1、GMP文件 編號：T/YZK-AF-030-00技術標準/驗證規程分析方法確認方案產品名稱： 夏桑菊顆粒 驗證類型： 確 認 部 門： 質量部 廣明制藥牛黃解毒片分析方法確認報告編號：T-YZK-AP-001-00 目 錄1.概述2.確認目的3.適用范圍4.確認小組成員與職責5.確認方案的起草與審批6.確認內容6.1確認相關文件材料檢查6.2鑒別試驗的確認 6.3含量測定的確認 7.偏差處理8.確認的結果與評價報告9.再驗證周期10.參考文獻 驗證方案簽字表：起草人審核人批準人起草時間審核時間批準時間1.概述夏桑菊顆粒收載于中國藥典2015年版一部，鑒別（1）、鑒別（2）、鑒別（3）、指紋圖譜

2、及迷迭香酸含量測定項下的檢驗方法已改變 ，為確保方法的準確性和可行性，為日常檢測方法提供依據，因此按照2010新版GMP要求，需要進行分析方法確認。方法驗證必須按照驗證方案進行，此次驗證方案包括：專屬性、精密度、線性、范圍、準確度，本確認方案使用薄層色譜法對鑒別檢驗方法進行確認，再使用高效液相色譜儀對含量測定的檢驗方法進行確認，證明此方法在本公司實驗室的適用性。1.1確認方式 按中國藥典2015年版一部修訂版及2010年版藥品GMP指南質量控制實驗室與物料系統分析方法確認要求進行驗證。2.確認目的  建立夏桑菊顆粒鑒別（1）、鑒別（2）、鑒別（3）、指紋圖譜及迷迭香酸含量測定方法的確

3、認方案，在實驗過程中嚴格按照中國藥典2015年版一部操作步驟實行，確保試驗結果真實可信，以確認夏桑菊顆粒按中國藥典2015年版一部測定的方法是否適用于本實驗室。3.適用范圍   適用于本公司的鑒別（1）、鑒別（2）、鑒別（3）、指紋圖譜及迷迭香酸含量測定項下的檢驗方法確認。4. 確認小組成員與職責部門及職務姓名確認工作中職責QC檢驗員執行確認方案；負責驗證過程中相關的檢驗操作，收集整理數據，起草確認報告。QA監督員負責確認全過程的監控。質量保證部負責確認方案及確認報告的審核；審核確認過程中發生偏差的解決方案，以及采取糾正措施。QC主任負責起草確認方案，并組織實施確認工作，及

4、整理確認報告。質量負責人負責確認方案、報告的批準及確認過程中的協調工作5、人員培訓情況序號1234參與人員是否已培訓 是 否是 否是 否是 否培訓情況合格 不合格合格 不合格合格 不合格合格 不合格確認人： 年 月 日復核人： 年 月 日6.確認內容6.1確認相關文件材料檢查6.1.1對照品和樣品：名稱批號 來源 儲存條件 迷迭香酸對照品 蒙花苷對照品夏枯草對照藥材 野菊花對照藥材 桑葉對照藥材 夏桑菊顆粒 確認人確認人： 年 月 日復核人： 年 月 日 6.1.2確認前，對與此次確認相關的文件進行檢查（見下表）文件名稱文件編號是否現行文本檢驗方法驗證（確認）管理規程 M/ZL-QC038-0

5、5 AE240型電子天平標準操作規程W/SOP-ZL-QC10-023-05AE240型電子天平維護保養及清潔標準操作規程W/SOP-ZL-QC11-023-05高效液相色譜儀標準操作規程W/SOP-ZL-QC10-022-05高效液相色譜儀維護保養及清潔標準操作規程W/SOP-ZL-QC11-022-05夏桑菊顆粒檢驗操作規程 W/SOP-ZL-06-C18-02 夏桑菊顆粒質量標準 T/ZLB-06-C18-02 確認確認人： 年 月 日確認人： 年 月 日 6.1.3試劑：無水乙醇 石油醚（30-60） 甲醇 環己烷 乙酸丁酯 異丙醇 甲酸 正己烷 三氯化鋁 乙酸乙酯、均為分析純。6.1

6、.4可接受標準：對照品、試液、試劑與試藥符合驗證要求且在效期內；所有文件都應為現行版本，且經過批準6.2.鑒別（1）的確認：6.2.1 專屬性 6.2.1.1取本品10g，研細，加無水乙醇30ml，超聲處理30分鐘，過濾，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇2ml使溶解，作為供試品溶液。另取夏枯草對照藥材0.5g,加水50ml，煎煮30分鐘，過濾，濾液用石油醚（30-60）振搖提取2次，每次25ml，棄去石油醚液，水層蒸干，殘渣加無水乙醇2ml使溶解，作對照藥材溶液。再取迷迭香酸對照品，加甲醇制成每1ml含0.3mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗，吸取上述三種溶液各2-4l分別點

7、于同一硅膠G薄層板上，以環己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲酸（15：3:3.5:1）為展開劑，展開，取出，晾干，在紫外光（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光主斑點；在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。6.2.1.2空白樣品的制備：稱取未加夏桑菊稠膏的供試品 0.2 g，加無水乙醇30ml，充分振搖溶解，作為空白樣品溶液。同上述普通樣品的制備的方法進行點板、展開劑顯色。 6.2.1.3可接受標準：普通樣品的色譜圖中，主成分的斑點與其它干擾物的斑點均應完全分離，互不干擾；空白樣品的色譜圖中，應無其它干擾物的斑點影響。結果見下表。確認內容 標準要

8、求 檢測結果 結果評價專屬性 被測物的斑點應得到良好分離確認確認人： 年 月 日復核人： 年 月 日6.2.鑒別（2）的確認：6.2.2專屬性 6.2.2.1取野菊花對照藥材1g，加無水乙醇20ml，超聲處理30分鐘，過濾，濾液濃縮至2ml，作為對照藥材溶液。另取蒙花苷對照品，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法操作規程試驗，吸取（鑒別1）項下的供試品溶液及上述兩種溶液各5ul，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸丁酯-甲酸-水（5:3:3:)5以下放置過夜的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%三氯化鋁乙醇溶液，揮干，在紫外光（365nm）下檢視。供試品色譜

9、中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光主斑點；在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。6.2.2.2空白樣品的制備：稱取未加夏桑菊稠膏的供試品約0.2g，加無水乙醇30ml，充分振搖溶解，作為空白樣品溶液。同上述普通樣品的制備的方法進行點板、展開劑顯色。 6.2.2.3可接受標準：普通樣品的色譜圖中，主成分的斑點與其它干擾物的斑點均應完全分離，互不干擾；空白樣品的色譜圖中，應無其它干擾物的斑點影響。結果見下表。確認內容 標準要求 檢測結果 結果評價專屬性 被測物的斑點應得到良好分離確認確認人： 年 月 日復核人： 年 月 日6.2.鑒別（3）的確認：6.2.3專屬性 6.

10、2.3.1取桑葉對照藥材1g，加水100ml，煎煮1小時，濾過，濾液蒸至近干，殘渣加無水乙醇10ml，超聲處理10分鐘，濾過濾液濃縮至2ml，作為對照藥材溶液。照薄層色譜法操作規程試驗，吸取（鑒別1）項下的供試品溶液及上述兩種溶液各2ul，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯-甲酸（12:8:1:)為展開劑，在相對濕度60以下展開，取出，晾干，放置30分鐘，在紫外光（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光主斑點。 6.2.3.2空白樣品的制備：稱取未加夏桑菊稠膏的供試品 約 0.2 g，加無水乙醇30ml，充分振搖溶解，作為空白樣品溶液。同上

11、述普通樣品的制備的方法進行點板、展開劑顯色。 6.2.3.3可接受標準：普通樣品的色譜圖中，主成分的斑點與其它干擾物的斑點均應完全分離，互不干擾；空白樣品的色譜圖中，應無其它干擾物的斑點影響。結果見下表。確認內容 標準要求 檢測結果 結果評價專屬性 被測物的斑點應得到良好分離確認確認人： 年 月 日復核人： 年 月 日6.3.指紋圖譜 照高效液相色譜法操作規程測定。6.3.1色譜條件與系統適用性試驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動相A，以1%醋酸溶液為流動相B，按下表中的規定進行梯度洗脫；流速為每分鐘0.9ml；柱溫為35；檢測波長為320nm。理論板數按迷迭香酸峰計算應不低于2

12、0 000。 時間（分鐘） 流動相A（%）流動相B（%） 050 833 9267 5051 338 6792 5160 8 92 6.3.2參照物溶液的配制 取綠原酸對照品，迷迭香酸對照品和蒙花苷對照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成每1ml含綠原酸25ug迷迭香酸15ug和蒙花苷25ug的溶液，即得。6.3.3測定法 分別精密吸取參照物溶液和（含量測定）項下的供試品溶液各10ul，注入液相色譜儀，測定，記錄60分鐘色譜圖，即得。6.3.4.結果判斷：供試品指紋圖譜中，應分別呈現與參照物色譜保留時間相應的色譜峰。按中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統計算560分鐘的色譜峰，供試品指紋圖譜與對照指紋圖

13、譜的相似度不得低于0.90。結果見下表檢測項目標準要求測試結果結果評價備注指紋圖譜的相似度相似度應大于0.90附圖譜圖確認確認人： 年 月 日復核人： 年 月 日6.4含量測定（迷迭香酸）6.4.1回收率試驗1）色譜條件：色譜柱：C18柱；以乙腈：1%醋酸(19：:81)為流動相；檢測波長為329nm。理論板數按迷迭香酸峰計算應不低于5000。2）對照品溶液的制備：取迷迭香酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含25ul的溶液，即得。3）供試品溶液的制備：取同一批已知含量的供試品，研細，共稱取6份，每份稱取樣量為規定取樣量的約50%（約0.62）g，精密稱定，置具塞錐形瓶中。再分別精密加入

14、迷迭香酸對照品約3.0mg（直接加入），精密加入75%甲醇25ml，超聲處理（功率500W，頻率40kHz）30分鐘，放冷，再稱定重量，用75%甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，取續濾液，即得。4）測定法：分別吸取對照品溶液和供試品溶液各20ul,注入液相色譜儀，測定。試驗結果見下表：5）可接受標準：將實測值與理論值比較，計算回收率。要求：各濃度下的平均回收率均為98.0%102.0%，6個回收率數據的相對標準差（RSD）應2.0。回收率 =檢出率 樣品含量×100%對照品取樣量迷迭香酸回收率試驗結果編號取樣量（g）樣品含量（mg）對照品加入量（mg）檢出率（mg）回收率（%）平均回收

15、率（%） RSD（%）123456結果評價 確認確認人： 年 月 日復核人： 年 月 日6.4.2.重復性1）供試品的制備：取100%處方量的供試品取約1.25g，精密稱定，置具塞錐形瓶中。精密加入75%甲醇25ml，超聲處理（功率500W，頻率40kHz）30分鐘，放冷，再稱定重量，用75%甲醇補足減失的重量，搖勻，過濾，取續濾液，即得。2）測定法：吸取供試品溶液10ul,注入液相色譜儀，按上述色譜條件中連續進樣6次，測定其峰面積，計算其相對標準偏差。試驗結果見下表。3）可接受標準：采用6次的測定結果進行評價，其相對標準偏差應不大于2.0%. 序號主份名峰面積平均值RSD%123456 迷迭

16、香酸 綜合評價 確認確認人： 年 月 日復核人： 年 月 日6.4.3.穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液，分別于0、1、3、7、13小時進樣，按上述色譜條件測定。結果見下表 附圖： 放置時間 迷迭香酸對照品平均峰面積RSD（%）0小時1小時3小時7小時13小時 結果評價 確認確認人： 年 月 日復核人： 年 月 日6.4.4專屬性1）普通樣品的制備：取重復性項下處理得的樣品作為的供試品溶液。2）空白樣品的制備：稱取未加迷迭香酸的供試品約1g，按上述供試品的制備方法進行處理樣品。3）測定法：按上述色譜條件進行測定，吸取普通樣品和空白樣品各20ul,各進樣1次，注入液相色譜儀中，進行測定。試驗結

17、果見下表。4）可接受標準：色譜圖中，各主份應分離良好，空白樣品無干擾。檢測項目標準要求測試結果結果評價備注專屬性色譜峰應分離良好，無干擾附圖譜圖確認確認人： 年 月 日復核人： 年 月 日6.4.5線性關系考察 分別精密量取迷迭香酸對照品 mg/ml甲醇溶液（1、2、3、4、5、6mL），分別加入75%甲醇制備成濃度為 、 、 、 、 、 ug/mL的對照品溶液。各精密吸取10uL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測定峰面積。以迷迭香酸對照品的濃度（ug/mL）為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。可接受標準：相關系數R 應大于0.999。結果見下表 附標準曲線表。 濃度（ug/mL）C峰面積A回歸方程為A相關系數R結果評價 確認確認人： 年 月 日復核人： 年 月 日 7.偏差處理確認過程中應嚴格按照本確認