帶badh2.1等位基因（12）。考慮到單個基因主要是在負責水稻的香 味，這項研究的目的主要是在基因不同的水稻亞群之間

7、研究這個等位基因的起源和探究 它的祖先。我們同樣也把BADH中主要負責獨立遺傳，香味基因定位的基因的額外功能 突變作為研究對象。結論badh2.1等位基因在不同的水稻種質資源中出現的概率。 我們曾在280種野生稻（普 通野生稻）中觀察badh2.1等位基因的出現頻率，發現它不在所有野生基因型中，除了 一個單一位點雜合的等位基因外（表 1）。這種野生插入位點顯示了馴化水稻的幾個特 征，包括白色果皮，表明這是栽培稻香味品種和野生稻近交的結果。共收集調查了176種不同的栽培稻種類，這些栽培稻的不同亞種的身份發現是通過一套全基因組SSR和SNP分子標記確定的（22,23）。總之，badh2.1等位基因

8、在這些種類中被檢測到17次（10%），香味基因在v組中出現的頻率最大，在溫帶稻和澳大利亞稻中出現的頻率最小（表1）badh2.1等位基因的起源。考慮到在秈稻還是在粳稻品種群體中檢測相同badh2.1等位基因，我們的目標是檢測 badh2.1等位基因起源于哪個種類。為了解決這個問題， 我們檢測了一個包含242個水稻品種的的BADH淫基因，包含起源組和擁有BADH基因 的額外加入組（表si）。在5kb的對齊基因系列中，我們發現106個SNP標記的系列插 入缺失和SSR多態性，其中54個已經顯示出頻率大于5%.。這些多態性被用于構建 8 個基因單體型（GH，以及這些單體基因型被明確的分成兩個不同的小

9、組（圖 2a，表 s2）。在第一組中，粳稻品種組Jap_GH）的所有品種都攜帶了野生類型的等位基因，然 而絕大多數（74%的種類在第二組中都是來自于秈稻。盡管亞種的種類不同，每一個 插入系列都在Jap_GH檢測到了 badh2.1基因，在Jap_GH中，香味種類基因僅僅在編碼 badh2.1等位基因的FNP中和原始非香味基因不同（在圖2a中用黃色顯示的部分）。這 些數據支持badh2.1等位基因在像粳稻型遺傳背景的品種中有單一的起源。來自秈稻品種組攜帶有badh2.1等位基因的的所有香稻品種與 Jap-GH形成集群， 形成一個這些品種基因和基因組表型系統之間明顯的矛盾。如果秈稻品種能檢測到具有

10、秈稻遺傳背景環繞BADH2基因一樣的粳稻DNA特定區域，這種不一致就能夠得到很好的 理解。然后，在我們這個242個亞洲栽培稻品種的BADH基因的跨度上游3.2MB和下游 2.1MB的基因組區域擴增24個位點系列，用以擴寬我們對單基因表型的分析。在這個 BADH側翼的5.3MB的范圍內，總的有426個SNP標記的插入缺失，在一致的13KB區域 內確定了 SSR標記的多態性。其中271個多態性的出現率大于5%從這些數據中，78 個多態原始信息（AIPs）被找到并且用于擴增單體型（見方法和材料，表 S3）。這些擴增單 體型被稱為單體擴增一致系列顯示出六類大的單體型（圖2b）o這些擴增的單體型和基因單

11、體型是一致的，所以含有badh2.1基因插入系列都有BADH基因周圍粳稻的DNAT 增區域。在秈稻品種中有 24個攜帶等位基因badh2.1，粳稻區域被上游650KB和下游 330KB的關鍵重組位點被擴展，其側翼區和秈稻的原始擴展單基因表型是一致的（圖2B）o 這支持了 badh2.1等位基因是經過基因滲入秈稻種類的假說。第v組種類攜帶badh2.1等位基因擴展單倍型和原始粳稻品種一樣，含有一個擴展 的單基因型，除了 FNP和在14、30、69三個位點上的三個特殊多態型（圖 2B中綠色標 注部分）。這三個FNP則翼的多態位點以及像粳稻品種那樣的區域，都被檢測到在所有 的秈稻插入位點攜帶badh

12、2.1等位基因。來自緬甸單一野生型種類基因 badh2.1在后代 是1:2:1的雜合表型，并且單基因表型分析確認了 攜帶有badh2.1等位基因的染色體同樣含有上述V組的三個多態型。因此，我們能夠在野生型雜合品種上追蹤badh2.1等位基因的祖先和所有秈稻香味品種來自 v組的原始類型。有幾個非香味粳稻品種和Ind_GH集群形成團體，這些是由秈稻非香味品種構成（圖 2A）。這些來自粳稻的非香味品種包含了像秈稻基因組一樣包圍 BADH2基因的區域，并 且所有顯示重組都回到粳稻原始類型的側翼區（圖 2B，粳稻重組）。這為一定數目的包 含了 BADH2基因的粳稻品種和lnd_GH形成的集群提供了很好的

13、解釋。在badh2.1等位基因上，核酸多樣性的減少和連鎖不平衡的提高。為檢查圍繞badh2.1基因的選擇證據，我們分析了這個 242個品種的BADH基因的核苷酸多樣性。 我們對比攜帶野生型基因和bdha2.1等位基因的5kb插入系列之間的BADH基因的排列 系列的核酸多樣性。攜帶香味基因的 badh2.1等位基因和非香味基因品種相比，在多樣 性方面平均降低了 97.4% （表2）。擴展單倍型純合子（EHH評估了這個可能性：兩個隨機選擇的基因組區域的遺傳 是相同的，允許功能突變導致遺傳距離的增加的連鎖不平衡（LD）衰變測量法（25）。在我們的種子資源組，通過比較香味基因（badh2.1）和非香味

14、基因品種的擴展單體型， 我們為BADH2基因計算了 EHH攜帶香味基因（badh2.1）的品種顯示了大范圍圍繞 FNP 的擴展LD,然而LD圍繞的野生型等位基因減少很快（圖 3）。當LD的程度在包含野生 型或者badh2.1等位基因的各個亞種中對比時，觀察到了相同的模式（圖s1）°badh2.1, 核酸多樣性顯著減少，加上圍繞這個等位基因的連鎖不平衡區域的擴寬，為badh2.1 FNP. 的強陽性選擇提供了證據。BADH2付加突變基因。BADH2付加突變基因有可能導致2AP的合成，BADH基因在 26個香味基因品種中，這些系列沒有任何先前所描述派生賦予香味等位基因（12）。先前242

15、個品種中的26個系列比對顯示8個非同義替換的多態型，其中 4個移碼誘導缺 失多態和其中一個是SNP形成提前終止密碼子，所有這些在縮短了的BADH蛋白質中都 是公認了的（圖4A,表s4）。其他三個潛在功能多態性,包括3 - bp的插入，編碼區 兩個不同SNPs.雖然其中的幾個多態性僅僅在一個單一插入位點發現并確認， 在香味基 因插入位點找到4個，這些多態性看上去有某些地理學上的聯系 （圖4B）。迄今為止， 我們還不能確定兩個插入位點候選功能突變能夠為 2AP的水平提高做出解釋。討論水稻香味基因的起源。 從來自亞洲各地不同的水稻種質資源大范圍的遺傳和地理 上，這項研究展現了 BADH基因多樣性的深

16、度研究。攜帶badh2.1等位基因的香味插入基因和非香味基因插入系列相比，顯示出核酸多樣性的急劇減少以及連鎖不平衡的提 升，這和badh2.1等位基因強陽性選擇是一致的。badh2.1等位基因選擇強度和這個報 道水稻基因控制谷物多態性特點的報道的相似（如wx, rc, gs3 ）（ 26-28 ）。單體型分析，使我們能夠證明badh2.1等位基因在粳稻品種群體遺傳背景產生。擴 展單體型分析顯示粳稻基因組區域的明確基因滲入，在所有秈稻香味基因插入系列中夠 包含badh2.1等位基因，包括茉莉花品種。所有香秈稻同樣擁有被確定為v組亞群的badh2.1等位基因側翼的三個多態型，表明這些重要的谷物性狀

17、等位基因起源于v組亞群（即Basmati巴斯馬蒂）并被滲入秈稻品種（即 Jasmine，茉莉花）。在69位點多態性的起源以及香味插入 V組都是原始的和固定的，所有熱帶粳稻插 入位點都攜帶badh2.1等位基因。這些表明：（1）badh2.1等位基因可能來自v組和熱 帶粳稻的后代，第五組的兩個特定基因多態性（14和30位點，圖2B）來自第五組后代 的分離，并且基因組區域含有badh2.1等位基因和下游多態位點（69）可能是從v組滲 入到熱帶粳稻中。相同的序列延伸區域兩側BADH基因在V組和熱帶粳稻插入之間阻止 了斷點檢測重組，這將定義一個從 v組到熱帶粳稻的滲入體系（反之亦然）。從本研究的證據表

18、明，亞洲栽培稻從原始祖先引種馴化后，badh2.1等位基因被選定為一個從頭突變，也許粳稻亞群以后的分化會引起等位基因頻繁出現在v組以及溫帶粳稻上難以發現的低頻率。在我們收集的280不同的插入系列的來自亞洲的澳普通野生 稻/澳野生稻，我們發現僅僅一個來自緬甸的單一位點在badh2.1等位基因是雜合的。這些插入位點的系列分析顯示，在v組香味基因品種染色體攜帶 badh2.1等位基因在秈 稻DNA序列邊緣包含3個顯著多態性固定位點。然而badh2.1等位基因被確定在其他來 自東南亞的水稻種質中（29-31），很可能這些有代表性的原始等位基因滲入野生品種 中并且在栽培稻的附近微弱的生長。等位基因從亞洲

19、栽培稻侵入野生品種已經多次報道 和現在認為是一個普遍存在的現象（32.33 ）。這項研究改進了我們對亞洲栽培稻種類之間基因組聯系的理解和進一步明確亞洲 栽培稻的進化歷程。來自v組的巴斯馬蒂品種經常被錯誤的認為是秈稻品種的一個成員 （34-36）。然而來自秈稻和v組的品種廣泛的種植在亞洲南部和中部，并有可能延長， 其形態是細長谷物粒，研究人員早就注意了這兩個品種之間高度的雜種不育現象（37-40 ）。Glaszmann通過同工酶標記顯示為雜交不親合和提出了一個假說，V組和其他秈稻品種是明顯不同的，分組和粳稻品種更接近（21.24 ）。亞洲栽培稻的基因多樣性附加檢測是使用葉綠體標記，核酸SSRsf

20、fi SNPs獨立決定，V組亞群是一個和粳稻品種關系很近的獨特的遺傳實體(22,23,41 )。我們對這項研究的單體型分析表明V組品種，香型和非香型，和原始粳稻插入系列形成集群，兩者都跨度整個BADH基因和8號染色體5.3MB的被研究區域。盡管它的形態相似和地理分布與秈稻重疊，在基因上是粳 稻種類的一個成員，這為V組提供了進一步的證據。有趣的是，在南亞V組和秈稻品種的重疊分布區域可能為主要的香味基因進入秈稻品種提供了一個通道。香味水稻的獨立起源。水稻品種顯示的是提高了 2AP的位置，但是缺少任何已知 的BADH2勺非功能等位基因，為BADH上的額外香味等位基因的存在提供了可能性 (12)。 對

21、26個缺少香味品種的分析，在預計改變 BADH2蛋白的編碼區域找到了 8個多態性。 就像前面所述，只有全長的BADH2樣本，才能產生完整的503-aa蛋白質，能夠抑制2AP 的生產功能(140).在這個研究中確定的8個多態位點的4個(等位基因badh2.3 - 2.6 )， 被推測為引起轉錄提前終止，這將推定去除蛋白質功能和導致香味基因的不復存在。這 些所有突變導致BADH2蛋白質在形成催化和/或者底物結合區域的關鍵殘基之前縮短(14)。此外，badh2.7等位基因，被6個澳大利亞品種共有，同樣被推測為消除蛋白 質聚集區域復制體的縮短。其他 3個位點(2.8-2.10 )，是額外的氨基酸位點(

22、2.8 ) 或氨基酸替代位點(2.9-2.10 )。盡管這些香味基因和BADH基因突變位點的聯系，進 一步的工作是確定這些突變對 AP積累程度的影響。BADH等位基因上品種之間攜帶相同等位基因突變點的地理連系表明香味基因的選擇在不同的地理區域、多種情況下是獨立的。有趣的是，我們現在發現對高2AP生產率負責的主要等位基因，在水稻是來自于粳稻不同種類，這看起來好像其他的香味基因是 來自于其他的秈稻種類一樣，比如 badh2.7等位基因，他是在幾個澳大利亞品種中找到 的。這些以及其他的結果表明，V組和澳大利亞系列擁有有用的在水稻改良方面未得到 充分利用的等位基因(22, 27, 47, 48)。26

23、個香味品種缺少任何一個先前提到的香味識別基因，我們能夠在編碼或者啟動區域找到兩個品種沒有突變，預計將改變 BADH蛋白質或其表達。因此，這些插入位點可 能包括其他地方的遺傳病變點在代謝途徑上控制2AP的合成；映射實驗正在進行用以檢測這個假說。負責香味的額外基因的識別能夠為改變水稻基因的品質適應不同文化的需 要提供機遇。水稻BADH基因更廣范圍的馴化和分化。在水稻種已經有記載一個在基因方面與水 稻馴化和谷物質量改進相關的多功能等位基因。在其中一些等位基因位點似乎是從直立 型野生種選擇的，然而其他的是再次從栽培類型基因庫中選取的(42.43 )。無論他們起源于哪里，這些等位基因在亞洲栽培稻品種之間

24、要么是獨立的要么變得廣泛播種。被秈 稻和粳稻同時享有派生等位基因許多特點在一個亞群中顯示單一等位基因來源，符合滲入過程。RC等位基因，在現種亞洲栽培稻中98%是一個白色果皮基因，作為一個馴化相 關基因的例子，在粳稻品種遺傳背景中傳到其他種類時形成，即基因不同亞群間形成（27）。在秈稻不同品種中，RC等位基因滲入的平均大小是 1MB和在這個研究中所述 的badh2.1等位基因漸滲大小差不多。同樣地，在 GS3基因突變點擁有長粒谷物來源的 秈稻祖先，隨后滲入到其他栽培稻中（26）。在這個研究中，我們發現了 badh2.1等位 基因的進化歷史也屬于這個類型。 這些等位基因通過漸滲雜交的過程能在不同的

25、水稻亞 群之間轉移，在早期栽培稻高異原雜交率和物理距離的不同的栽培稻之間得到簡化，結 果是人口的膨脹和人類的遷徙（42, 44 - 46）。值得注意的是，盡管明顯的重要性雜交和 基因間的移動，反力量還是維持了不同亞洲種之間的遺傳分歧。解決這一悖論，需要對 亞群隔離的催成關鍵因素作進一步的研究，同樣更進一步對不同組之間的遺傳交換動力 學的研究提供方法。材料和方法植物材料。我們的種質庫又280種澳普通野生稻和來自38個國家的242中亞洲栽 培稻組成。我們同樣從先前的研究中獲得了 26個缺少badh2.1等位基因香味品種（12）。 在表S1中是這個研究中用到的插入系列的全部名單。所有未經報到過的亞洲

26、栽培稻都 是用SSRs標記檢測從而確定他們的亞群。DNA提取，PCR和測序。DNA提取是利用醋酸甲-SDS處理葉組織和處理精種子。 badh2.1的標記功能是用種質基因遺傳型。對于基因單體型分析，8個位點約700bp的擴增物測序是BADH2基因的編碼區域，形成5kb的排列系列。延長單體型分析，24個地 區進行測序，跨度BADH2基因上游3.2MB和下游2.1MB范圍，形成超過13kb的排列系 列。先前描述MITE多態性在在栽培稻同樣是遺傳的。表 5是32個引物序列的全部。康 奈爾大學生命科學中心的核心實驗室 PCR產物是在ABI Prism 3700/3100 DNA分析儀上 純化和測序的。序

27、列排序是用 Codo nCode定位儀，末端擴增產物被調整以除去低質量序 列。單獨和不確定序列在必要的情況下被重新測序。在缺少任何已知的非功能等位基因 的BADH插入位點中找到非同義多態，為確定這些他們被重新測序很多次。2AP表型。用改進的方法二氯甲烷萃取2AP（52）.化學合成2AP是由日本Dr.T.Yoshihashi提供的（日本茨城，日本國際研究中心的農業科學）以及用來量化2AP樣品。每個樣品抽提和分析是在六個不同的場合以及至少三個復制的情況下進行。BADH區的單體型和遺傳多樣性分析。在242個亞洲栽培稻插入位點BADH基因編 碼區域的八個擴增產物排序被導入 TASSEL?序提取所有多態

28、型，頻率在 5%以上，在構 建的單體型基因樣本中（表si）.在20249280位點的高度多態性SSR既沒有延長也沒有 縮短（TA11 - 14） （TA6- 8），這和粳稻品種和秈稻品種分別是一致的，如果等位基因比8個重復序列多則標記“1”少于這標記“ 0”總的8個基因單體型是從238個品種推導 出的，其中4個重組單基因型沒有包含在圖2A中。Bayesian集群結構被用來分析單基 因型和在2個集群中得到的最高的可能性，用于標記粳稻單基因型集群Jap_GH）和秈稻單基因集群（Ind_GH）對于擴展單體型分析，我們在 242個亞洲栽培稻中的BADH2基因側翼測定了 24區 域，如上所述（表S5）。

29、TASSEI被用來提取5%以上抽樣本216多態性的頻率。為了減 少單倍型數，我們采用了以下標準選擇 AlPs:粳稻品種和秈稻品種之間必須具有顯著的 差異（P < 0.00003），在這個品種中出現頻率高于 20%來自16個擴展序列的78個多態 型中，FNP MITE多態性達到這個標準，見圖 2B、和表S3中。用前述的方法（25），242個亞洲栽培稻的BADH2側翼的24個位點區域的多態性數 據被用來計算EHH圖1 :亞洲栽培稻亞群結構。來自169個核SSRS標記的無根連接樹。枝條顏色代 表葉綠體單基因表型。自助值（共100個）是表示在分支點，這樹清楚地說明了品種群 之間的兩個主要分支（秈

30、稻和粳稻），這進一步細分為5個水稻亞群：秈稻，澳大利亞， 熱帶粳稻，粳稻溫帶和 V組（芳香）。經許可復制和修改。圖2 : BADH地區單倍型基因分析。（A） BADH基因單體型。序列讀取242個亞洲 栽培稻的整個BADH2基因，所有多態性（頻率>5%）為串聯，用于創建8個基因的單倍 型。每個單倍型字母都代表 SNP位點的核苷酸選擇性。數字表明了一個刪除的大小（0為沒有刪除），每個多態性的相對位置表示沿 BADH基因模型，表型的單體型的編號1 至8和香味型是對應的以及來自擁有單體型的亞群的插入數。兩個基因單體型集群確定：粳稻基因單體型的群集（Jap_GH）和秈稻基因單體型集群（Ind_GH）.。藍細胞代表Jap_GH多態性特點，紅色代表lnd_GH細胞的特性。badh2.1 FNP描繪灰色/黃色，黃色代表香 味等位基因。(B)擴展單倍型。共延長了 17種單倍型為BADH2 6個一致單體型被每個顯示表型 描述。字母或數字以及顏色所指都和 A圖一樣有(以下是簡略缺失：1x_28,1y_12,1z_48)。間 斷著色表明重組在哪里被發現。第51位，標有星號，代表前面所述的MITE多態位點(10). badh2.1 FNP在第52位用深黃色標記出來，“ + “是指香味起源基因，“一”指野生型 基